Name: Crónica a largo plazo Pseudomonas aeruginosa Infección de las vías respiratorias en los ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Aprende el método de perlas de agar para establecer infecciones crónicas de Pseudomonas aeruginosa en ratones. Esta técnica permite mantener una carga bacteriana estable durante un mes, facilitando estudios sobre infecciones respiratorias persistentes.

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La investigación en el laboratorio de Bragonzi ha sido financiado por la Fundación de Fibrosis Quística italiana (CFaCore) y UE-F7-2009-223670. Parte de este trabajo se llevó a cabo en ALAMBIQUE, un laboratorio de microscopía avanzada, y la histopatología del ratón se llevó a cabo en la Unidad de Anatomía Patológica (Instituto Científico San Raffaele).

1. Las bacterias Preparación para la infección crónica (de tres y dos días antes de Ratón Challenge) <ol><li> Seleccione el P. apropiada cepa aeruginosa a probar. </li><li> Inocular un asa de siembra de P. aeruginosa de un -80 ° C cultivo madre a una placa de agar de soja Trypticase (TSA) y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Elige una sola colonia e inocular en 5 ml de caldo de soja Trypticase (TSB) en un complemento capsulado tubo de 15 ml y se incuba a 37 ° C durante la noche en una incubadora de agitación a 200 rpm. </li></ol> 2. Incorporación de bacterias en perlas de agar para la infección crónica (un día antes de la infección) <ol><li> Tomar una pequeña alícuota de cultivo de una noche de bacterias, diluidas 1:50 en tampón fosfato salino (PBS) y medir la densidad óptica (DO) a 600 nm. </li><li> Diluir el cultivo bacteriano durante la noche mediante la adición de 2 OD en un nuevo tubo a presión con tapa que contenga 20 ml de TSB fresco. </li><li> Incubar a 37 ° C durante aproximadamente 3 -4 h hasta la fase logarítmica en una incubadora de agitación a 200 rpm, hasta que se alcanza un total de 10-15 OD. </li><li> Mientras tanto, preparar el TSA, hecha de TSB con 1,5% de agar, autoclave y equilibrar a 50 ° C en un baño de agua. Equilibre 150 ml de aceite mineral pesado preautoclaved en un matraz Erlenmeyer a 50 ° C en un baño de agua. </li><li> Una vez que P. aeruginosa llega a la fase de registro, recoger las células bacterianas por centrifugación a 2700 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento bacteriano en 1 ml de PBS estéril y mezclar bien para resuspender completamente el sedimento. </li><li> Mezclar 1 ml de suspensión bacteriana con 9 ml de TSA líquido pre-equilibradas a 50 º C. </li><li> Añadir los 10 ml TSA-p mezcla aeruginosa a aceite mineral pesado (precalentado a 50 ° C) e inmediatamente se agita durante 6 min a temperatura ambiente. La agitación debe producir un vórtice visible en el aceite. </li><li> Enfriar la mezcla a 4 ° C, agitando a la mínima speed durante 35 min (Figura 1). </li><li> Coloque la mezcla de agar-cuentas-petróleo en hielo durante 20 min. </li><li> Transfiera las agar-cuentas en 50 ml tubos Falcon y centrifugar a 2700 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar con precisión el aceite mineral y lavar con PBS estéril seis veces, tal como se describe en el paso 2.11. Después de tres lavados, las perlas pueden ser sedimentan por gravedad en lugar de utilizar la centrífuga. Después del último lavado, volver a suspender las agar-cuentas en ml PBS 20-30. </li><li> Tomar una alícuota de las perlas (aproximadamente 0,5 ml) y asépticamente homogeneizar. </li><li> Tomar 100 l de las perlas homogeneizadas y se diluye en 900 l de PBS estéril. En serie diluir 1:10 a 10 -6. </li><li> Placa de dilución en serie en placas de TSA, incluyendo la muestra sin diluir hasta 10 -6 e incubar las placas a 37 ° C. </li><li> Mida el diámetro del grano usando un microscopio de luz invertido en varios campos. El diámetro del grano debe estar entre 100-200 micras ( <strong&gt; Figura 1). </li><li> Guarde las perlas de la noche a 4 ° C. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Descripción general de la preparación y el ratón cuentas infección agar. P. aeruginosa células se resuspenden en 1 ml de PBS y se añadieron a 9 ml de TSA líquido (50 ° C). Esta mezcla se añade a 150 ml de aceite mineral pesado a 50 ° C en un matraz y se agitó a alta velocidad durante 6 min a temperatura ambiente. Cuando el matraz se enfrió a 4 ° C con una agitación lenta durante 35 min, el agar se solidifica la creación de cuentas, y las bacterias presentes en la mezcla están incrustados en las perlas de agar. Se muestra Detalle de una perla de agar que contiene células bacterianas (A). Después de retirar el aceite mineral con varios lavados con PBS estéril, la suspensión de agar-perlas está listo fo la inoculación en los pulmones de los ratones mediante una inyección intratraqueal (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . 3. Ratones Challenge con Agar-cuentas Declaración de Ética: Este protocolo y experimentación siguen las directrices del comité de cuidado de los animales y la ética del Instituto Científico San Raffaele. <ol><li> Contar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en las placas de TSA para determinar el número de CFU / ml en la suspensión de agar-perlas. Diluir el agar-perlas con PBS estéril a 2-4 x 10 7 UFC / ml para llegar a un inóculo óptimo de 1-2 x 10 6 en 50 l. </li><li> Anestesie C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 semanas de edad) ratones macho con ketamina (50 mg / ml) y xilazina (5 mg / ml) en NaCl al 0,9% administrado en un volumen de 0,002 ml / g de peso corporal por inyección intraperitoneal. NOTA: La anestesia se considera adeqluar cuando el animal se queda quieto en silencio, no responde a los estímulos externos, y tiene corazón constante y la frecuencia respiratoria. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina. Desinfectar el pelaje del ratón con etanol al 70%. </li><li> Exponer la tráquea por un corte vertical de la piel y intubar la tráquea con un catéter flexible mm IV estéril, 22 G 0,9 mm x 25, mantener la atención para retirar el estilete mientras se mueve hacia abajo dentro de la tráquea. Inserte el catéter no demasiado profundamente en la tráquea. Pare antes de llegar a la carina (bifurcación). </li><li> Inmediatamente tomar un volumen de 50 l de agar suspensión de cuentas por una jeringa de 1 ml y adjuntarlo al catéter. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa, permitiendo que las perlas se pueden implantar en el pulmón. Cerrar la incisión con clips de sutura. </li><li> Colocar el animal sobre una almohadilla caliente hasta que esté completamente despierto. </li></ol> 4. Evaluación Ratones <ol><li> Observar los ratones diariamente para detectar signos clínicos que incluyen la calidad del pelaje, la postura,deambulación, y el estado de hidratación. Vigilar el peso corporal al día. Los ratones que pierden ≥ 20% del peso corporal deben ser sacrificados. </li><li> Siga el punto 5 para la recogida del líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y Puntos de 6 o 7 para la recogida de los pulmones y el análisis de UFC totales, el análisis histológico, la respuesta inflamatoria en términos de recuento total y diferencial de células en el BAL, el análisis de citoquinas, y actividad de mieloperoxidasa (MPO). </li></ol> 5. BAL fluido de recogida y análisis <ol><li> La eutanasia a los ratones por inhalación de CO2. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina. Desinfectar el pelaje del ratón con etanol al 70%. </li><li> Exponer la tráquea y la caja torácica por un corte vertical de la piel. Exponer los pulmones cortando el diafragma. </li><li> Inserte un hilo de sutura debajo de la tráquea con unas pinzas y intubar la traquea con un flexible 22 g 0,9 mm x 25 mm sonda estéril, IV. Tire de los dos extremos del hilo de sutura para unir el catheter a la tráquea y anudar el hilo alrededor de la tráquea. </li><li> Tome un volumen de 1 ml de RPMI 1640 utilizando una jeringa de 1 ml y adjuntarlo al catéter. Empuje el émbolo de la jeringa para lavar los pulmones e inmediatamente recuperar el líquido, almacenándolo en un tubo de 15 ml. NOTA: Si citoquinas se van a analizar, agregar inhibidores de la proteasa de RPMI 1640. </li><li> Repita este paso tres veces con un total de 3 ml de RPMI. A partir de ahora, almacenar el líquido de BAL en hielo. Ve a paso 6 de la recolección y analizar pulmones. NOTA: Tenga en cuenta que no todo el líquido se va a recibir (2,8 ml máximo). </li><li> Para la cuantificación de las bacterias presentes en el líquido de BAL, muestrear una pequeña alícuota (300 l), en serie diluir 1:10 en PBS estéril, placa en placas de TSA y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Cuente el total de células usando un microscopio óptico de luz invertida diluyendo una alícuota de la BAL fluido 1:2 con solución Tuerk en una cámara de recuento de células Burker. </li><li> Centrifugar la remaining BAL líquido a 330 xg durante 8 minutos a 4 ° C. Tome el sobrenadante para el análisis de citoquinas ELISA, almacenándolo a -80 ° C. Siga los pasos del 5.10 a 5.13 para el recuento celular diferencial por cytospin. </li><li> Si el sedimento es rojo, lisar los eritrocitos resuspendiendo el sedimento en 250-300 l de tampón de lisis de RBC se diluyeron 1:10 en agua destilada ultra pura durante 3 min. Neutralizar con 2 ml de PBS y centrifugar a 330 xg durante 8 min a 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en medio RPMI 10% de suero bovino fetal (FBS). Utilice un volumen que proporcionará 1 x 10 6 células / ml, basado en el recuento total de células. </li><li> Colocar los portaobjetos de microscopio y filtros en las ranuras apropiadas en el citocentrifugado con los filtros de cartón que se enfrenta el centro de la citospina. Pipetear 150 l de cada muestra en los pocillos apropiados de la cytospin y centrifugar en una citocentrífuga a 300 xg durante 5 min. </li><li> Teñir diapositivas por la tinción de Romanowsky utilizando un kit comercial, de acuerdo con la maciones del fabricante y las instrucciones de como se ha descrito anteriormente 12. Siga los pasos del 05.14 a 05.17 para el análisis de la actividad de MPO. </li><li> Centrifugar el volumen restante de BAL a 380 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 250 l de cloruro de hexadeciltrimetilamonio 0,5% en agua destilada ultra pura para lisar las células. La suspensión puede ser congelada a -20 ° C durante varios días antes de realizar el ensayo. </li><li> Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C y utilizar el sobrenadante para realizar el ensayo de MPO en placas de 96 pocillos, la adición de la muestra por duplicado a cada pocillo y si es necesario, también diluciones adecuadas de la muestra. </li><li> Añadir a cada muestra en los pocillos un volumen igual de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) como sustrato para la peroxidasa. Deje que la reacción se lleve a cabo en la oscuridad durante al menos 5 minutos y hasta que no haya un mayor desarrollo en el color. </li><li> Detener la reacción añadiendo 2 MH 2 SO 4 unND medir la DO a 450 nm. El valor de DO será directamente proporcional a la actividad de peroxidasa. </li></ol> 6. La medición de la carga bacteriana en el Análisis de pulmón y de citoquinas <ol><li> Inmediatamente después de la recolección de fluidos BAL, pulmones especiales del ratón, se enjuagan con PBS estéril, lóbulos separados, los pusieron en un tubo de fondo redondo con 2 ml de PBS estéril y se almacenan en hielo. NOTA: Si citoquinas se van a analizar, añadir inhibidores de la proteasa de PBS a los tubos. </li><li> Asépticamente homogeneizar pulmones, tomar una pequeña alícuota (300 l) del homogeneizado, en serie se diluye 1:10 en PBS, placa en placas de TSA y se incuba a 37 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que la carga total de bacterias de las vías respiratorias será la suma de las UFC se encuentran en el líquido de BAL y pulmón. </li><li> Centrifugar el homogeneizado restante a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Tome el sobrenadante para el análisis de citoquinas ELISA, y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 7. El examen histológico &lt;ol&gt; <li> Realizar el análisis histológico sólo en los pulmones en la que no ha sido cobrado el LBA, para preservar los aspectos y propiedades de pulmón. </li><li> La eutanasia a los ratones por inhalación de CO2. </li><li> Exponer la caja torácica por un corte vertical de la piel, exponer a los pulmones por el corte de la membrana. </li><li> Pulmones Impuestos Especiales, se enjuagan con PBS, se separan los lóbulos, los pusieron en un tubo que contiene formol 5-10 ml 10% tamponada neutra (4% de formaldehído) y se almacena a 4 ° C protegido de la luz. </li><li> Pulmones Insertar en parafina, utilizando procedimientos estándar. </li><li> Cortar 5 micras de espesor secciones usando un microtomo. </li><li> Diapositivas mancha con hematoxilina y eosina y cubren los portaobjetos con un cubreobjetos, de acuerdo con procedimientos estándar. </li><li> Examinar los portaobjetos usando un microscopio de campo claro invertida y adquirir imágenes conectando el microscopio a una cámara. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos críticos en la P. preparación aeruginosa-cuentas y el desafío del ratón se presentan a continuación. La cepa de P. aeruginosa se ​​utiliza para el desafío ratones es crítico. La mortalidad, la infección crónica o aclaramiento pueden diferir significativamente dependiendo de la cepa bacteriana utilizada para el desafío. El P. Se prefirió aeruginosa RP73 cepa clínica sobre la cepa de laboratorio de referencia PAO1 ya que resultó e...

