Vigilar los cambios en la polaridad de la membrana, membrana Integridad, e intracelular de iones concentraciones en Streptococcus pneumoniae Uso de tintes fluorescentes

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar tintes fluorescentes para monitorear los cambios en la dinámica de la membrana y las concentraciones de iones intracelulares en un sistema bacteriano. Esto se logra incubando primero las bacterias durante su fase de crecimiento con el flúor de interés hasta que se haya equilibrado a través de sus membranas. A continuación, se tratan las bacterias con el agente elegido y se monitoriza su fluorescencia.

Los resultados pueden mostrar cambios en la despolarización de la membrana, la integridad de la membrana y las concentraciones de iones intracelulares en función de los cambios observados en la fluorescencia de los tintes indicadores. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas convencionales de electrofisiología, como el patching clamping, que se utiliza en los sistemas eucariotas, es que los cambios en la dinámica de la membrana y las concentraciones de iones intracelulares ahora se pueden monitorear en las bacterias mediante fluorescente. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita cierto esfuerzo para optimizar las concentraciones de tinte.

Condiciones de carga y ajustes de detección Comience con las células bacterianas. Recién granulado en solución de lavado, primero vuelva a suspender el pellet en al menos un mililitro de PBS para obtener 100 millones de UFC por mililitro, que es suficiente para cinco muestras. Transfiera un mililitro de las células lavadas a un tubo de microcentrífuga y agregue 25 microlitros de un filtro molar.

Solución madre esterilizada de glucosa y luego incubar las células en un bloque calefactor a 37 grados centígrados durante 15 minutos. La glucosa añadida puede variar en función del experimento. Después de 15 minutos, agregue cinco microlitros de la muerte regresiva de 50 micromolares y 10 microlitros de solución de PI.

Mezcle bien las células pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo varias veces. A continuación, divida esta suspensión celular en cinco pocillos de muestra de una placa transparente de 96 pocillos. Cargue la placa en un conjunto de lectores de placas precalentadas para la detección de NP de muerte regresiva.

Ahora monitoree el equilibrio de la muerte regresiva sobre las membranas celulares tomando medidas una vez por minuto durante 30 a 40 minutos hasta que la lectura se estabilice a su valor de pretratamiento. A continuación, expulse la placa y añada el agente experimental de su elección. Regrese inmediatamente la placa al lector y continúe monitoreando la muerte regresiva y la fluorescencia PI durante el período de tiempo deseado.

Al preparar el tampón de carga para este procedimiento, asegúrese de vórtice brevemente antes de agregar PBS y Probenecid. Después de agregar esas soluciones, vuelva a vórdelo y envuélvalo en papel de aluminio hasta obtener un mililitro de suspensión de dos celdas. Agregue un mililitro de dos x tampón de carga.

Esto es suficiente para 10 muestras. Incubar la mezcla en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 75 minutos, protegido de la luz Durante todos estos ensayos. Es posible que sea necesario ajustar la concentración del colorante y el tiempo de incubación para optimizar el ensayo y el nivel de detección de fluorescencia de referencia, en función de la especie bacteriana específica y otras variables del sistema experimental.

Después de la incubación, lave las células tres veces por cada lavado. Pellet las células a 2.400 Gs durante 10 minutos y resuspenderlas en dos mililitros de PBS conteniendo una x pronic. Después de los tres lavados, incube las células a 37 grados centígrados durante otros 30 minutos.

Esto permite que el estro dentro de las bacterias hidrolice los grupos éster del tinte, lo que hace que el tinte sea activo dentro de la célula. A continuación, las células retiran el snat y las resus suspenden en dos mililitros de PBS que contienen un x Probenecid. Si es necesario, ahora se puede volver a agregar glucosa para revitalizar las bacterias, cargar 200 microlitros de células en un pocillo de una placa de 96 pocillos para cada muestra y cargar la placa en un lector de precalentamiento en una muestra.

Bueno, primero establezca una lectura de referencia en las longitudes de onda adecuadas y a una velocidad de una lectura por segundo durante un minuto. A continuación, retire la placa y añada unos cinco microlitros del tratamiento de elección. A eso.

Bueno, pipetee rápidamente hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar el tratamiento y devolver inmediatamente la placa al lector. Continúe tomando medidas durante el tiempo deseado. Para analizar los datos, calcule la relación de los valores fluorescentes para cada punto de tiempo dividiendo el valor, uno por el valor dos, y trace los valores de la relación en un gráfico.

