Ingeniería fibrina basado en construcciones de tejido de miofibroblastos y de aplicación de las restricciones y la tensión para inducir la organización de células y colágeno (Re)

El objetivo general de este procedimiento es crear construcciones basadas en fibrina que puedan utilizarse para estudiar la reorganización celular y del colágeno. Esto se logra aislando primero las células safenas venosas humanas del tejido del donante y expandiéndolas en cultivo. El segundo paso es pegar tiras de velcro en membranas flexibles.

En la parte inferior de seis placas de pozos para crear un espacio cuadrado en el centro, que sostendrá la construcción. A continuación, se añade una mezcla de células de trombina de fibrinógeno y perlas marcadas con fluorescencia en el espacio entre las tiras de velcro y se deja polimerizar para formar un gel. El paso final es acondicionar las células e inducir la formación de matrices orientadas mediante la aplicación de una deformación cíclica uniaxial a la construcción o mediante la liberación de la deformación estática.

Recortando el gel de fibrina de los postes de velcro en una sola dirección. En última instancia, se pueden obtener resultados que describen los cambios en la reorganización celular y del colágeno mediante el seguimiento de los constructos a lo largo del tiempo mediante microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la remodelación del colágeno relacionadas con la velocidad de formación y reorientación del colágeno por parte de diferentes tipos de células.

Para empezar, adquiera tejido de donante humano de la saana magna venosa de acuerdo con las pautas para el uso secundario del material. A continuación, aísle las células safenas venosas humanas o H VSC del tejido siguiendo el protocolo de Schnell et al, y almacenéelas en nitrógeno líquido. Cuando sea necesario, expanda las células colocando un vial que contenga 250.000 VSC de H de descongelación rápida en un matraz T 75 con 15 mililitros de crecimiento precalentado.

Medio compuesto por 440 mililitros de DMEM avanzado, 50 mililitros de suero fetal bovino. Cinco mililitros de estreptococo de pluma 100 X y cinco mililitros de 200 milimolares de L glut máx. Cambie el medio de crecimiento cada dos o tres días durante aproximadamente dos semanas hasta que las células sean confluentes.

Una vez confluentes, cosechar y dividir las celdas hasta su paso. Nueve. Usar tripsina hasta que haya un número adecuado de células para el experimento planeado. Se requieren aproximadamente 1,5 millones de celdas para cada construcción.

Cuando se haya cultivado un número adecuado de células, recoseche su capacidad al 90% y luego suspenda las células en un medio de crecimiento a 15 millones de células por mililitro. Colócalos en hielo hasta que se necesiten. Prepare el pegamento de silicona mezclando el elastómero y el agente de curado en una proporción de 10 a uno.

Use este pegamento para unir tiras de siete milímetros por tres milímetros atrapadas del lado suave del velcro a la membrana flexible de las placas de celdas flexibles. Para formar una forma de cruz con un centro abierto, seque el pegamento de silicona durante la noche en un horno a 60 grados centígrados para asegurar un endurecimiento del pegamento. A continuación, esterilizar la placa añadiendo cinco mililitros de etanol al 70% a cada pocillo e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Enjuague los pocillos tres veces con PBS estéril. A continuación, retire el PBS de los pocillos y las tiras de velcro. Coloque la placa destapada debajo de la lámpara UV de una campana de cultivo de tejidos durante 30 minutos para esterilizar las superficies.

Una vez terminado, cubra el plato y manténgalo estéril hasta su uso. A continuación, prepare el medio de ingeniería de tejidos añadiendo 130 miligramos de ácido álico, dos fosfatos y 500 mililitros de medio de crecimiento durante los primeros siete días de cultivo. Además, agregue un miligramo por mililitro de ácido épsilon aminocaproico para evitar que la fibrina se degrade, disuelva el fibrinógeno a una concentración de 10 miligramos de proteína real por mililitro de medio de ingeniería de tejidos suplementado con ácido aminocaproico mezclando suavemente.

Luego estéril. Filtre la solución de fibrinógeno a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras y guárdela en hielo hasta su uso. A continuación, prepare la solución de trombina diluyendo la trombina caldo hasta una concentración final de 10 unidades internacionales por mililitro en un medio de ingeniería de tejidos suplementado con ácido aminocaproico y guárdelo en hielo hasta su uso.

A continuación, 100 microlitros de la suspensión celular preparada previamente en un tubo de microcentrífuga para cada construcción de tejido que se hará. Centrifugar las células a 350 veces G durante siete minutos, y luego desechar el sobrenadante, resuspender las células en 50 microlitros de la solución de trombina y agregar cuatro microlitros, una microesfera de poliestireno fluorescente azul que se utilizará como marcadores de referencia internos. A continuación, extraiga 50 microlitros de la solución de fibrinógeno en una punta de pipeta.

