Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica
13 de diciembre de 2013
El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.
Este procedimiento utiliza tejido retiniano de ratón para demostrar cómo estabilizar tejido neural delicado y preservar su integridad estructural. Durante varias etapas de la tinción inmunohistoquímica, primero nuclee el ojo, retire la córnea y separe la retina de la esclerótica. Realice incisiones en la copa ocular retiniana para aplanar el tejido.
Luego, fije la retina a una membrana reforzada con anillo utilizando una transferencia por succión sin manipulación directa para preservar la integridad del tejido. Ahora transfiera el anillo a una placa de múltiples pocillos para la tinción. Nuestros resultados muestran que esta técnica puede utilizarse eficazmente en tejido vivo y proporciona un sustrato superior para la obtención de imágenes de proteínas sinápticas en comparación con los métodos existentes de manejo de retina diseccionada.
Estas técnicas permiten la transferencia de tejidos delicados con una manipulación física mínima. Esto reducirá la posibilidad de distorsión y daño. Tuvimos esta idea por primera vez cuando necesitábamos realizar grabaciones de tejido montado en plano en un ratón RD1, un modelo de degeneración retiniana, y la retina de este ratón es extremadamente delgada y frágil debido a la importante pérdida celular provocada por la mutación Chief.
Un posdoctorado de nuestro laboratorio se unirá a mí para demostrar el procedimiento. Primero, enuclearemos los ojos de un ratón anestesiado y transferiremos los ojos a una solución de Ringer tamponada y oxigenada. Para eliminar la córnea, sostenga el ojo en el limbo con pinzas y luego corte un trayecto circular a lo largo de la ora serrata.
Extraiga la lente con pinzas para inyecciones en bolo y registros electrofisiológicos. Utilice pinzas de borde suavizado para retirar la mayor cantidad posible de vítreo. Ahora estabilice la copa del ojo sujetando firmemente la esclerótica con pinzas.
Coloque un segundo par de pinzas entre la retina y la copa del ojo. Mueva lentamente las pinzas alrededor de la circunferencia. Corte el nervio óptico entre la retina y la copa del ojo, y retire la copa del ojo con tijeras.
Realice incisiones desde la periferia retiniana hasta el nervio óptico. Alternativamente, para utilizar toda la retina, haga incisiones desde la periferia hasta la mitad del camino hacia el nervio óptico para acortar el soporte. Retire la parte excesiva con un torno.
Luego alise las superficies rugosas con papel de lija fino. Retire los pies de debajo del anillo. Corte la punta estrecha de una pipeta de plástico.
Luego, transfiera el tejido con algo de solución a la membrana. Retire gradualmente la solución mientras extiende la retina y despliega el tejido. Ahora, fije la retina a la membrana con las células ganglionares hacia arriba.
Corte la punta de sujeción de una jeringa de un mililitro y colóquela directamente debajo del tejido. Tire del émbolo hacia atrás hasta un volumen de aproximadamente 0,3 mililitros para atrapar físicamente el tejido dentro de la membrana. Estire algunos capilares de borosilicato utilizando una resistencia de aproximadamente un megaohmio.
Luego rompa suavemente la punta de cada pipeta de parche. A continuación, agregue 0,3 microlitros de la solución de tinción selectina stock a 10 microlitros de la solución amortiguada heaps ringer. Ahora coloque la membrana en la cámara de registro perfundida con solución amortiguada heaps ringer calentada y oxigenada.
Coloque la pipeta que contiene el colorante contra la membrana limitante interna utilizando un micromanipulador. Avance más la pipeta para penetrar la membrana limitante interna. A continuación, inyecte la solución de tinción en uno o varios sitios seleccionados.
Ahora, permita 10 minutos para que el tejido se recupere de la inyección mientras lo observa bajo iluminación de fluorescencia epiescopia. Si lo desea, transfiera el inserto a una placa de cultivo con fondo de vidrio, colocándolo con la retina hacia abajo. Añada una gota de solución heap para mantener la muestra húmeda.
Además, coloque tres puntos de grasa al vacío alrededor del perímetro del anillo de plástico para asegurar firmemente la inserción al plato de cultivo. Transfiera el plato al portaobjetos del microscopio después de la fijación, sumerja la membrana en las soluciones del gradiente de sacarosa. Extraiga la membrana del anillo de inserción de plástico.
Retire la mayor cantidad posible de solución con toallitas Kim y colóquela sobre la ampolla con la retina hacia arriba. Transfiera la ampolla con el tejido a la cámara del criostato y agregue una gota de medio OCT. Utilice el dispositivo congelador rápido para acelerar la congelación.
Desprenda la muestra congelada y colóquela boca abajo. Ahora corte el exceso de OCT congelado. Deje aproximadamente dos milímetros alrededor de la muestra en tres lados y milímetros desde el lado que será fijado al portaobjetos.
Cubra el lado de la retina expuesto con una gota de OCT, dejando el área adherida libre. Congele la membrana que contiene el tejido retiniano. Coloque una gota de OCT sobre un anillo portador frío.
Introduzca inmediatamente la muestra congelada en la gota. Corte secciones de 10 a 20 micrómetros a menos 19 grados Celsius y colóquelas sobre portaobjetos de adhesión con polilisina calientes. Coloque los portaobjetos con las secciones adheridas sobre una plataforma de calentamiento a 41 grados Celsius durante dos a tres minutos en la oscuridad.