En la preparación, cree un rango de cinco o seis tampones con alto contenido de potasio con valores de pH de 6.5 a 8.0. Al igual que en el procedimiento anterior, utilice un vórtice para preparar el tampón de carga de dos x a partir de un lavado y concentrado de cultivo de fase logarítmica media. Luego reemplace el SNAT con dos mililitros de BS para hacer una suspensión de cuatro celdas.

Combine un mililitro de la suspensión de cuatro celdas x con un mililitro del tampón de carga de dos x. Ahora incube las células en un baño de agua a 30 grados centígrados durante 40 minutos. Protégelo de la luz.

Ahora lave las celdas tres veces. Granule las celdas como se muestra anteriormente. Agregue cuatro mililitros de PBS que contengan dos x prop Benin y un milimolar de glucosa y repita la centrifugación después de los tres lavados.

Incuba las células a 37 grados centígrados durante otros cinco minutos. Para determinar el filtro de fluorescencia de fondo, esterilice unos 500 microlitros de la suspensión bacteriana energizada para eliminar las bacterias. Luego transfiera 200 microlitros del filtrado a una placa de 96 pocillos y mida la absorción de ese pocillo durante un minuto.

Para obtener una curva de calibración in vivo, reduzca la intensidad de 500 vatios ALI de microlitros de las celdas cargadas y energizadas y resus. Suspenderlos en una serie de tampones de alto potasio de diferente pH a cada muestra, añadir 20 micromolares de risina. Esto equilibra el pH intracelular de las células con el pH del tampón circundante.

A continuación, incubar las muestras a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, transfiera las muestras a la placa de 96 pocillos en el lector de placas. Mida la fluorescencia de cada muestra durante unos minutos para establecer una lectura de estudio para cada una. Pozo.

Para analizar estos datos, reste los valores de fluorescencia de fondo y, a continuación, calcule la relación entre los valores de fluorescencia dividiendo el valor. Uno por valor dos, trace los valores de proporción para cada tampón de pH para crear la curva de calibración para medir los cambios en el pH intracelular. Cargue 200 muestras de microlitros de las células energizadas en una placa y mida la fluorescencia cada cinco segundos durante cinco minutos.

Simultáneamente, agregue 10 CCCP micromolares a una muestra mientras agrega los agentes de interés a las otras muestras. El CCCP es un control positivo alineado en el tiempo para la disminución del pH intracelular. Devuelva inmediatamente la placa al lector y continúe midiendo la fluorescencia cada cinco segundos durante 10 minutos.

Como control adicional, agregue 20 micro molares de NI garrison a todas las muestras para equilibrar el pH de las bacterias con el del tampón durante otros cinco minutos. Al explorar la polaridad de la membrana, las bacterias deben incubarse con muerte regresiva durante unos 40 minutos para permitir que el tinte se equilibre sobre la membrana. Esto se indica por la disminución constante de la fluorescencia que se estabiliza.

La PI no requiere equilibrio, pero junto con la muerte regresiva, es útil para controlar la ruptura de la membrana. Simultáneamente con la polaridad, la despolarización y ruptura de las bacterias se indica por un aumento en la intensidad fluorescente de ambos colorantes durante menos de 2:00 AM se calcula la relación de dos señales fluorescentes y un aumento o disminución en esta relación corresponde al calcio intracelular. En el caso de la PBFI, el potasio intracelular se mide mediante relaciones de fluorescencia.

El hidrógeno intracelular se mide utilizando relaciones de fluorescencia de B-C-E-C-F am. Tras la adición del calcio, el iones iono cuatro micina, el calcio fluye hacia la célula, lo que provoca un aumento de la relación de fluorescencia. La adición de valmy tiene el efecto contrario al que hace que el potasio fluya fuera de la célula, lo que se indica por una disminución en la relación de fluorescencia.

B-C-E-C-F permite la medición del pH intracelular, primero se realizan curvas de calibración en varios tampones de pH conocido. Una disminución en la relación de fluorescencia del colorante corresponde a una disminución en el pH. Esto se ve con la adición de protón de fuerza CCCP, la línea negra, y después de la adición de un disipador de fuerza motriz de protón, la línea azul.

La segunda flecha muestra la adición de nissina, que equilibra las concentraciones de hidrógeno intracelular y extracelular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir la despolarización de la membrana, la integridad de la membrana y las concentraciones intracelulares de iones en las células bacterianas. También debería ser capaz de utilizar este protocolo como punto de partida para estudiar otras propiedades y células bacterianas.