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética causada por mutaciones en el quística regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis gen (CFTR). Este gen codifica para un canal de cloruro expresado en la membrana de la mayoría de las células epiteliales. Bronquiectasia, tapones mucosos y parénquima destrucción causada principalmente por infecciones por Pseudomonas aeruginosa conducen progresivamente a la enfermedad pulmonar grave y la mortalidad en la mayoría de los pacientes con FQ 1. Patogénesis CF entendimiento y el desarrollo de nuevas terapias se basan en el modelo animal con rasgos característicos de la CF. Varios ratones, genéticamente modificados para el gen CFTR, se han generado, pero las limitaciones en la capacidad de estas especies de recapitular la enfermedad de pulmón con FQ como-y varias otras anomalías de órganos observados en los pacientes con FQ han sido ampliamente documentado 2. Desarrollo de la infección es uno de los principales retos en modelo animal CF. Las cl literaturatemprano sugiere que una infección crónica que dura más de un mes sólo puede lograrse si los ratones se inocularon con bacterias incrustadas en un agente de inmovilización tales como agar, agarosa, alginato o algas 3-5. Estos agentes de inmovilización proporcionan las condiciones microaeróbica / anaerobias que permiten que las bacterias crezcan en forma de microcolonias, al igual que el crecimiento de la mucosa de los pacientes con FQ 6. Este modelo de la infección crónica conduce a la persistencia de la bacteria en los pulmones y causar inflamación de las vías respiratorias y daños 7. Sin embargo, dependiendo del método utilizado, la cepa bacteriana y la dosis inoculada en los pulmones, el porcentaje de los ratones infectados crónicos y la carga bacteriana recuperado en los pulmones en diferentes puntos de tiempo pueden diferir considerablemente. En particular, el principal desafío para la infección crónica a largo plazo sigue siendo la baja carga bacteriana de P. aeruginosa y el bajo porcentaje de semana ratones infectados después de la exposición, lo que indica thacélulas bacterianas camisetas se borran progresivamente por el anfitrión. Mediante la selección de la P. aeruginosa RP73 cepa clínica de una colección de cepas CF 8 recabamos baja mortalidad, las lesiones más graves, y un alto porcentaje de infección crónica con una carga bacteriana estable hasta un mes en ratones C57Bl/6NCrl. En este trabajo se detalla la metodología para incluir P. aeruginosa en las perlas de agar; hemos ratones infectados por instilación intratraqueal, se mide la carga bacteriana y citoquinas en los pulmones, se recogió el líquido de BAL y realizado el examen histológico. En general, este protocolo ayudará a los investigadores para abordar cuestiones de importancia fundamental en la patogénesis de 8,9 y probando nuevas terapias contra P. aeruginosa infección crónica 10,11.

