Name: Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a preparar retina wholemount en ratón para evaluación estructural mediante inmunohistoquímica. Este protocolo optimizado preserva la integridad tisular y mejora la visualización de proteínas sinápticas en tejido neural delicado.

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Este trabajo fue financiado por la subvención R01-EY020535 de los NIH (B.T.S), la Fundación Internacional de Investigación de la Retina y la Fundación Karl Kirchgessner (B.T.S).

En todos los procedimientos experimentales, los animales fueron tratados de acuerdo con las regulaciones de la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y en cumplimiento con los protocolos aprobados por Weill Cornell Medical College. Los animales fueron sacrificados por dióxido de carbono y posterior luxación cervical.
1. Disección de retina entera
<ol>
	<li>Después de la eutanasia del ratón, se le enuclean los ojos y se colocan en una solución de Ringer oxigenada con tamponamiento con HEPES (Tabla 1).</li>
	<li>Retire la córnea cortando en un camino circular a lo largo de la ora serrata con tijeras pequeñas, sujetando el ojo en el limbo con pinzas. Extraiga la lente con pinzas.</li>
	<li>Retire la mayor cantidad posible de vítreo con pinzas de borde romo. Este paso es importante para las inyecciones en bolo y los registros electrofisiológicos; No es necesario para cuando se realiza inmunohistoquímica sola.</li>
	<li>Separe la retina del ocular colocando pinzas entre la retina y el ocular, moviendo las pinzas lentamente alrededor de la circunferencia. Estabilice la copa ocular sujetando firmemente la esclerótica con un segundo juego de pinzas. Corta el nervio óptico en la ubicación entre la retina y el ocular para facilitar la separación de la retina del ocular.</li>
	<li>La retina se puede diseccionar en pedazos (por ejemplo, cuartos) o usarse como un todo. Para cortar en pedazos, use unas tijeras para hacer incisiones desde la periferia de la retina hasta el nervio óptico. Alternativamente, para usar toda la retina, haga incisiones desde la periferia hasta la mitad del nervio óptico. Las incisiones ayudarán a hacer una preparación plana.</li>
</ol>
2. Montaje en inserto de membrana de PTFE hidrofilizado
<ol>
	<li>Prepare la membrana como se describe a continuación. Cuando se realicen registros fisiológicos o experimentos de inyección de tinte, acorte el soporte utilizando un torno o una sierra de mano para que el anillo restante tenga una altura de 1 mm. 
	Nota: Los insertos de la placa de cultivo pueden estar modificados o sin modificar (Figura 1A). La elección de la configuración está dictada por el propósito del experimento. Para la inmunotinción, es adecuado un inserto no modificado.</li>
	<li>Pule las superficies rugosas con papel de lija fino (grano 300 o superior).</li>
	<li>(Opcional) Retire los pies debajo del anillo con unas tijeras.</li>
	<li>Para eliminar cualquier residuo, enjuague o sonique la membrana en agua destilada durante 2-3 minutos.</li>
	<li>Monte el tejido en la membrana (Figura 1A). Coloque el tejido con un poco de solución encima de la membrana con una pipeta de transferencia de plástico. Corte la punta estrecha de la pipeta si es necesario, para evitar que la muestra de tejido se adhiera a la pipeta durante la transferencia.</li>
	<li>Unir la retina con células ganglionares (GC) hacia arriba: en la membrana, retire gradualmente la solución mientras extiende la retina y despliega los pliegues con fórceps.</li>
	<li>En el lado opuesto de la membrana, coloque una jeringa vacía (1 ml) directamente debajo del tejido. Aplique la succión tirando hacia atrás del émbolo hasta un volumen de 0,2-0,3 ml. Aumente el área de superficie de succión cortando la punta de sujeción de la jeringa antes de usarla. El tejido no requiere tratamiento adicional para la adhesión, ya que está físicamente enredado dentro de la membrana.</li>
</ol>
3. Inyección en bolo de isolectina Alexa 488
<ol>
	<li>Prepare las pipetas de parche y la solución de tinción. Extraiga pipetas de parche de vidrio capilar de borosilicato con un extractor Flaming/Brown, con una resistencia de ~1 MΩ. Rompa suavemente la punta de la pipeta.</li>
	<li>Prepare la solución de tinción añadiendo 0,3 μl de solución madre de isolectina Alexa 488 a 10 μl de la solución de Ringer tamponada con HEPES descrita en el paso 1.2.</li>
	<li>Transfiera la muestra a la configuración de pinza de parche para la inyección (Figura 1C). Coloque la membrana con el tejido adherido en la cámara de registro perfundida con solución de Ringer tamponada con HEPES calentada (37 °C) y oxigenada.</li>
	<li>Coloque la pipeta que contiene el colorante contra la membrana limitante interna (ILM, Figura 2A). Con un micromanipulador, avance aún más la pipeta contra el ILM hasta que penetre en él. Inyecte la solución de tinción con una presión de 10-20 psi durante 1 segundo con un picospritzer. Se puede apuntar a una o varias ubicaciones para la inyección (Figura 2B). Si no se dispone de un picospritzer, se puede utilizar una jeringa de 10 ml para suministrar una presión de aire positiva para la inyección.</li>
	<li>Incubar el tejido inyectado durante 10 min. Durante la incubación, el tejido inyectado se puede ver bajo iluminación de epifluorescencia.</li>
	<li>Después del etiquetado, la preparación se puede llevar a un microscopio para obtener imágenes. Transfiera el inserto a una placa de cultivo con fondo de vidrio, colocando la retina con el lado hacia abajo (Figura 1C).</li>
