Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica
December 13th, 2013
El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.
Este procedimiento utiliza tejido de la retina de ratón para demostrar cómo estabilizar el delicado tejido neural para preservar la integridad estructural. Durante varios pasos de la tinción inmunohistoquímica, primero se nuclea el ojo, se extrae la córnea y se separa la retina de la esclerótica. Haga incisiones en la copa del ojo de la retina para aplanar el tejido.
A continuación, fije la retina a una membrana reforzada por anillo mediante una transferencia por succión sin manipulación directa para preservar la integridad del tejido. Ahora transfiera el anillo a una placa de pocillos múltiples para teñir. Nuestros resultados muestran que esta técnica se puede utilizar de manera efectiva en tejido vivo y proporciona un sustrato superior para la obtención de imágenes de proteínas sinápticas en comparación con los metales existentes para el manejo de retina disecada.
Estas técnicas permiten la transferencia de tejido delicado con una mínima manipulación física. Esto reducirá la posibilidad de distorsión y daño. Tuvimos esta idea por primera vez cuando necesitábamos registrar a partir de tejido plano en RD un ratón, un modelo de degeneración de la retina, y la retina de este ratón es extremadamente delgada y frágil debido a la extensa pérdida de células causada por la mutación Chief.
Un postdoc de nuestro laboratorio se unirá a mí para demostrar el procedimiento. Primero, nuclear los ojos de un ratón anestesiado y transferir los ojos a montones oxigenados de solución de timbre tamponado. Para extirpar la córnea, sostenga el ojo en el limbo con fórceps y luego corte un camino circular a lo largo de la ora serrata.
Extraiga la lente con pinzas para inyecciones en bolo y registros electrofisiológicos. Use pinzas de borde mezcladas para extraer la mayor cantidad de vítreo posible. Ahora estabilice la copa del ojo sujetando la esclerótica firmemente con pinzas.
Coloque un segundo juego de pinzas entre la retina y la copa del ojo. Mueva las pinzas lentamente alrededor de la circunferencia. Corte el nervio óptico entre la retina y la copa ocular y retire la copa ocular con unas tijeras.
Realiza incisiones desde la periferia de la retina hasta el nervio óptico. Alternativamente, para usar toda la retina, haga incisiones desde la periferia hasta la mitad del nervio óptico para acortar el soporte. Retire la parte sobrante con un torno.
A continuación, pula las superficies rugosas con papel de lija fino. Retira los pies de debajo del anillo. Corta la punta estrecha de una pipeta de plástico.
A continuación, transfiera el tejido con un poco de solución a la membrana. Retire gradualmente la solución mientras extiende la retina y despliega el tejido. Ahora une la retina a la membrana con las células ganglionares hacia arriba.
Corta la punta de sujeción de una jeringa de un mililitro y colócala directamente debajo del pañuelo. Tire hacia atrás del émbolo hasta un volumen de aproximadamente 0,3 mililitros para engranar físicamente el tejido dentro de la membrana. Tire de algunas pipetas capilares de silicato de boro con una resistencia de aproximadamente un mega.
A continuación, rompa suavemente la punta de cada pipeta de parche. A continuación, agregue 0,3 microlitros de la solución de tinción de stock selectin a 10 microlitros de la solución de timbre tamponada de montones. Ahora coloque la membrana en la cámara de registro perfundida con pilas oxigenadas tibias con solución de timbre tamponada.
Coloque la pipeta que contiene colorante contra la membrana limitante interna con un manipulador de microm. Avance aún más la pipeta para penetrar en la membrana limitante interna. A continuación, inyecte la solución de tinción en una o varias ubicaciones objetivo.
Ahora espere 10 minutos para que el tejido se recupere de la inyección mientras lo visualiza bajo iluminación de epifluorescencia. Si lo desea, transfiera el inserto a una placa de cultivo con fondo de vidrio, colocándola con la retina hacia abajo. Agregue una gota de solución de montón para mantener la muestra húmeda.
Además, coloque tres puntos de grasa para aspiradora alrededor del perímetro del anillo de plástico para asegurar firmemente el inserto a la placa de cultivo. Transfiera el plato a la etapa del microscopio después de la fijación, sumerja la membrana en las soluciones de gradiente de sacarosa. Extraiga la membrana del anillo de inserción de plástico.
Retire la mayor cantidad de solución posible con toallitas Kim y colóquela en el param con la retina hacia arriba. Transfiera la paraforma con el tejido a la cámara de criostato y agregue una gota de medio OCT. Utilice el dispositivo de congelación rápida para acelerar la congelación.
Separe la muestra congelada y déle la vuelta. A continuación, corte el exceso de OCT congelado. Deje aproximadamente dos milímetros alrededor de la muestra en tres lados y milímetros desde el lado, que se unirá al soporte.
Cubra el lado de la retina expuesto con una gota de OCT dejando libre el área adherida. Congela la membrana que contiene el tejido de la retina. Coloque una gota de OCT en un anillo de soporte frío.
Inserte inmediatamente la muestra congelada en la gota. Corte secciones de 10 a 20 micras a menos 19 grados centígrados y colóquelas en portaobjetos de adhesión de polilisina caliente. Coloque los portaobjetos con las secciones adjuntas en una plataforma de calefacción de 41 grados centígrados durante dos o tres minutos en la oscuridad.