<table><tbody><tr><td>Caldo de soja tríptico Bacto</td><td>Dickinson</td><td>211823</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco, granulado</td><td>Becton Dickinson</td><td>214510</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral pesado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de S-(+)-Ketamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1884</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de xilacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml 25 G 5/8 pulgadas; 0,5 mm x 16 mm</td><td>Catéter PIC</td><td>3071250300350</td><td></td></tr><tr><td>22 G 0,9 mm x 25 mm</td><td>Pinzas Becton Dickinson</td><td>381223</td><td></td></tr><tr><td>Graefe - Puntas de 0,5 mm</td><td>Curvas Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras, Iris, 11 cm, rectas</td><td>World Precision Instruments</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>Clips de sutura Fine</td><td>Science Tools</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura rosca</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-40</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasa</td><td>Roche</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Read 102 Burker cámara desechable</td><td>Biosigma</td><td>390497</td><td></td></tr><tr><td>Tuerk solución</td><td>Fluka</td><td>93770</td><td></td></tr><tr><td>RBC tampón de lisis</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Citembudo EZ</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710021</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Portaobjetos de microscopio Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik Equipo de tinción Romanowsky</td><td>Medion Diagnostics</td><td>130832 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de hexadeciltrimetilamonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52366-10G</td><td></td></tr><tr><td>Placa EIA/RIA de 96 pocillos</td><td>Costar</td><td>3590</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5,5'- Tetrametilbencidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8665-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-1L</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponada neutra</td><td>Bio-Optica</td><td>05-01005Q</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxilina no Papanicolau</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M06004</td><td></td></tr><tr><td>Eosina más solución alcohólica</td><td>Bio-Optica</td><td>05-M11007</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>shaking incubadora</td><td>Amerex Instruments</td><td>Steady Shake 757</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Grant</td><td>SUB14</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>Ystral</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>KERN</td><td>440-47N</td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica de bajo costo</td><td>2biol</td><td>LCHP</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de homogeneización</td><td>Ystral</td><td>2366925(pequeño)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan2</td><td></td></tr><tr><td>Cámara (microscopio)</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam MRc5</td><td></td></tr><tr><td>Rotary micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr></tbody></table>