	<li>Agregue una gota de solución HEPES para mantener la muestra húmeda.</li>
	<li>Coloque 2-3 puntos de grasa para aspiradora alrededor del perímetro del anillo de plástico para asegurar firmemente el inserto al fondo de la placa de cultivo.</li>
	<li>Transfiera el plato a la etapa del microscopio.</li>
</ol>
4. Fijación de paraformaldehído y carbodiimida
<ol>
	<li>Fije la muestra transfiriendo el inserto al fijador durante 15 min. Se pueden utilizar tiempos de fijación más largos o más cortos, dependiendo de la aplicación. Ambos fijadores se pueden utilizar eficazmente para fijar GFP, isolectina o hidrazidas fluorescentes de Alexa (por ejemplo, se utilizan para rellenar las células en los registros de patch-clamp) 
	Nota: Para la fijación, se pueden utilizar soluciones de carbodiimida al 4% o paraformaldehído al 4%. Para mantener la adherencia, la fijación debe realizarse después de que el tejido ya se haya unido a la membrana. El tejido puede fijarse inmediatamente después del montaje, o después del registro fisiológico y/o la inyección en bolo.</li>
	<li>Enjuague el pañuelo en tampón de fosfato (PB) durante 30 min. Después de esto, el tejido puede procesarse como un montaje completo (paso 5) o cortarse en secciones verticales y luego procesarse (pasos 6 y 7).</li>
</ol>
5. Inmunotinción de Retina Enteras
<ol>
	<li>En una placa de 24 pocillos (Figura 1D), bloquee las piezas de retina de la membrana durante 1 hora en una solución de tinción.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos primarios anti-PSD-95 de ratón 1:300 en la solución de tinción y aplicar durante 48 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue ~ 100-150 μl de solución de anticuerpos en cada pocillo con el tejido. Para evitar que se sequen, llene los pozos no utilizados con agua destilada.</li>
	<li>Enjuague durante 20 min en PB, 3 veces.</li>
	<li>Incubar durante 24 horas en anticuerpo secundario anti-ratón Alexa 568 disuelto 1:500 en la solución de tinción.</li>
	<li>Enjuague durante 20 min en PB, 3 veces.</li>
	<li>Coloque el inserto con el tejido teñido en una placa de Petri estándar de 3 cm llena de solución de PB. Con unas tijeras pequeñas, corte la parte de la membrana que contiene la retina del anillo.</li>
	<li>Transfiera la retina de la membrana a un deslizamiento de la retina hacia arriba. Retire el PB, agregue el medio de montaje. Coloque pequeños pedazos de un cubreobjetos roto entre el portaobjetos y los cubreobjetos para evitar apretones extensos y daños en la retina. Coloque el cubreobjetos.</li>
	<li>Selle el cubreobjetos en su lugar con esmalte de uñas. Mantenga las diapositivas en la oscuridad, en un refrigerador.</li>
</ol>
6. Seccionamiento vertical de tejido montado en membrana
<ol>
	<li>Después de la fijación, sumerja el tejido de la membrana en las soluciones de gradiente de sacarosa al 10%, 20% y 30% de sacarosa durante 30 minutos, 1 hora y toda la noche, respectivamente. El paso nocturno se realiza a 4 °C en el refrigerador, todos los demás pasos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con unas tijeras, retire la membrana con el pañuelo del anillo de inserción de plástico.</li>
	<li>Coloque la membrana cortada en Parafilm con la retina hacia arriba y retire la mayor cantidad de solución posible con Kimwipes.</li>
	<li>Coloque el Parafilm con el tejido en la cámara de criostato y agregue una gota de medio OCT. Utilice el dispositivo de congelación rápida para acelerar la congelación.</li>
	<li>Separe la muestra congelada y déle la vuelta.</li>
	<li>Deje aproximadamente 2 mm alrededor de la muestra en tres lados, y deje 5-6 mm del lado que se unirá al soporte.</li>
	<li>Cubra el lado expuesto de la retina (lado de la membrana) con una gota de OCT. Deje libre el área de fijación.</li>
	<li>Congele la membrana con tejido de la retina. Ahora la muestra está lista para colocarla en un soporte de corte.</li>
	<li>Coloque una gota de OCT en un anillo de soporte frío. Inserte inmediatamente la muestra congelada en la gota.</li>
	<li>Corte secciones de 10-20 μm de grosor, ajustando la temperatura del criostato a -19 °C. Utilice portaobjetos de adhesión de polisina tibios (temperatura ambiente). Deje los portaobjetos con las secciones adjuntas en una plataforma de calentamiento durante ~ 2-3 min (41 ° C) en la oscuridad para garantizar una adherencia firme de las secciones.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en una caja de almacenamiento y manténgalos a -20 °C hasta su uso.</li>
</ol>
7. Inmunotinción de secciones de retina
<ol>
	<li>Saca los portaobjetos con las secciones del congelador. Déjalos reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto para eliminar el condensado.</li>
	<li>Rodee las secciones con un bloqueador de líquidos para crear una barrera para una mayor incubación.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en la caja de incubación. Cubra el fondo de la caja con agua para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos.</li>
	<li>Enjuague con PB durante 5 min.</li>
	<li>Prepare las mismas soluciones de tinción y siga los pasos del paso 5. La incubación con el anticuerpo primario es de una noche y con el secundario de 1 hora. No utilice vidrios rotos entre el cubreobjetos y el portaobjetos.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

