Name: Características de los formados Precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por Peso molecular de los reactivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprende a formar microgeles de polietilenglicol mediante fotopolimerización por precipitación. Este método permite controlar el diámetro y la capacidad de hinchamiento ajustando el peso molecular del PEG, con aplicaciones en liberación de fármacos e ingeniería de tejidos.

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El financiamiento de este proyecto se realizó a través de NSF CBET Award 1061834. Los autores desean agradecer a CIBA por una muestra de fotoiniciador.

1. Preparando soluciones para su uso en la fabricación de microgeles
<ol>
	<li>Antes de comenzar la reacción de precipitación, prepare las soluciones necesarias y caliéntelas a 37 °C. Las soluciones requeridas incluyen fotoiniciador al 0,5%, 1,5 M Na2SO4, solución tampón, 200 mg/ml de solución de diacrilato de PE (PEG-DA) y 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Nota: Acrilato todos los precursores de PEG de acuerdo con los métodos publicados y almacenar a -20 °C bajo argón hasta su uso12.</li>
	<li>Pese el fotoiniciador y disuélvalo en H2O desionizado (DI) para obtener una solución al 0,5 (p/v)%. Es importante proteger la solución de la exposición a la luz ultravioleta.
	<ol>
		<li>Después de la disolución completa, filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Esta solución puede prepararse con antelación y almacenarse a 4 °C en la oscuridad. Nota: Disminuya el tiempo de agitación a aproximadamente 1 hora calentando la solución a 40 °C mientras agita.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para 1x PBS, agregue 1 tableta de PBS a 1 L DIH 2O y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. El PBS puede elaborarse con antelación y almacenarse a 4 °C.</li>
	<li>Mida 39,4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH=7,4) y agregue 612 μl de trietanolamina (TEOA) y 260 μl de ácido clorhídrico (HCl) 6 M. Nota: TEOA es muy viscoso; precaliente TEOA a 37 °C antes del pipeteo.
	<ol>
		<li>Ajuste el pH del tampón para que sea aproximadamente 7,7 y filtre a través de un filtro de 0,22 μm (pH final ~7,8). La solución tampón puede ampliarse, prepararse con antelación y almacenarse a 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prepare la solución de PEG-DA antes de comenzar la reacción cada vez; se ha observado una disminución de la reactividad si se almacena la solución. Pese el PEG-DA y agregue el tampón PBS/TEOA/HCl hasta la concentración final de 200 mg/ml. Nota: Agregue el tampón lentamente para controlar cuidadosamente la concentración de PEG porque el PEG se hincha en la solución. 
	Nota: Esta solución es altamente personalizable. Las opciones para personalizar los microgeles incluyen: cambiar el peso molecular inicial del PEG para alterar las propiedades del microgel, usar un precursor de PEG degradable para fabricar microgeles degradables, filtrar estérilmente todas las soluciones para microgeles biológicamente estériles, completar el proceso de formación en una campana de flujo laminar y, finalmente, agregar grupos funcionales a la superficie incorporándolos en la solución de PEG.</li>
	<li>Pesar Na2SO4 y disolver en DI H2O para obtener una solución de 1,5 M. Para obtener los mejores resultados, la solución de sulfato de sodio también debe prepararse justo antes de comenzar la reacción.
	<ol>
		<li>Calentar y vorexar la solución hasta que Na2SO4 se disuelva por completo. Filtre a través de un filtro de 0,22 μm según sea necesario.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Fabricación de microgel
<ol>
	<li>Coloque 127,5 μl de tampón PBS/TEOA/HCl, 10 μl de fotoiniciador al 0,5% y 25 μl de solución de PEG de 200 mg/ml en los tubos donde se formarán los microgeles; normalmente tubos de microcentrífuga de 2 ml.
	<ol>
		<li>Calentar estos tubos junto con la solución 1,5 M Na2SO4 a 37 °C.</li>
		<li>Mezcle los tubos mientras calienta. Nota: Este protocolo de microgel se puede ampliar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para encapsular las moléculas en los microgeles, añada la molécula deseada (por ejemplo, ovoalbúmina) al tampón PBS/TEOA/HCl, al fotoiniciador y a la solución de PEG. Después de la reticulación, la molécula quedará atrapada en la red de microgel.</li>
	<li>Complete cada reacción de microgel una a la vez. Tome el primer tubo y agregue 87,5 μl de 1,5 M Na2SO4.</li>