crónica a largo plazo<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; infección de las vías respiratorias en los ratones

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Un modelo de ratón de la infección crónica de la vía aérea es un activo clave en la fibrosis quística (FQ) de investigación, aunque hay una serie de preocupaciones con respecto al modelo en sí. Fases tempranas de la inflamación y la infección han sido ampliamente estudiados utilizando el modelo de agar-perlas de ratón Pseudomonas aeruginosa, mientras que sólo pocos informes se han centrado en la infección crónica a largo plazo in vivo. El reto principal para la infección crónica a largo plazo sigue siendo la baja carga bacteriana de P. aeruginosa y el bajo porcentaje de semana ratones infectados después de la exposición, lo que indica que las células bacterianas se borran progresivamente por el anfitrión. En este trabajo se presenta un método para la obtención de la infección crónica eficiente a largo plazo en ratones. Este método se basa en la incorporación de la P. cepas clínicas aeruginosa en el agar-perlas in vitro, seguido de la instilación intratraqueal en ratones C57Bl/6NCrl. Infección pulmonar bilateral se asocia a sevrales medibles de lectura-outs, incluyendo la pérdida de peso, la mortalidad, la infección crónica, y la respuesta inflamatoria. El P. Se prefirió aeruginosa RP73 cepa clínica sobre la cepa de laboratorio de referencia PAO1 ya que resultó en una mortalidad relativamente baja, las lesiones más graves y mayor infección crónica. P. aeruginosa colonización puede persistir en el pulmón durante más de tres meses. Patología pulmonar murino se asemeja a la de los pacientes con FQ con enfermedad pulmonar crónica avanzada. Este modelo murino imita más estrechamente el curso de la enfermedad humana y puede ser utilizado tanto para los estudios sobre la patogénesis y para la evaluación de nuevas terapias.

Cuando el protocolo se hace correctamente, el P. aeruginosa agar-cuentas medirán entre 100-200 micras y pueden ser observados con un microscopio de luz invertida con la pipeta un pequeño volumen de la suspensión de agar-cuentas en una diapositiva. Células bacterianas individuales son visibles en las perlas de agar, como se muestra en detalle en la figura 1. La elección de P. aeruginosa cepa utilizada en la preparación de agar-perlas es crítica. Figu...

Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer una infección crónica persistente a largo plazo por Pseudomonas aeruginosa en las vías respiratorias de ratones. Esto se logra primero cultivando la cepa bacteriana seleccionada de Pseudomonas aeruginosa. El segundo paso consiste en incorporar las bacterias en pequeñas perlas de agar mezclando las bacterias con agar y aceite mineral a 50 grados Celsius, y luego enfriando la mezcla a cuatro grados Celsius bajo agitación lenta y continua.A continuación, el aceite mineral se elimina mediante varias lavadas con PBS y se homogeniza una alícuota de las perlas de agarosa, que luego se siembra en placas de agar. Para determinar el contenido bacteriano, el paso final consiste en inyectar unos pocos microlitros de la suspensión de perlas de agarosa en la tráquea de ratones para establecer una infección pulmonar crónica por Pseudomonas aeruginosa. Finalmente, el líquido de lavado broncoalveolar y los pulmones pueden recuperarse en diferentes puntos temporales tras el desafío y sembrarse en placas de agar para detectar el porcentaje de ratones infectados crónicamente y la carga bacteriana en las vías respiratorias de los ratones sobrevivientes. La principal ventaja de estos métodos de perlas de agar frente a los métodos existentes es que permiten una infección crónica estable a largo plazo en un alto porcentaje de ratones, lo que conduce a la persistencia de una carga bacteriana estable hasta por un mes.Los métodos AGA proporcionan en el pulmón del ratón una condición microaeróbica que permite a las bacterias crecer en forma de microcolonias. De manera similar al crecimiento en el moco de pacientes con fibrosis quística, estos métodos pueden ayudar a los investigadores a abordar preguntas clave sobre la patogénesis de la fibrosis quística y otras enfermedades respiratorias, así como a probar nuevas terapias contra la infección pulmonar crónica por Pseudomonas aeruginosa. Los métodos también pueden utilizarse para lograr infecciones crónicas con otros patógenos, incluyendo coinfecciones con Burkholderia cepacia o Staphylococcus aureus, o para realizar experimentos de competencia. Quienes demostrarán el procedimiento serán Pheno, una investigadora posdoctoral, y Camil Riva, una estudiante de doctorado en mi laboratorio. Tres días antes del desafío en el ratón, inóculense un asa completa de Pseudomonas aeruginosa desde el cultivo almacenado a -80 grados Celsius en una placa de agar soya tripticasa y séquese a 37 grados Celsius durante la noche.Al día siguiente, tome una colonia individual inoculada en cinco mililitros de caldo de soya tripticasa y siéntela durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador agitador a 200 RPM. A la mañana siguiente, diluya una pequeña alícuota del cultivo bacteriano nocturno en solución salina tamponada con fosfato en una proporción de uno a 50. Luego, mida la densidad óptica a 600 nanómetros.A continuación, diluya la cultivo bacteriano nocturno añadiendo dos OD de la suspensión bacteriana en un nuevo tubo que contiene 20 mililitros de TSB fresco incubado a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres a cuatro horas hasta la fase logarítmica en un incubador con agitación a 200 RPM hasta alcanzar un total de 10 a 50 OD. Una vez que Pseudomonas aeruginosa alcance la fase logarítmica, recolecte las células bacterianas mediante centrifugación a 2.700 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante. Después de eso.Re-suspenda el sedimento bacteriano en un mililitro de PBS estéril y vortexee completamente para resuspenderlo por completo. Luego, mezcle un mililitro de la suspensión bacteriana con nueve mililitros de TSA líquido pre-equilibrado a 50 grados Celsius. Añada esta mezcla al aceite mineral pesado precalentado a 50 grados Celsius.Agite inmediatamente durante seis minutos a temperatura ambiente. La agitación debe producir un vórtice visible en el aceite. Posteriormente, enfríe la mezcla a cuatro grados Celsius, agitando a la velocidad mínima durante 35 minutos.Luego, deje reposar en hielo durante 20 minutos adicionales. Posteriormente, transfiera las perlas de agarosa a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 2.700 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Retire con precisión el aceite mineral y lave el sedimento de perlas de agar con PBS estéril. Repita el procedimiento seis veces tras tres lavados. Las perlas pueden sedimentarse por gravedad en lugar de usar la centrífuga tras el último lavado.ReSuspender las perlas de agar en 20 a 30 mililitros de PBS de forma aséptica y homogeneizar 0,5 mililitros de las perlas. A continuación, diluir 100 microlitros de las perlas homogeneizadas en 900 microlitros de PBS estéril y diluir en serie las perlas seis veces hasta 10 a la menos seis en una proporción de uno a diez.Luego, plaquee la dilución en serie sobre placas de TSA, incluyendo la muestra sin diluir. Diluya la muestra hasta 10 a la menos seis e incube las placas a 37 grados Celsius. Mida el diámetro de las perlas utilizando un microscopio óptico invertido en varios campos.El diámetro de las perlas debe estar entre 100 y 200 micrones antes de la exposición en ratones. Cuente el número de unidades formadoras de colonias en las placas de TSA para determinar el número de UFC por mililitro en la suspensión de perlas de agar. Luego, ajuste el volumen de las perlas de agar a dos o cuatro veces 10 a la séptima UFC por mililitro para alcanzar un inóculo óptimo de una a dos veces 10 a la sexta en 50 microlitros.Coloque un ratón macho de seis a ocho semanas de edad, previamente anestesiado con ketamina y xilacina, en posición supina sobre una almohadilla calefactora y desinfecte su pelaje con etanol al 70%. Exponga la tráquea mediante un corte vertical de la piel. A continuación, use pinzas para separar los músculos que cubren la tráquea.Luego, aspire hasta 50 microlitros de suspensión de microesferas de agar con una jeringa de un mililitro. A continuación, entube la tráquea con un catéter y conecte la jeringa de un mililitro que contiene la suspensión de microesferas de agar al catéter. Presione suavemente el émbolo de la jeringa para permitir que las microesferas se impliquen en el pulmón.Luego cierre la incisión utilizando clips de sutura. En este paso, coloque el ratón sacrificado en posición supina y desinfecte su pelaje con etanol al 70 %.A continuación, exponga