La alta biocompatibilidad y transparencia de la membrana de PTFE hidrofilizado en las soluciones es ventajosa cuando se trabaja con tejido vivo. Esta preparación se ha utilizado con éxito en trabajos anteriores para grabaciones de pinzas de parche de respuestas a la luz8-10. Aquí, mostramos cómo se puede adoptar este enfoque para el análisis estructural de la retina de montaje completo.
La técnica de carga en bolo se puede utilizar eficazmente para etiquetar tejido vivo. Esta técnic...

Realizar inmunohistoquímica en tejidos delicados e intactos corre el riesgo de sufrir daños durante la manipulación y la transferencia. Esto puede ocurrir en cortes de cerebro u otro tejido delgado, como la retina degenerada. Además, existen ciertos métodos de fijación de tejidos que pueden ser ventajosos para la inmunotinción de estructuras neuronales, pero que resultan en una estabilidad estructural comprometida, lo que impide su uso. Un ejemplo particular de esto es la fijación basada en carbodiimida, que es superior para teñir los receptores y las hormonas1-7, pero comúnmente se evita debido a la inestabilidad del tejido fijado.
Aquí, describimos un procedimiento que utiliza una membrana de PTFE hidrofilizada para soportar estructuralmente tejido delicado, ya sea fijo o no fijado, para una variedad de técnicas de tinción. La membrana de soporte permite la manipulación de tejido delicado antes y después de la fijación, lo que permite varios pasos de procesamiento y minimiza el riesgo de daño tisular. En general, este método simple para preservar la integridad de los tejidos brinda la oportunidad de utilizar técnicas que de otro modo podrían evitarse. Como tal, este enfoque también podría usarse con éxito para la preparación de una amplia variedad de tejidos, como cortes de cerebro, que se vuelven frágiles después de los procedimientos de corte.