Aumente el volumen de la pipeta a 100 microlitros y, a continuación, pipetee la solución de 50 microlitros de fibrinógeno en el tubo de centrífuga. Con la mezcla de trombina y células, mezcle suavemente la trombina y el fibrinógeno extrayendo la mezcla de 100 microlitros para evitar la formación de burbujas. Una vez que la solución esté bien mezclada, pipetee la mezcla de gel en y entre las tiras de Velcro que estamos rápidamente como el tiempo típico de gelia para los geles de fibrina, una vez mezclados es del orden de 20 segundos, incubar las construcciones durante 30 minutos a 37 grados Celsius en una incubadora tamponada humidificada con 5% de dióxido de carbono para permitir que se gelifiquen.

A continuación, añada seis mililitros de medio de ingeniería tisular con ácido aminocaproico a cada pocillo y vuelva a colocar la placa en la incubadora. Reemplace el medio cada dos o tres días durante los primeros siete días. Después de una semana, retire el suplemento de ácido aminocaproico del medio y continúe cultivando los geles con los medios de ingeniería de tejidos.

Todavía intercambiándolo cada dos o tres días durante los primeros cinco días en cultivo, permite que las construcciones se compacten y se reorganicen bajo tensión estática formando fibras de colágeno, biaxialmente debido a las restricciones de la fibra para inducir la reorganización del colágeno en una sola dirección en condiciones estáticas. Primero, cultive las células durante una semana adicional en el día 12, corte la construcción de tejido de dos tiras de Velcro en una sola dirección. Esto causará tensión en la dirección opuesta a que la fibrina se compacte.

Alternativamente, para la carga cíclica, coloque las placas encima de un conjunto de postes de carga en una placa base de celda flexible, equipada con una junta en el sexto día, los postes de carga soportarán la membrana flexible de los pozos y permitirán que la base de los postes se tire hacia abajo para crear tensión en una sola dirección. A continuación, configure el protocolo de software para aplicar una deformación cíclica a la construcción. El programa que se muestra aquí es para una deformación intermitente que se asemeja a una onda sinusoidal, forzando la construcción de cero a 5% de deformación a un hercio durante períodos de tres horas, alternando con tres horas de descanso.

Con el programa preparado, encienda la bomba de vacío e inicie el programa. El controlador regulará la fuerza del vacío en el sistema, que tira hacia abajo de las membranas alrededor de los postes de soporte para aplicar una tensión cíclica a las construcciones de acuerdo con el programa. Ejecute el programa durante una semana, teniendo cuidado de cambiar los medios cada dos o tres días, después de una semana de acondicionamiento, induzca la reorganización del colágeno girando el poste rectangular 90 grados para cambiar la dirección de la tensión durante tres días.

Para visualizar la remodelación activa del colágeno en tiempo real, agregue el rastreador celular naranja. Añadir una concentración de cuatro micromolares para teñir el citoplasma y CNA 35 OG 4 88. Añade una concentración de un micromolar para visualizar las fibras de colágeno.

Estas sondas no interferirán con la viabilidad celular ni con la formación de colágeno. Luego incubar las células durante una hora en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire la placa de cultivo de la incubadora y transpórtela a un microscopio de escaneo láser confocal para visualizar las células y el colágeno.

Tome imágenes de los geles en la superficie y hasta aproximadamente 60 micras en el andamio para ver los cambios en la organización a estos niveles a lo largo del tiempo. A continuación, vuelva a colocar la placa en la configuración de acondicionamiento mecánico dentro de la incubadora. Repita este procedimiento cada pocos días para seguir el progreso de la reorganización celular en respuesta a los estímulos.

Las microesferas fluorescentes añadidas a la mezcla de fibrinógeno antes de la polimerización quedan atrapadas en la red de fibrina y funcionan bien como marcadores de referencia para garantizar la visualización de la misma área en diferentes puntos de tiempo cuando se cultivan en condiciones estáticas y se adhieren a los cuatro postes. No se puede ver una orientación real de la fibra o del celular tres días después de recortar dos de las conexiones de los postes de fibra. La tensión uniaxial causada por la contracción ha alineado las fibras de colágeno que se muestran en verde.

Las células safenas venosas humanas que se han filtrado cíclicamente en una sola dirección durante una semana se muestran aquí en la superficie de la construcción y a 60 micras en el gel. Cuando la dirección de la tensión se giró 90 grados, se encontró que la respuesta celular después de tres días era más rápida en la superficie que en el núcleo del tejido. Una vez dominada la ingeniería, estas construcciones de tejidos basadas en FI se pueden realizar en unas dos horas.