Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos
30 de enero de 2014
Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).
El objetivo general de este procedimiento es aislar microglía cortical de neonatos murinos. Esto se logra primero mediante la microdisección del tejido cerebral cortical de neonatos murinos. El segundo paso consiste en cultivar cultivos mixtos de células gliales durante 17 a 21 días in vitro.
A continuación, los microglías se aíslan a partir de estos cultivos mixtos de células gliales. El paso final consiste en sembrar las células microgliales en placas de cultivo celular para experimentos posteriores. En última instancia, se utiliza microscopía de inmunofluorescencia y ELISA para demostrar que este protocolo de aislamiento preserva el fenotipo inmuno del microglía y su funcionalidad.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos implicados en la microdisección son difíciles de realizar. La ejecución exitosa de este procedimiento requiere rapidez y precisión. El hecho de ser demasiado lento reducirá el rendimiento celular, mientras que la eliminación incompleta de las meninges contaminará el cultivo de células gliales e impedirá su crecimiento.
Comience preparando el medio completo para microglía, denominado aquí en adelante MCM. Prepare un matraz por cría e incúbelos durante al menos una hora. Este paso de equilibración es esencial para el éxito.
A continuación, prepare alícuotas y enfríe en hielo. Aliquote todos los medios necesarios, seis mililitros de MCM por cada cría, y caliente en un baño de agua a 37 °C antes de la disección. Limpie la cabina de flujo laminar y el microscopio de disección con etanol al 70 %.
A continuación, coloque las herramientas quirúrgicas esterilizadas necesarias para el procedimiento en el área de trabajo. Prepare un recipiente estéril con medio de disección para capturar la cabeza y otro para la disección. Dispense el medio de picado en un recipiente aparte para picar el tejido cerebral.
Tras la decapitación y la extracción del cerebro, coloque el cerebro recién aislado bajo un microscopio de disección para visualizar las cortezas, asegurándose de mantener el lado dorsal hacia arriba y seco. Sujete el cerebro insertando las puntas de la pinza en la intersección entre el mesencéfalo y la corteza. Una vez colocado, retire completamente las meninges corticales dorsales.
A continuación, elimine las meninges ventrales para maximizar la pureza y el rendimiento de microglía. Es esencial eliminar por completo todo el tejido meníngeo. Separe las cortezas del resto del cerebro.
Asegúrese de eliminar cualquier meninge cortical residual que pueda estar presente en el lado ventral o medial de los córtices. Una vez eliminado el tejido meníngeo, coloque los córtices en el recipiente para picar preparado anteriormente. Trabajando en una cabina de seguridad biológica de clase dos, use tijeras para picar el tejido cerebral.
Transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 15 milímetros. Enjuague tanto las tijeras como el recipiente de picado con un mililitro de medio de picado cada uno para maximizar los rendimientos. Recopile y vierta estos enjuagues en el tubo cónico de 15 mililitros que contiene el tejido picado.
Deje reposar la suspensión de tejido sin perturbar durante uno o dos minutos, permitiendo que el tejido picado se sedimente en el fondo del tubo. Después de este tiempo, retire cuidadosamente y deseche dos mililitros del sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el tejido picado sedimentado. Añada tres mililitros del MCM previamente calentado al tejido picado y luego triture el tejido con fuerza.
No debería quedar ningún tejido sólido discernible cuando se complete el triaje. Añada otros tres mililitros de MCM utilizando la misma punta de pipeta para recoger la muestra triturada residual de la punta. Una vez recogida, centrifugue el tejido picado para hacer un pellet de las células.
Cuando finalice, devuelva las células en pellet a la cabina de seguridad biológica. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Re_suspenda suavemente.
Suspenda el sedimento celular con dos mililitros de MCM tibio y luego agregue la suspensión de células resuspendidas al frasco preparado anteriormente. Incube las células durante 24 horas. Después de 24 horas, golpee suavemente el frasco contra la palma de la mano para desagregar los restos de tejido.
Revise las células antes y después de golpear suavemente para asegurarse de que los restos celulares se hayan eliminado por completo. A continuación, sustituya el medio por MCM fresco y devuelva el matraz al incubador. Revise las células diariamente para monitorear el crecimiento y la contaminación.