A continuación, almacene las muestras a 20 grados centígrados negativos. Este experimento ilustra una caracterización rápida y sencilla de la vasculatura de la retina como una elaborada red de vasos sanguíneos que se extienden a través de múltiples capas de la retina. Al combinar una carga en bolo de iso selectina con el marcaje de inmersión en sulfa rumina, el tejido vivo se puede visualizar y escanear casi de inmediato en la retina, los vasos sanguíneos se pueden etiquetar desde la capa superficial hasta la profunda.
A diferencia de la relativamente bien difusible, la SRH es selectina y no penetra bien a través de la membrana limitante interna. Existen varias ventajas de la fijación con carbimida sobre la fijación convencional con paraformaldehído al marcar proteínas sinápticas, por ejemplo, después de un corto período de fijación con tinción inmunofluorescente de carbimida para el marcador sináptico. La PSD 95 en la IPL tenía un aspecto puntiagudo brillante consistente con la distinción de las sinapsis individuales.
Por el contrario, cuando se utiliza un fijador de aldehído de paraforma convencional, la identificación de los componentes sinápticos es menos clara. Resultados similares se obtuvieron en las secciones de criostato de retina. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo montar un tejido delicado en esta membrana y cómo aplicar la tinción citoquímica a la preparación un maestro.
Tardarás 15 minutos en conectar la retina al filtro.
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Visión general
Este protocolo describe un método para la evaluación estructural de preparaciones retinales en montaje completo utilizando tejido retinal de ratón. Detalla los procesos de disección, montaje y tinción para preservar la integridad del tejido para la obtención de imágenes de proteínas sinápticas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunohistoquímica
- Biología retinal
Antecedentes
- La integridad estructural del tejido neural es crucial para una obtención de imágenes precisa.
- Los métodos existentes pueden comprometer la calidad del tejido durante la disección.
- Los marcadores fluorescentes mejoran la visualización de los componentes celulares.
- La comparación de métodos de fijación es esencial para obtener resultados óptimos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para la preparación de tejido retinal.
- Evaluar la efectividad de diferentes métodos de fijación.
- Mejorar las técnicas de obtención de imágenes para proteínas sinápticas.
Métodos utilizados
- Núcleo del ojo y eliminación de la córnea.
- Separación de la retina de la esclerótica y aplanamiento del tejido.
- Adhesión de la retina a una membrana mediante transferencia por succión.
- Tinción y obtención de imágenes de proteínas sinápticas.
Principales resultados
- El protocolo preserva eficazmente la integridad del tejido.
- Los marcadores fluorescentes proporcionan una visualización superior.
- La comparación de métodos de fijación proporciona importantes conocimientos.
- Esta técnica es aplicable a la obtención de imágenes de tejido vivo.
Conclusiones
- El método descrito mejora la evaluación estructural del tejido retinal.
- Ofrece un sustrato confiable para la obtención de imágenes de proteínas sinápticas.
- Las aplicaciones futuras pueden extenderse a otros tejidos neurales.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical challenge in neuroscience drug discovery: preserving the structural integrity of fragile neural tissue during immunohistochemical processing. By enabling reliable visualization of synaptic proteins and vascular networks in retinal wholemounts, it supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease models. The method enhances predictive confidence in preclinical assays by minimizing tissue distortion artifacts that could confound target engagement readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic protein localization and retinal vasculature architecture in disease models.
- Operational Value: Provides a stabilized platform for consistent antibody staining and fluorescent marker delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of synaptic marker puncta and vascular networks.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats for standardized immunostaining and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from live tissue imaging to fixed tissue analysis for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in histological preparations, improving reproducibility across preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing in neural tissue to preclinical validation of modulator effects on synaptic integrity and vascular function.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by enabling clear visualization of synaptic protein distribution and neurovascular unit integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immunofluorescence outputs suitable for high-content analysis of compound effects on retinal structure.
- Analytics: Generates puncta density and vascular network metrics that support comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of retinal synaptic and vascular biomarkers with preclinical disease progression and treatment response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue stabilization platform applicable to multiple neural tissue types and staining protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through unambiguous synaptic and vascular visualization in fragile neural tissue.
- Operational Value: Improves assay reproducibility and reduces failure rates in immunohistochemical processing of delicate preparations.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives from tissue damage during preparation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective compounds based on reliable structural and functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and tissue handling techniques.
- Depends on access to ring-supported hydrophilized PTFE membranes and suction transfer apparatus.
- Necessitates standardization of fixation, staining, and imaging protocols across research teams.
- Involves adaptation considerations for varying tissue thickness and fragility across neural models.
- Practical limitations include the need for specialized equipment to prepare and maintain the supporting membrane system.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:50
Mounting onto Hydrophilized PTFE Membrane Insert
3:43
Bolus Injection of Isolectin Alexa 488
5:05
Vertical Sectioning of Membrane-mounted Tissue
6:45
Results: Hydrophilized PTFE Membrane for Wholemount Retina
1:38
Dissection of Wholemount Retina
8:04
Conclusion