	<li>Mezcle el tubo pipeteando 3-5 veces; alternativamente, espere 30 segundos. Después de mezclar, la concentración de sal se distribuirá uniformemente y la solución debe ser clara.</li>
	<li>Coloque el tubo bajo la luz ultravioleta y la reticulación durante 30 segundos. Después de la reticulación, debe haber una capa turbia en la parte superior de la solución, esta capa contiene los microgeles. Consulte la Figura 1 para ver el esquema de reacción.</li>
	<li>Agregue 750 μl de PBS para formar un pellet al centrifugar y mezcle bien.</li>
	<li>Lavar los microgeles 5 veces centrifugando durante 2 min a 4.000 x g para formar un pellet e intercambiando el sobrenadante por PBS. Nota: No moleste el gránulo de microgel mientras se intercambia el tampón, es posible que no sea posible eliminar todo el sobrenadante.</li>
</ol>
3. Tamaño del microgel y polidispersidad
<ol>
	<li>Pipeta 30 μl de microgeles a partir del pellet formado por centrifugación en 1 ml de DI H2O. Para obtener los mejores resultados, sonique la solución de microgel en un sonicador de baño de agua durante 1 hora (50-60 Hz y 1,4 A) o mezcle vigorosamente para suspender los microgeles.</li>
	<li>Pipetee 15 μl de la solución de microgel en un portaobjetos de vidrio limpio y coloque el cubreobjetos #1.5 encima. Voltee el portaobjetos y la cubierta sobre un pañuelo de laboratorio y empuje el portaobjetos hacia abajo para eliminar el exceso de solución y asegurarse de que los microgeles estén en una sola capa.</li>
	<li>Capture varias imágenes de los microgeles con un objetivo de aceite DIC 100X. Por lo general, se toman 5 imágenes por muestra y se recomiendan 3 muestras por lote para un total de 15 imágenes. Nota: hasta la fecha no se ha observado ninguna variación de lote a lote.</li>
	<li>Mida los microgeles para obtener un diámetro representativo.</li>
	<li>Calcule el PDI utilizando la siguiente ecuación basada en el volumen, en la que N es el número total de microgeles y Vi es el volumen de microgel i.</li>
</ol>
4. Densidad del microgel
<ol>
	<li>Prepare soluciones de dextrano 7, 6, 5, 4, 3 y 1 (p/v)% en DI H2O para determinar la densidad del microgel. Estas densidades se calcularon en 1,022, 1,020, 1,018, 1,016, 1,014 y 1,010 g/cm3, respectivamente.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución de dextrano al 7% a un tubo de centrífuga de 15 ml.
	<ol>
		<li>Pipetear lentamente 1 ml de solución de dextrano al 6% para formar una capa distinta sobre el dextrano al 7%.</li>
		<li>Espere 5 minutos y luego agregue 1 ml de la solución al 5%.</li>
		<li>Continúe hasta que todas las soluciones de dextrano estén colocadas en capas en orden decreciente de concentración de dextrano.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque cuidadosamente los microgeles sobre la solución de dextrano al 1%.</li>
	<li>Centrifugar el gradiente durante 10 min a 4.000 x g y 5 °C. La posición del microgel después de la centrifugación permitió un cálculo sencillo de la densidad13.</li>
</ol>
5. Hinchazón de equilibrio de microgel
<ol>
	<li>Para medir la masa hinchada (Ms) de los microgeles, definida como la masa después del hinchamiento de equilibrio (48 horas), primero lave los microgeles 5 veces en DI H2O e hinche durante un mínimo de 48 horas en tubos de microcentrífuga prepesados.</li>
	<li>Centrifugar los microgeles durante 10 min a 4.000 x g.</li>
	<li>Retire todo el sobrenadante y registre la masa húmeda. Utilice métodos de filtrado para asegurarse de que se elimine todo el exceso de agua para obtener resultados más precisos.</li>
	<li>Congelar los microgeles a -80 °C y luego liofilizarlos a masa constante para obtener la masa seca (Md).</li>
	<li>Calcule el contenido de agua en los microgeles por % de agua = (Ms - Md) / Md x 100.</li>
	<li>Determine el contenido de polímero por % de polímero = 100 - % de agua.</li>
	<li>Realice análisis estadísticos de todos los datos utilizando SAS con ANOVA de n vías y prueba post-hoc de Tukey. Las diferencias se observan cuando p<0.05.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Se examinaron las propiedades físicas de los microgeles PEG para detectar cambios en las condiciones de polimerización. Para esta reacción de precipitación, se mezclaron una solución tampón, una solución de diacrilato PEG al 20% (p/v) (MW 3.000, 4.600 o 6.000 Da) y un fotoiniciador y se calentaron a 37 °C. La adición de 1,5 M Na2SO4, una sal kosmotrófica que aumenta las interacciones entre las moléculas de agua, hizo que el PEG precipitara momentáneamente tras su adición. Este efecto es más prominen...

