Características de los formados Precipitación microgeles polietilenglicol son controlados por Peso molecular de los reactivos

El objetivo general de este procedimiento es formar microgeles de polietilenglicol mediante una reacción de precipitación fotopolimerizada para utilizarlos como vehículos de administración de fármacos y andamios para ingeniería de tejidos. Esto se logra primero preparando los reactivos, incluyendo un iniciador fotográfico, tampones, trietilamina y solución de PEG DL, y calentándolos a 37 grados Celsius. El segundo paso consiste en colocar los reactivos en un tubo microcéntrífugo y mezclarlos mediante vortex, manteniendo una temperatura de 37 grados Celsius.

A continuación, se mezcla sulfato de sodio y la solución se coloca bajo luz ultravioleta para entrecruzar durante 30 segundos. Tras el entrecruzamiento, se formará una capa turbia en la parte superior de la solución que contiene los microgeles. El último paso consiste en añadir PBS a la mezcla y centrifugar para formar un precipitado.

Finalmente, se utiliza microscopía y dispersión dinámica de luz para medir el tamaño de los microgeles, y la densidad se mide mediante un gradiente de densidad de dextrina. Además, la cantidad de hinchamiento se calcula midiendo los pesos húmedo y seco de los microgeles. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como las técnicas de emulsión, suspensión y dispersión, es que los microgeles formados por reacción de precipitación presentan un índice de politispersidad bajo sin el uso de disolventes orgánicos ni estabilizantes; asimismo, las condiciones suaves de la reacción de precipitación, las propiedades personalizables de los microgeles y su baja viscosidad para inyecciones los hacen adecuados para aplicaciones en NVivo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa, como la fabricación de andamios con tamaño uniforme y bajo índice de polidispersidad. Las implicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia la terapia de administración de fármacos porque los factores de crecimiento en los medicamentos pueden encapsularse fácilmente. Para comenzar, pese 500 miligramos del iniciador fotoquímico y añádalos a 100 mililitros de agua desionizada para preparar una solución al 0,5%.

Proteja la solución de la luz UV y caliéntela a 40 grados Celsius mientras agita constantemente durante aproximadamente una hora para disolver completamente el iniciador fotográfico. Tras la disolución completa, filtre estérilmente la solución haciéndola pasar a través de un filtro de 0,22 micrones y guárdela a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta su uso. A continuación, precaliente la trietilamina a 37 grados Celsius para reducir su viscosidad.

Luego, agregue 612 microlitros de este junto con 260 microlitros de ácido clorhídrico seis molar a 39,4 mililitros de PBS y ajuste el pH a 7,8 estéril. Filtre la solución final a través de un filtro de 0,22 micrones y almacénela a 37 grados Celsius hasta que sea necesaria. Siguiendo el trabajo realizado por Sony en todas las acro lte, prepare los precursores de PEG según los métodos publicados y almacene el producto terminado a menos 20 grados Celsius bajo Argonne; luego, inmediatamente antes del uso, prepare un mililitro de una solución de diacrilato de Peg a 200 miligramos por mililitro agregando lentamente 0,8 mililitros de PBS con trietanolamina y ácido clorhídrico a 200 miligramos de diacrilato de peg.

Además, justo antes del experimento, pese 213 miligramos de sulfato de sodio y disuélvalos en un mililitro de agua desionizada. Para preparar una solución 1,5 molar, caliente la solución a 37 grados Celsius durante 20 minutos y luego agite en vórtex hasta que se disuelva completamente. Una vez disuelta, filtre tanto la solución final de sulfato de sodio como la solución de PEG diacrilato a 37 grados Celsius a través de filtros de 0,22 micrones.

Combine 127,5 microlitros de PBS con trietilamina y ácido clorhídrico, 10 microlitros del iniciador de foto del 0,5 % y 25 microlitros de la solución de 200 miligramos por mililitro de Peg diacrilato en un tubo microcentrífugo de 1,6 mililitros. Luego agregue cualquier molécula deseada para encapsulación.

Caliente estos tubos junto con la solución de sulfato de sodio 1,5 molar a 37 grados Celsius. Luego, agregue 87,5 microlitros de la solución precalentada de sulfato de sodio 1,5 molar al primer tubo de la solución de PEG y mezcle el tubo pipeteando la solución de tres a cinco veces. Después de mezclar, la concentración de sal se distribuirá uniformemente y la solución deberá volverse transparente.

Coloque el tubo bajo la luz UV y haga la reticulación durante 30 segundos tras la reticulación. Debe observarse una capa turbia en la parte superior de la solución que contiene los microgeles. A continuación, agregue 750 microlitros de PBS al tubo y mezcle bien la solución mediante vortex.