Después de aproximadamente 17 a 21 días, las células microgliales estarán listas para su recolección; para determinar si las células están listas, examínelas bajo un microscopio invertido de contraste de fases. Las microglías están listas para su recolección cuando hayan alcanzado aproximadamente un 40 % de confluencia; aparecen como células esféricas pequeñas y brillantes que crecen en monocapa sobre otras.
Para aislar, golpee vigorosamente el matraz contra la superficie del banco de laboratorio. Esta agitación ayuda a separar los microglías de otras células gliales debido a las propiedades de baja adherencia de los microglías. Selle las tapas del matraz con parafina y rote los cultivos mixtos de células gliales utilizando un agitador rotatorio controlado por temperatura, no humectado, durante cinco horas.
Después de este tiempo, inspeccione visualmente que las microglías se hayan desprendido de la superficie del matraz. Mediante un microscopio invertido de contraste de fases, las microglías son células esféricas brillantes y libres en suspensión. Quedará una capa residual de astrocitos y oligodendrocitos adheridos al fondo del matraz.
A continuación, recolecte el sobrenadante que contiene las microglías en un tubo cónico de centrífuga estéril y paladar. Resuspenda el sedimento de microglías en medio de crecimiento tibio para microglías y determine la concentración celular utilizando una placa de hemocitómetro. Las células en un formato de placa de 24 pocillos sobre cubreobjetos de plástico o vidrio estéril 24 horas después.
Sustituya el medio por MGM tibio fresco para eliminar las células flotantes y los restos celulares. Este paso es fundamental para la supervivencia celular y para mantener microglías en estado de quiescencia; las células microgliales están listas para experimentación inmediatamente después de este paso de reposición del medio, con el fin de evaluar la pureza microglial. Los cultivos celulares derivados de microglías que expresan endógenamente GFP se tiñeron para el antígeno de macrófago IBA1 y se contratiñeron con DAPI.
Con el fin de visualizar el núcleo celular, más del 95 % de las células mostraron colocalización de GFP IBA uno y dpi. Después de estimular las células con LPS, las microglías adoptaron un marcado cambio morfológico, pasando de un fenotipo pequeño bi a una forma similar a la de un ameboide. La tinción inmunoistoquímica para P 65 demuestra que, en condiciones normales, P 65 se localiza de forma difusa en todo el citoplasma.
Después de una exposición de dos horas a Pam P, la inmunorreactividad 65 cambió drásticamente su localización hacia el núcleo celular, lo que confirma que los microglías aislados mantuvieron su funcionalidad inmuno-bioquímica. La secreción del citocina proinflamatoria TNF alfa se determinó tras la exposición a PAM o LPS. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar microglías corticales de neonatos murinos para obtener los mejores resultados.
Es importante mantener una técnica estéril y eliminar completamente el tejido meníngeo de la región cortical diseccionada.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este artículo describe un procedimiento para aislar microglía cortical de neonatos murinos, haciendo hincapié en la importancia de preservar la inmunofunción microglial durante el proceso. El método de aislamiento implica la microdisección del tejido cerebral, el cultivo de células gliales mixtas y, posteriormente, el aislamiento de microglía para experimentación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Antecedentes
- Las microglías desempeñan un papel crucial en el sistema nervioso central (CNS).
- Los métodos de aislamiento pueden afectar la funcionalidad de las células microgliales.
- La preservación de la inmunofunción es esencial para obtener resultados experimentales precisos.
- Los estímulos proinflamatorios se utilizan para evaluar la activación microglial.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para aislar microglía de neonatos murinos.
- Asegurar que la microglía aislada conserve su inmunofenotipo y funcionalidad.
- Facilitar experimentaciones posteriores sobre la biología de la microglía.
Métodos Utilizados
- Microdisección de tejido cerebral cortical de neonatos murinos.
- Cultivo de células gliales mixtas durante 17 a 21 días in vitro.
- Aislamiento de microglía a partir de cultivos de glía mixta.
- Uso de microscopía de inmunofluorescencia y ELISA para evaluar la funcionalidad de la microglía.
Resultados principales
- El protocolo de aislamiento produce cultivos de microglía altamente puros.
- La microglía mantiene características inmunofuncionales tras el aislamiento.