la tráquea y la caja torácica mediante un corte vertical de la piel. Después, exponga los pulmones cortando el diafragma. Inserte un hilo de sutura bajo la tráquea utilizando pinzas e intubé la tráquea con un catéter.Luego, jale de los dos extremos del hilo de sutura para fijar el catéter a la tráquea y no el hilo alrededor de la tráquea. Ahora, tome un mililitro del medio de cultivo celular utilizando una jeringa de un mililitro y acóplela al catéter. Presione el émbolo de la jeringa para lavar los pulmones, recupere inmediatamente el líquido y guárdelo en un tubo de 15 mililitros.Repita este paso tres veces con un total de tres mililitros de medio, y luego almacene el líquido de lavado broncoalveolar en hielo para la recolección y el análisis de los pulmones. Extraiga los pulmones del ratón. Enjuáguelos en PBS estéril.Luego separen los lóbulos. Colóquenlos en un tubo de fondo redondo con dos mililitros de PBS estéril y guárdenlos en hielo. Homogenice asépticamente los pulmones y de forma sucesiva.Diluya el homogenato en PBS en una proporción de uno a 10. Luego, plaque diluciones seriadas, incluyendo la muestra sin diluir, en placas de TSA e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Tome el líquido de lavado broncoalveolar del hielo y dilúyalo con solución de Turk en una proporción de uno a dos bajo un microscopio óptico invertido.Cuente el número total de células en una cámara de recuento de células Burker para el recuento diferencial de células. Centrifugue el líquido de lavado broncoalveolar a 330 veces la gravedad durante ocho minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, deseche el sobrenadante y re suspenda el sedimento a una concentración de 1 millón de células por mililitro en medio de cultivo celular que contenga 10% de suero bovino fetal. Coloque las laminillas y los filtros en las ranuras adecuadas del citocentrífugo con los filtros de cartón orientados hacia el centro del aparato.Pipetee 150 microlitros de cada muestra en los pozos correspondientes del citocentrífugo y centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Luego, se debe observar un frotis de células; tras la tinción, se puede realizar el recuento diferencial al microscopio. Esta figura muestra el curso temporal de la infección crónica por Pseudomonas aeruginosa con la cepa de referencia PA O1 y RP 73.CE clínica para cada punto temporal. Los histogramas representan el porcentaje de mortalidad inducida por bacteriemia en rojo y supervivencia en gris, o el porcentaje de animales que eliminaron la infección en blanco y aquellos capaces de establecer una infección crónica en verde. La cepa clínica Pseudomonas aeruginosa RP73 es más eficiente en establecer una infección crónica en comparación con la cepa de laboratorio PAO1.Los ratones supervivientes fueron sacrificados en los momentos indicados y se recolectaron los pulmones, homogenizaron y cultivaron en placas de TSA para determinar la carga bacteriana. Las curvas de crecimiento de las cepas P oh uno y RP 73 en pulmones de ratón muestran que la cantidad de bacterias a los tres días posteriores a la infección es mayor para P oh uno en comparación con RP 73. Luego, a partir de los siete días en adelante, cuando se establece la infección crónica, la carga bacteriana se estabiliza entre 10⁴ y 10⁵ UFC por pulmón para ambas cepas. Tras siete días de infección crónica con la cepa clínica RP 73, se evaluó el reclutamiento de células inflamatorias en el líquido de lavado broncoalveolar.El número de leucocitos totales es considerablemente mayor en ratones infectados con RP 73 en comparación con ratones no infectados. Las células más representadas son los neutrófilos, lo que indica una respuesta considerable del sistema inmunitario innato a la infección crónica. En el cuadro inferior, las flechas indican neutrófilos y un macrófago tal como se observan en un punto de una lámina tras un centrifugado citológico.Se muestran aquí tinciones de hematina y eosina en secciones histológicas de pulmones de ratón tras siete días de infección crónica con la cepa clínica rp. 73. Las perlas indicadas mediante flechas pueden observarse en el lumen bronquial y microcolonias de células bacterianas. En las áreas infectadas, los bronquios y el parénquima pulmonar se caracterizan por el reclutamiento masivo de células inflamatorias.Mientras que las vías respiratorias de un ratón no infectado estaban libres de células inflamatorias, el diámetro y la concentración final de los BES son detalles muy importantes. Para obtener un buen resultado, es fundamental recordar que el tamaño se ve afectado por la velocidad de enfriamiento durante la fase de enfriado, y que la cantidad inicial de bacterias puede influir en la dilución final de las perlas. Además, la selección de una cepa adecuada de pseudomona, que cause baja mortalidad en ratones y un alto porcentaje de infección crónica, minimizará el número de ratones utilizados.Después de la infección de los ratones, se realiza el conteo bacteriano. Además, se puede realizar el análisis de la respuesta inflamatoria en términos de conteo total y diferencial de células, nivel de virus en el líquido bronquial, análisis de citocinas, ensayo de mieloperoxidasa y análisis histológico, con el fin de estudiar la respuesta de la úlcera ante la infección bacteriana. No olvide que al trabajar con patógenos oportunistas como Pseudomonas se deben tomar siempre precauciones y aplicaciones, tales como el uso de guantes, manipulación de las bacterias bajo una cabina de seguridad biológica y empleo de técnicas estériles.El desarrollo de modelos animales adecuados permitió la evaluación preclínica de nuevas moléculas antibacterianas y antiinflamatorias. Este es un paso importante para futuras intervenciones terapéuticas de infecciones pulmonares en pacientes afectados por fibrosis quística u otras enfermedades respiratorias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: de Vries, C. R., et.al. Un modelo de inoculación retardada de la infección crónica de la herida por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra la inoculación tardía de Pseudomonas aeruginosa luminiscente en un ratón con dos heridas dorsales cutáneas de grosor completo cubiertas por un apósito transparente. Esto facilita la formación de biofilm y el establecimiento de infecciones crónicas. El monitoreo regular de bioluminiscencia permite cuantificar la carga...