Luego, centrifugue la mezcla a 4.000 × g durante dos minutos para formar un precipitado. Una vez formado el precipitado, retire el SUP natin teniendo cuidado de no perturbar el precipitado y suspenda los microgeles en PBS fresco. Lave los microgeles un total de cinco veces con PBS fresco, centrifugándolos entre cada lavado.

Después del lavado final, retire el sobrenadante y pipetee 30 microlitros de microgeles del sedimento en un mililitro de agua desionizada. A continuación, someta la solución de microgeles a sonicación en un baño ultrasónico durante una hora a una frecuencia de 50 a 60 hercios y una potencia de 1,4 amperios. Luego, pipetee 15 microlitros de la solución de microgeles sobre un portaobjetos limpio grabado con ácido y coloque encima un cubreobjetos número 1,5 grabado con ácido.

Dar la portaobjetos vuelta sobre un tejido de laboratorio y presionar suavemente sobre este para eliminar la solución excesiva y asegurar que los microgeles queden en una sola capa. Luego, utilizando un microscopio óptico, capturar varias imágenes de los microgeles empleando un objetivo de inmersión en aceite DIC de 100x. Medir los microgeles para obtener un diámetro representativo.

Calcule el índice de polidispersidad utilizando la ecuación basada en volumen que se muestra aquí, en la cual N es el número total de microgeles y VI es el volumen del microgel. Para medir la densidad promedio del microgel, primero prepare soluciones de dextrina al 7, 6, 5, 4, 3 y 1 % en agua desionizada; las densidades de las soluciones de dextrina se muestran aquí. A continuación, agregue dos mililitros de la solución de dextrina al 7 % a un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, pipetee lentamente dos mililitros de la solución de dextrina al 6 % para formar una capa distinta sobre la dextrina al 7 %. Después de cinco minutos, agregue dos mililitros de la siguiente capa, que consiste en dextrina al 5 %, y continúe de esta manera hasta que cada concentración de dextrina se haya estratificado en orden decreciente de concentración de dextrina. Luego, estratifique cuidadosamente los microgeles sobre la solución de dextrina al 1 %, y centrifugue el gradiente a cinco grados Celsius a 4 000 veces la gravedad durante 10 minutos.

Luego, visualice la ubicación de los microgeles y calcule la densidad de los microgeles según su posición entre las capas. Para medir la masa hinchada de los microgeles, primero pese un tubo de microcentrífuga y luego agregue un mililitro de los microgeles. Lave los microgeles cinco veces con agua desionizada, intercalando cada lavado.

Centrifugue la muestra durante 10 minutos a 4.000 ×g para obtener el sedimento de los microgeles después del último lavado. Resuspenda los microgeles en agua desionizada y déjelos hinchar durante un mínimo de 48 horas. Después de 48 horas, centrifugue los microgeles hinchados durante 10 minutos a 4.000 ×g y luego retire todo el sobrenadante.

Luego pese la muestra y registre la masa húmeda. Después de obtener un peso húmedo preciso, congele los microgeles a menos 80 grados Celsius y luego liofilícelos para eliminar el agua y obtener la masa seca. Una vez que todo el agua se haya sublimado, calcule el contenido de agua y de polímero en los microgeles utilizando las ecuaciones mostradas aquí, donde MS es el peso húmedo de los microgeles y MD es el peso seco.

Se muestra aquí el diámetro promedio de los microgeles de PEG formados utilizando diferentes pesos moleculares de PEG al 20%. Aumentar el tiempo de exposición a la luz UV también tuvo un efecto sobre el diámetro de los microgeles. A medida que aumentó el tiempo de exposición a la luz UV, también aumentaron los diámetros de las tres formulaciones mostradas aquí.

La densidad medida mediante gradientes de dextrina disminuyó con el aumento del peso molecular de las moléculas precursoras de PEG. Esto también se confirma en la gráfica del porcentaje de contenido de agua, donde se encontró que el PEG de mayor peso molecular tenía una mayor cantidad de agua por gramo de polímero. Finalmente, para demostrar que los microgeles podían cargarse con proteínas marcadas fluorescentemente, se añadió albúmina a la mezcla antes de la polimerización, quedando atrapada dentro de las esferas.

Concentraciones crecientes de la proteína marcada con fluorescencia aumentaron el índice de polidispersidad de las esferas, pero el tamaño promedio permaneció constante. Al intentar este procedimiento, es importante recordar calentar todas las soluciones a 37 grados Celsius y vortexear y microgirar bien los geles para romper cualquier agregado durante el lavado y la preparación de las láminas para la obtención de imágenes. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales para la encapsulación de fármacos con el fin de responder preguntas adicionales sobre el efecto de la liberación del fármaco.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear microgeles de peg DA en condiciones suaves mediante reacciones de precipitación.