Luego, almacene las muestras a menos 20 grados Celsius. Este experimento ilustra una caracterización rápida y sencilla de la vasculatura retiniana como una red compleja de vasos sanguíneos que se extienden a través de múltiples capas retinianas. Mediante la combinación de una carga en bolo de isolectina con la marcación por inmersión en sulforamida, se puede visualizar y escanear casi inmediatamente el tejido vivo en la retina, permitiendo etiquetar los vasos sanguíneos desde la capa superficial hasta la profunda.
En contraste con las moléculas relativamente bien difusibles, la selectina SRH no permea adecuadamente a través de la membrana limitante interna. La fijación con carbimida presenta varias ventajas frente a la fijación convencional con paraformaldehído al marcar proteínas sinápticas; por ejemplo, tras un breve período de fijación con carbimida, la tinción inmunofluorescente para el marcador sináptico PSD-95 en la capa plexiforme interna presentó una apariencia puntiforme brillante, consistente con la distinción de sinapsis individuales.
En contraste, al utilizar el fijador convencional de paraformaldehído, la identificación de los componentes sinápticos es menos clara. Se obtuvieron resultados similares en secciones criostáticas de retina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar un tejido delicado sobre esta membrana y cómo aplicar la tinción citoquímica al preparado final.
Le tomará 15 minutos adherir la retina al filtro.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para la evaluación estructural de preparaciones retinianas en montaje completo utilizando tejido retiniano de ratón. Detalla los procesos de disección, montaje y tinción para preservar la integridad del tejido durante la obtención de imágenes de proteínas sinápticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunohistoquímica
- Biología retiniana
Antecedentes
- La integridad estructural del tejido neural es crucial para obtener imágenes precisas.
- Los métodos existentes pueden comprometer la calidad del tejido durante la disección.
- Los marcadores fluorescentes mejoran la visualización de los componentes celulares.
- La comparación de métodos de fijación es esencial para obtener resultados óptimos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para la preparación de tejido retiniano.
- Evaluar la eficacia de diferentes métodos de fijación.
- Mejorar las técnicas de imagen para proteínas sinápticas.
Métodos Utilizados
- Nucleación del ojo y extracción de la córnea.
- Separación de la retina de la esclerótica y aplanamiento del tejido.
- Fijación de la retina a una membrana mediante transferencia por succión.
- Tinción e imagen de proteínas sinápticas.
Resultados principales
- El protocolo conserva eficazmente la integridad del tejido.
- Los marcadores fluorescentes proporcionan una visualización superior.
- La comparación de métodos de fijación ofrece conocimientos significativos.
- Esta técnica es aplicable a la imagen de tejidos vivos.
Conclusiones
- El método descrito mejora la evaluación estructural del tejido retiniano.
- Ofrece un sustrato confiable para la obtención de imágenes de proteínas sinápticas.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otros tejidos neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo aborda un desafío crítico en el descubrimiento de fármacos en neurociencia: preservar la integridad estructural del tejido neural frágil durante el procesamiento inmunohistoquímico. Al permitir la visualización confiable de proteínas sinápticas y redes vasculares en preparaciones completas de retina, este método apoya la validación de dianas terapéuticas y la reducción de riesgos mecanicistas en modelos de enfermedades neurodegenerativas. El procedimiento mejora la confianza predictiva en ensayos preclínicos al minimizar artefactos de distorsión tisular que podrían confundir las lecturas de interacción con la diana.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de la localización de proteínas sinápticas y de la arquitectura de la vasculatura retiniana en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma estabilizada para la tinción consistente con anticuerpos y la administración de marcadores fluorescentes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas y resueltas espacialmente de puntos de marcadores sinápticos y redes vasculares.
- Valor operativo: Compatible con formatos de placas de múltiples pocillos para protocolos estandarizados de inmunotinción y adquisición de imágenes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Permite la continuidad desde el análisis de tejidos vivos mediante imágenes hasta el análisis de tejidos fijados, para estudios de interacción con el blanco y modulación de vías.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad en las preparaciones histológicas, mejorando la reproducibilidad en evaluaciones preclínicas de eficacia y seguridad.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas en tejido neural hasta la validación preclínica de los efectos de moduladores sobre la integridad sináptica y la función vascular.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir una visualización clara de la distribución de proteínas sinápticas y la integridad de la unidad neurovascular.
- Tamizaje: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles de inmunofluorescencia adecuados para análisis de alto contenido sobre los efectos de compuestos en la estructura retiniana.
- Análisis: Genera métricas de densidad de puntos y de la red vascular que apoyan el análisis comparativo entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Permite correlacionar biomarcadores sinápticos y vasculares retinianos con la progresión preclínica de enfermedades y la respuesta al tratamiento.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de estabilización de tejidos aplicable a múltiples tipos de tejido neural y protocolos de tinción.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del objetivo mediante la visualización inequívoca de sinapsis y vasos sanguíneos en tejido neural frágil.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad del ensayo y reduce las tasas de fallo en el procesamiento inmunohistoquímico de preparaciones delicadas.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance o interrupción al reducir los falsos negativos derivados del daño tisular durante la preparación.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos neuroprotectores basada en lecturas estructurales y funcionales confiables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de disección microquirúrgica y manejo de tejidos.
- Depende del acceso a membranas de PTFE hidrofilizadas con soporte anular y aparatos de transferencia por succión.
- Necesita la estandarización de los protocolos de fijación, tinción y adquisición de imágenes entre diferentes grupos de investigación.
- Implica consideraciones de adaptación según el grosor y la fragilidad variables de los tejidos en distintos modelos neuronales.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de equipo especializado para preparar y mantener el sistema de membranas de soporte.