Desarrollo de un modelo murino de infección cutánea crónica por Pseudomonas aeruginosa 

Hemos desarrollado un modelo de lesión pulmonar en ratón mediante inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa. Este modelo imita la lesión pulmonar durante la neumonía y es clínicamente relevante.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

El objetivo de este protocolo es proporcionar métodos automatizados para cuantificar las patologías pulmonares crónicas en un modelo murino de EPOC. El protocolo incluye la exposición de ratones al humo del cigarrillo (CS), la medición de la función pulmonar, el inflado de los pulmones y el uso de métodos de morfometría para medir el enfisema y la remodelación de las vías respiratorias pequeñas en ratones.

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Este estudio describe la generación exitosa de un nuevo modelo animal de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) exponiendo repetidamente a ratones con altas concentraciones de ozono.

Generación de un modelo de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en ratones por la exposición repetida del ozono

Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.

Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Describimos un protocolo de inoculación retardada para generar infecciones crónicas por heridas en ratones inmunocompetentes.

Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Los ratones son generalmente resistentes a las infecciones por Mycobacterium abscessus, lo que complica el descubrimiento y desarrollo de antibióticos muy necesarios contra las infecciones pulmonares. Aquí, describimos un método de preparación de inóculo e infección intratraqueal que demostró producir una infección sostenida en ratones inmunocompetentes.

Preparación de Mycobacterium abscessus incrustado en perlas de agar para inocular ratones inmunocompetentes por vía intratraqueal

Aprende el método de perlas de agar para establecer infecciones crónicas de Pseudomonas aeruginosa en ratones. Esta técnica permite mantener una carga bacteriana estable durante un mes, facilitando estudios sobre infecciones respiratorias persistentes.

Crónica a largo plazo

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