Por definición, los microgeles son hidrogeles de cualquier forma con un diámetro equivalente de aproximadamente 0,1-100 μm1. Debido a su tamaño y características, los microgeles poliméricos presentan una herramienta versátil para avanzar en la administración de fármacos y los sistemas de ingeniería de tejidos. Si bien los hidrogeles a granel se utilizan ampliamente como andamios de ingeniería de tejidos y vehículos de administración de fármacos con gran éxito2-4, un cambio reciente hacia el control a microescala de andamios ofrece una oportunidad única para que los microgeles se utilicen como materiales base para la construcción de andamios. Además, los microgeles tienen una alta relación entre superficie y volumen para las interacciones celulares y, en solución, tienen una baja viscosidad que los hace ideales para inyecciones. Finalmente, los microgeles se pueden formar utilizando numerosos polímeros mediante una variedad de métodos que dependen de las características deseadas del microgel, lo que los hace altamente personalizables para una variedad de aplicaciones.
Las técnicas para producir microgeles incluyen polimerizaciones en suspensión, emulsión, dispersión o precipitación. Las polimerizaciones en emulsión y suspensión suelen requerir disolventes orgánicos y tensioactivos o estabilizadores para formar los microgeles. La naturaleza de estos métodos produce una distribución de tamaño de partícula altamente dispersa5. Las reacciones de dispersión y precipitación hacen que las partículas tengan una polidispersidad6 más baja; Sin embargo, las partículas formadas por polimerización por dispersión aún requieren el uso de agentes estabilizadores6. Los microgeles formados por reacciones de precipitación son únicos en el sentido de que forman partículas de tamaño y forma uniformes sin el uso de estabilizadores o tensioactivos. La formación de microgel se logra cuando las cadenas poliméricas crecen en una fase separada de la fase continua por precipitación entálpica o entrópica7. La polimerización por precipitación se realiza a menudo a altas temperaturas que pueden reducirse mediante el uso de sales kosmótrofas, que disminuyen la solubilidad del polímero en el disolvente8. Este trabajo se centra en microgeles formados a partir de poli(etilenglicol) (PEG) mediante una reacción de precipitación fotopolimerizada en condiciones biológicamente compatibles, con variaciones para alterar las propiedades del microgel y encapsular moléculas para aplicaciones de administración de fármacos.
Estudios previos con hidrogeles PEG muestran que las condiciones de polimerización influyen en gran medida en las propiedades físicas y mecánicas de los hidrogeles, a saber, el contenido de agua del hidrogel y el módulo de compresión3,9. Estos materiales reticulados son de interés porque la relación entre las propiedades estructurales y físicas descritas por Flory10 se puede utilizar para adaptar el hidrogel reticulado para aplicaciones específicas. Estos principios son similares para los microgeles. Se ha descubierto que los microgeles PEG formados por precipitación tienen potencial para la medicina regenerativa11, sin embargo, se necesita más investigación sobre las propiedades del microgel para mejorar su repertorio para futuras aplicaciones biomédicas. Este informe describe el procedimiento para fabricar microgeles por reacción de precipitación y alterar las características, como el diámetro de las micropartículas, el índice de polidispersidad (PDI), la densidad y el hinchamiento, que serían importantes para desarrollar aún más estos materiales para la administración de fármacos o la medicina regenerativa.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>MP Biomedical</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>trietanolamina (TEOA)</td><td>J.T. Baker</td><td>9468-01</td><td>Precalentar a 37 &deg; C antes del pipeteo</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>BDH Aristar BDH3028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td><td>J.T. Baker</td><td>3891-01</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba</td><td>029891301PS04</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbúmina (OVA)</td><td>Invitrogen</td><td>34782</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1.500</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16241</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3.000</td><td>Fluka</td><td>03997-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4.000</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16151</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4.600</td><td>Sigma</td><td>373001-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG 6.000</td><td>Fluka</td><td>03394-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PEG 10.000</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>TCI</td><td>D1449</td><td></td></tr></tbody></table>

características de los formados precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por peso molecular de los reactivos