- La activación con LPS y Pam 3 CSK 4 demuestra la funcionalidad conservada.
- La imagen fluorescente y la inmunocitoquímica confirman los resultados.
Conclusiones
- El método de aislamiento descrito es eficaz para obtener microglía funcional.
- La preservación de la inmunofunción es fundamental para estudiar la biología de la microglía.
- Este protocolo puede aplicarse a diversos montajes experimentales que involucran microglía.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de microglía funcional de neonatos murinos permite la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas en neuroinmunología, al preservar el inmunofenotipo y la respuesta a estímulos inflamatorios. Este modelo ex vivo respalda la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento, al mantener estados quiescentes y activados relevantes para las vías de enfermedades del sistema nervioso central. El método proporciona un sistema relevante para la enfermedad, útil para el cribado de compuestos inmunomoduladores y la evaluación del compromiso de la diana en flujos de trabajo preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de activación de microglía mediante ensayos de desafío con LPS y Pam3CSK4.
- Valor operativo: Proporciona microglía cortical altamente pura con funcionalidad preservada de translocación nuclear de NF-κB p65 y secreción de TNF-α.
- Valor predictivo: Facilita la prueba de hipótesis sobre dianas al mantener la fidelidad inmunofenotípica desde estados quiescentes hasta estados proinflamatorios.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Proporciona un sistema estandarizado de monocapa de microglía para la selección de compuestos tras 17–21 días de maduración del cultivo glial.
- Valor operativo: Permite cuantificar la pureza de la microglía mediante la colocalización de IBA-1/GFP (>95 %) y obtener lecturas funcionales como la liberación de citoquinas.
- Preparación para el ensayo: Las microglías aisladas muestran respuestas morfológicas y funcionales a estímulos, lo que permite un perfilado confiable de respuesta a la dosis.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor traslacional: Mantiene la funcionalidad de las microglías ex vivo, favoreciendo la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica de dianas neuroinflamatorias.
- Reducción del riesgo mecanicista: Conserva la funcionalidad bioquímica (señalización de NF-κB, liberación de TNF-α) fundamental para evaluar la modulación de vías mediada por dianas.
- Relevancia para la enfermedad: Modela estados de microglía quiescente y activada, aplicables a la investigación de enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de aislamiento se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del objetivo hasta la identificación de compuestos iniciales, al proporcionar una plataforma reproducible de microglía para estudios del mecanismo de acción y cribado fenotípico en neuroinmunología.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías mediante ensayos de translocación de NF-κB y secreción de citoquinas tras un desafío inmunitario.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante un rendimiento, pureza y respuesta funcional consistentes de microglía tras aislamiento con agitador rotatorio.
- Análisis: Genera variables dependientes cuantitativas, incluidos los niveles de secreción de TNF-α y la localización nuclear de p65, para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la función de la microglía ex vivo con la relevancia in vivo mediante la conservación del inmunofenotipo y la cinética de activación.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reutilizable de aislamiento de microglía aplicable en múltiples campañas de validación de dianas en el SNC.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de dianas mediante la conservación del inmunofenotipo de microglía y la funcionalidad sensible a estímulos.
- Valor operativo: Aislamiento estandarizado mediante agitación mecánica que produce cultivos de microglía reproducibles con una pureza >95 % y una integridad funcional.
- Valor estratégico: Reduce la ambigüedad mecanicista en el cribado de neuroinmunología al mantener el comportamiento ex vivo de la microglía indicativo de estados in vivo.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas inmunomoduladoras basada en la interacción con la diana validada en ensayos funcionales de microglía.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos murinos neonatales y en técnicas de cultivo estéril de células gliales.
- Depende de un agitador rotatorio con control de temperatura y de microscopía de contraste de fases invertida para el aislamiento y la verificación de microglía.
- Exige la estandarización de la eliminación de las meninges y de la duración del cultivo (17–21 días) entre diferentes equipos para garantizar el rendimiento y la pureza de la microglía.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización del tiempo de disociación y de las propiedades de adhesión de la microglía.
- Limitación práctica: el rendimiento de microglía depende de la eliminación completa del tejido meníngeo para prevenir la contaminación del cultivo glial.