<table><tbody><tr><td>Inserto de cultivo celular Millicell, 12 mm, PTFE hidrófilo (Biopore), 0,4 , 0,4 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Fine</td><td>Science Tools</td><td>15003-08</td> Pinza de <td>disección</td></tr><tr><td>, Dumont #55, acero inoxidable</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>disección</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de microscopio confocal</td><td>Nikon</td><td>varios</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio capilar</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Micropipeter Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo con fondo de vidrio</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia graduadas desechables</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipocillo, 24 pocillos</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, #1</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de adhesión de polisina</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de líquidos</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT medio</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm película de laboratorio</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning grasa de alto vacío</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-PSD95</td><td>Millipore</td><td>Anticuerpo MABN68</td><td></td></tr><tr><td>Burro antiratón Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Isolectina Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de productos químicos</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341738</td><td></td></tr><tr><td>Carbodiimida</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo optimizado para retina preparación wholemount de la imagen y la inmunohistoquímica

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Trabajar con tejido delicado puede ser un factor complicado cuando se realiza una evaluación inmunohistoquímica. Aquí, presentamos un método que utiliza una membrana de PTFE hidrofilizada soportada por anillo para proporcionar soporte estructural tanto al tejido vivo como al fijo durante el procesamiento inmunohistoquímico, lo que permite el uso de una variedad de protocolos que de otro modo causarían daño al tejido. En primer lugar, esto se demuestra con la carga en bolo de marcadores fluorescentes en el tejido vivo de la retina. Este método permite una visualización rápida de las estructuras objetivo, mientras que el soporte de la membrana mantiene la integridad del tejido durante la inyección y permite una fácil transferencia de la preparación para su posterior obtención de imágenes o procesamiento.
En segundo lugar, se describe un procedimiento para la tinción de anticuerpos en tejido fijado con carbodiimida. Aunque la fijación de paraformaldehído es más común, la fijación de carbodiimida proporciona un sustrato superior para la visualización de proteínas sinápticas. Una limitación de la carbodiimida es que el tejido fijo resultante es relativamente frágil; Sin embargo, esto se supera con el uso de la membrana de soporte. El tejido de la retina se utiliza para demostrar estas técnicas, pero se pueden aplicar a cualquier tejido frágil.

Aquí se muestran dos experimentos representativos que se benefician del uso de una membrana de PTFE hidrofilizada para sostener la retina en montaje completo durante los procedimientos de tinción. El primer experimento ilustra el método para la caracterización rápida y sencilla de la vasculatura retiniana, una red compleja de vasos sanguíneos que se extiende a través de múltiples capas retinianas (Figura 2). Este enfoque combina la carga en bolo de isotectina con la etiquetación por inmersión con SRH. Es...