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

Este trabajo describe la formación de microgeles de poli(etilenglicol) (PEG) a través de una reacción de precipitación fotopolimerizada. Las reacciones de precipitación ofrecen varias ventajas sobre las técnicas tradicionales de fabricación de microesferas. A diferencia de las técnicas de emulsión, suspensión y dispersión, los microgeles formados por precipitación tienen una forma y un tamaño uniformes, es decir, un índice de polidispersidad bajo, sin el uso de disolventes orgánicos o estabilizadores. Las condiciones suaves de la reacción de precipitación, las propiedades personalizables de los microgeles y la baja viscosidad de las inyecciones los hacen aplicables para fines in vivo. A diferencia de otras técnicas de fabricación, las características del microgel se pueden modificar cambiando el peso molecular del polímero de partida. Al aumentar el peso molecular del PEG inicial, aumentó el diámetro del microgel y la proporción de hinchazón. Se sugieren otras modificaciones, como la encapsulación de moléculas durante la reticulación de microgeles. Se exploran adaptaciones simples a los bloques de construcción de microgel PEG para futuras aplicaciones de microgeles como vehículos de administración de fármacos y andamios de ingeniería de tejidos.

El tamaño del microgel depende de las condiciones de polimerización. Figura 2A ilustra cómo el diámetro del microgel aumenta con el peso molecular inicial del PEG y con el tiempo de reticulación. En las Figuras 2C-G se muestran imágenes representativas de microgeles utilizados para la medición de tamaño, con distintos pesos moleculares y reticulados durante 30 segundos. Para el PEG con un peso molecular de 3.000 Da, el diámetro promedio del microgel aumentó de 1,65±0,26 a 2,20±0,54 μm al...

Este trabajo describe la formación de microgeles de poli(etilenglicol) (PEG) a través de una reacción de precipitación fotopolimerizada. El aumento del peso molecular del PEG aumentó el diámetro del microgel y la relación de hinchamiento. Se exploran adaptaciones simples a la reacción de precipitación de microgel PEG para futuras aplicaciones de microgeles como vehículos de administración de fármacos y andamios de ingeniería de tejidos.

Características de los formados Precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por Peso molecular de los reactivos

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

El objetivo general de este procedimiento es formar microgeles de polietilenglicol mediante una reacción de precipitación fotopolimerizada para utilizarlos como vehículos de administración de fármacos y andamios para ingeniería de tejidos. Esto se logra primero preparando los reactivos, incluyendo un iniciador fotográfico, tampones, trietilamina y solución de PEG DL, y calentándolos a 37 grados Celsius. El segundo paso consiste en colocar los reactivos en un tubo microcéntrífugo y mezclarlos mediante vortex, manteniendo una temperatura de 37 grados Celsius. A continuación, se mezcla sulfato de sodio y la solución se coloca bajo luz ultravioleta para entrecruzar durante 30 segundos. Tras el entrecruzamiento, se formará una capa turbia en la parte superior de la solución que contiene los microgeles. El último paso consiste en añadir PBS a la mezcla y centrifugar para formar un precipitado.Finalmente, se utiliza microscopía y dispersión dinámica de luz para medir el tamaño de los microgeles, y la densidad se mide mediante un gradiente de densidad de dextrina. Además, la cantidad de hinchamiento se calcula midiendo los pesos húmedo y seco de los microgeles. La principal ventaja de esta

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Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D

Aprende a formar microgeles de polietilenglicol mediante fotopolimerización por precipitación. Este método permite controlar el diámetro y la capacidad de hinchamiento ajustando el peso molecular del PEG, con aplicaciones en liberación de fármacos e ingeniería de tejidos.

Características de los formados Precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por Peso molecular de los reactivos

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