Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

El objetivo general de este procedimiento es aislar la microglía cortical de los neonatos murinos. Esto se logra mediante la disección de tejido cerebral cortical de los recién nacidos de Muren. El segundo paso es cultivar cultivos de células gliales mixtas durante 17 a 21 días in vitro.

A continuación, se aísla la microglía de estos cultivos gliales mixtos. El paso final es colocar células microgliales en placas de cultivo celular para su posterior experimentación. En última instancia, la microscopía de inmunofluorescencia y Eliza se utilizan para demostrar que este protocolo de aislamiento preserva el fenotipo y la funcionalidad de la inmunoglobión microglial.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que las SEP involucradas en la microdisección son difíciles de realizar. La ejecución exitosa de este procedimiento requiere velocidad y precisión. Es decir, ser demasiado lento reducirá la producción celular, mientras que la extirpación incompleta de las meninges contaminará el cultivo glial e impedirá el crecimiento glial.

Comience por preparar el medio completo de la microglía, denominado MCM en lo sucesivo. Prepare un matraz por cachorro e incubelos durante al menos una hora. Este paso de equilibrio es esencial para el éxito.

A continuación, prepare la alícuota y enfríe con hielo. Todos los medios requeridos alícuota de seis mililitros de MCM para cada cachorro y calentar en un baño de agua a 37 grados centígrados antes de la disección. Limpie la estación de trabajo de flujo de aire horizontal y el microscopio de disección con etanol al 70%.

A continuación, coloque las herramientas quirúrgicas esterilizadas necesarias para el procedimiento en el área de trabajo. Prepare una placa estéril con medios de disección para capturar la cabeza y otro para la disección. Dispense el medio de picado en su propio plato para picar el tejido cerebral.

Después de la decapitación y la extracción del cerebro, coloque el cerebro recién aislado bajo un microscopio de disección para visualizar las cortesías, asegurándose de mantener el lado dorsal hacia arriba y seco. Asegure el cerebro insertando las puntas de los fórceps en la intersección del mesencéfalo y la corteza. Una vez colocadas, retire por completo las meninges corticales dorsales.

A continuación, retire las meninges ventrales para maximizar la pureza y el rendimiento de la microglía. Es fundamental extirpar por completo todo el tejido meníngeo. Separa las cortezas del resto del cerebro.

Asegúrese de extirpar cualquier meninge cortical residual que pueda estar presente en el lado ventral o medial de las cortezas. Una vez retirado el tejido meníngeo, coloque las cortezas en la fuente para picar preparada anteriormente. Trabajando en un gabinete de seguridad biológica de clase dos, use tijeras para picar el tejido cerebral.

Transfiera el tejido picado a un tubo cónico de 15 milímetros. Enjuague tanto las tijeras como el plato para picar con un mililitro de medio de picar cada uno para maximizar los rendimientos. Recoja y dispense estos enjuagues en el tubo cónico de 15 mililitros que contiene el tejido picado.

Deje la suspensión de tejido sin alterar durante uno o dos minutos, permitiendo que el tejido picado se asiente en el fondo del tubo. Pasado este tiempo, retire con cuidado y deseche dos mililitros del sobrenadante, teniendo cuidado de no alterar el tejido picado sedimentado. Agregue tres mililitros del MCM previamente calentado al pañuelo picado y luego pruebe el pañuelo con fuerza.

No debe quedar ningún tejido sólido discernible cuando se complete el tréveris. Añada otros tres mililitros de MCM utilizando la misma punta de pipeta para recoger la muestra triturada residual de la punta. Una vez recogido, centrifugar el tejido picado para pellet las células.

Cuando esté completo, devuelva las células peletizadas al gabinete de seguridad biológica. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante. Resusar suavemente.

Suspenda el pellet de celda con dos mililitros de MCM tibio y luego agregue la suspensión de cell resus al matraz preparado anteriormente. Incubar las células durante 24 horas. Después de 24 horas, golpee suavemente el matraz contra la palma de la mano para interrumpir los restos de tejido.

Revise las celdas antes y después de golpear para asegurarse de que los desechos se hayan eliminado por completo. A continuación, sustituya el medio por MCM nuevo y devuelva el matraz a la incubadora. Revise las células diariamente para controlar el crecimiento y la contaminación.

Después de aproximadamente 17 a 21 días, las células microgliales estarán listas para la cosecha para determinar si las células están listas, examinarlas bajo un microscopio de contraste de fase invertida. Las microglías están listas para la cosecha. Cuando han alcanzado aproximadamente el 40% de fluidez, aparecen como células esféricas pequeñas y brillantes que crecen como una monocapa encima de otras.

Para aislar, la microglía golpea vigorosamente el matraz contra la mesa de laboratorio. Esta agitación ayuda a separar la microglía de otras células gliales debido a las propiedades de baja adherencia de la microglía. Selle las tapas de los matraces con paraform y rote los cultivos gliales mezclados utilizando un agitador rotatorio no humidificado a temperatura controlada durante cinco horas.

Después de este tiempo, inspeccione visualmente que la microglía se haya levantado de la superficie del matraz. Usando un microscopio de contraste de fase invertida, las microglías son células brillantes, esféricas que flotan libremente. Habrá una capa residual de astrocitos y oligodendrocitos adherida al fondo del matraz.

A continuación, recoja el sobrenadante que contiene la microglía en un tubo de centrífuga cónico estéril y en el paladar. Resus. Suspenda el gránulo microglial en un medio de crecimiento microglial tibio y determine la concentración celular utilizando una placa hemocitómetro. Las celdas en un formato de placa de 24 pocillos sobre cubierta de plástico o vidrio estéril se deslizan 24 horas después.

Reemplace el medio con MGM fresco y tibio para eliminar las celdas flotantes y los desechos. Este paso es crítico para la supervivencia celular y para mantener la microglía inactiva, las células de la microglía están listas para la experimentación inmediatamente después de este paso de realimentación para evaluar la pureza de la microglía. Los cultivos celulares derivados de la microglía que expresan GFP de forma endógena se tiñeron para el antígeno de macrófagos IBA uno y se contratiñeron con dapi.

Con el fin de visualizar el núcleo celular, más del 95% de las células exhibieron colocalización de GFP IBA one y dpi. Después de desafiar a las células con LPS, la microglía adoptó un marcado cambio morfológico de un pequeño bifenotipo a una forma similar a la de un ameboide. La tinción inmunofitoquímica para P 65 evidencia que, en condiciones normales, P 65 se localiza difusamente en todo el citoplasma.

Mientras que después de una exposición de dos horas a Pam P 65, la inmunorreactividad cambió drásticamente la localización al núcleo celular para confirmar que la microglía aislada conservaba su funcionalidad inmunológica bioquímica. La secreción de la citoquina proinflamatoria TNF alfa se determinó después de la exposición a PAM o LPS. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar la microglía cortical de los neonatos espejo para obtener los mejores resultados.

Es importante mantener la técnica estéril y extraer minuciosamente el tejido meníngeo de la región cortical disecada.