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Este procedimiento utiliza tejido retiniano de ratón para demostrar cómo estabilizar tejido neural delicado y preservar su integridad estructural. Durante varias etapas de la tinción inmunohistoquímica, primero nuclee el ojo, retire la córnea y separe la retina de la esclerótica. Realice incisiones en la copa ocular retiniana para aplanar el tejido.Luego, fije la retina a una membrana reforzada con anillo utilizando una transferencia por succión sin manipulación directa para preservar la integridad del tejido. Ahora transfiera el anillo a una placa de múltiples pocillos para la tinción. Nuestros resultados muestran que esta técnica puede utilizarse eficazmente en tejido vivo y proporciona un sustrato superior para la obtención de imágenes de proteínas sinápticas en comparación con los métodos existentes de manejo de retina diseccionada.Estas técnicas permiten la transferencia de tejidos delicados con una manipulación física mínima. Esto reducirá la posibilidad de distorsión y daño. Tuvimos esta idea por primera vez cuando necesitábamos realizar grabaciones de tejido montado en plano en un ratón RD1, un modelo de degeneración retiniana, y la retina de este ratón es extremadamente delgada y frágil debido a la importante pérdida celular provocada por la mutación Chief.Un posdoctorado de nuestro laboratorio se unirá a mí para demostrar el procedimiento. Primero, enuclearemos los ojos de un ratón anestesiado y transferiremos los ojos a una solución de Ringer tamponada y oxigenada. Para eliminar la córnea, sostenga el ojo en el limbo con pinzas y luego corte un trayecto circular a lo largo de la ora serrata.Extraiga la lente con pinzas para inyecciones en bolo y registros electrofisiológicos. Utilice pinzas de borde suavizado para retirar la mayor cantidad posible de vítreo. Ahora estabilice la copa del ojo sujetando firmemente la esclerótica con pinzas.Coloque un segundo par de pinzas entre la retina y la copa del ojo. Mueva lentamente las pinzas alrededor de la circunferencia. Corte el nervio óptico entre la retina y la copa del ojo, y retire la copa del ojo con tijeras.Realice incisiones desde la periferia retiniana hasta el nervio óptico. Alternativamente, para utilizar toda la retina, haga incisiones desde la periferia hasta la mitad del camino hacia el nervio óptico para acortar el soporte. Retire la parte excesiva con un torno.Luego alise las superficies rugosas con papel de lija fino. Retire los pies de debajo del anillo. Corte la punta estrecha de una pipeta de plástico.Luego, transfiera el tejido con algo de solución a la membrana. Retire gradualmente la solución mientras extiende la retina y despliega el tejido. Ahora, fije la retina a la membrana con las células ganglionares hacia arriba.Corte la punta de sujeción de una jeringa de un mililitro y colóquela directamente debajo del tejido. Tire del émbolo hacia atrás hasta un volumen de aproximadamente 0,3 mililitros para atrapar físicamente el tejido dentro de la membrana. Estire algunos capilares de borosilicato utilizando una resistencia de aproximadamente un megaohmio.Luego rompa suavemente la punta de cada pipeta de parche. A continuación, agregue 0,3 microlitros de la solución de tinción selectina stock a 10 microlitros de la solución amortiguada heaps ringer. Ahora coloque la membrana en la cámara de registro perfundida con solución amortiguada heaps ringer calentada y oxigenada.Coloque la pipeta que contiene el colorante contra la membrana limitante interna utilizando un micromanipulador. Avance más la pipeta para penetrar la membrana limitante interna. A continuación, inyecte la solución de tinción en uno o varios sitios seleccionados.Ahora, permita 10 minutos para que el tejido se recupere de la inyección mientras lo observa bajo iluminación de fluorescencia epiescopia. Si lo desea, transfiera el inserto a una placa de cultivo con fondo de vidrio, colocándolo con la retina hacia abajo. Añada una gota de solución heap para mantener la muestra húmeda.Además, coloque tres puntos de grasa al vacío alrededor del perímetro del anillo de plástico para asegurar firmemente la inserción al plato de cultivo. Transfiera el plato al portaobjetos del microscopio después de la fijación, sumerja la membrana en las soluciones del gradiente de sacarosa. Extraiga la membrana del anillo de inserción de plástico.Retire la mayor cantidad posible de solución con toallitas Kim y colóquela sobre la ampolla con la retina hacia arriba. Transfiera la ampolla con el tejido a la cámara del criostato y agregue una gota de medio OCT. Utilice el dispositivo congelador rápido para acelerar la congelación.Desprenda la muestra congelada y colóquela boca abajo. Ahora corte el exceso de OCT congelado. Deje aproximadamente dos milímetros alrededor de la muestra en tres lados y milímetros desde el lado que será fijado al portaobjetos.Cubra el lado de la retina expuesto con una gota de OCT, dejando el área adherida libre. Congele la membrana que contiene el tejido retiniano. Coloque una gota de OCT sobre un anillo portador frío.Introduzca inmediatamente la muestra congelada en la gota. Corte secciones de 10 a 20 micrómetros a menos 19 grados Celsius y colóquelas sobre portaobjetos de adhesión con polilisina calientes. Coloque los portaobjetos con las secciones adheridas sobre una plataforma de calentamiento a 41 grados Celsius durante dos a tres minutos en la oscuridad.Luego, almacene las muestras a menos 20 grados Celsius. Este experimento ilustra una caracterización rápida y sencilla de la vasculatura retiniana como una red compleja de vasos sanguíneos que se extienden a través de múltiples capas retinianas. Mediante la combinación de una carga en bolo de isolectina con la marcación por inmersión en sulforamida, se puede visualizar y escanear casi inmediatamente el tejido vivo en la retina, permitiendo etiquetar los vasos sanguíneos desde la capa superficial hasta la profunda.En contraste con las moléculas relativamente bien difusibles, la selectina SRH no permea adecuadamente a través de la membrana limitante interna. La fijación con carbimida presenta varias ventajas frente a la fijación convencional con paraformaldehído al marcar proteínas sinápticas; por ejemplo, tras un breve período de fijación con carbimida, la tinción inmunofluorescente para el marcador sináptico PSD-95 en la capa plexiforme interna presentó una apariencia puntiforme brillante, consistente con la distinción de sinapsis individuales.En contraste, al utilizar el fijador convencional de paraformaldehído, la identificación de los componentes sinápticos es menos clara. Se obtuvieron resultados similares en secciones criostáticas de retina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar un tejido delicado sobre esta membrana y cómo aplicar la tinción citoquímica al preparado final.Le tomará 15 minutos adherir la retina al filtro.

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Research

Investigación

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Biology

Biología

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