Crónica a largo plazo

El objetivo general de este procedimiento es establecer una infección crónica persistente a largo plazo por Pseudomonas aeruginosa en las vías respiratorias de ratones. Esto se logra primero cultivando la cepa bacteriana seleccionada de Pseudomonas aeruginosa. El segundo paso consiste en incorporar las bacterias en pequeñas perlas de agar mezclando las bacterias con agar y aceite mineral a 50 grados Celsius, y luego enfriando la mezcla a cuatro grados Celsius bajo agitación lenta y continua.

A continuación, el aceite mineral se elimina mediante varias lavadas con PBS y se homogeniza una alícuota de las perlas de agarosa, que luego se siembra en placas de agar. Para determinar el contenido bacteriano, el paso final consiste en inyectar unos pocos microlitros de la suspensión de perlas de agarosa en la tráquea de ratones para establecer una infección pulmonar crónica por Pseudomonas aeruginosa. Finalmente, el líquido de lavado broncoalveolar y los pulmones pueden recuperarse en diferentes puntos temporales tras el desafío y sembrarse en placas de agar para detectar el porcentaje de ratones infectados crónicamente y la carga bacteriana en las vías respiratorias de los ratones sobrevivientes. La principal ventaja de estos métodos de perlas de agar frente a los métodos existentes es que permiten una infección crónica estable a largo plazo en un alto porcentaje de ratones, lo que conduce a la persistencia de una carga bacteriana estable hasta por un mes.

Los métodos AGA proporcionan en el pulmón del ratón una condición microaeróbica que permite a las bacterias crecer en forma de microcolonias. De manera similar al crecimiento en el moco de pacientes con fibrosis quística, estos métodos pueden ayudar a los investigadores a abordar preguntas clave sobre la patogénesis de la fibrosis quística y otras enfermedades respiratorias, así como a probar nuevas terapias contra la infección pulmonar crónica por Pseudomonas aeruginosa. Los métodos también pueden utilizarse para lograr infecciones crónicas con otros patógenos, incluyendo coinfecciones con Burkholderia cepacia o Staphylococcus aureus, o para realizar experimentos de competencia. Quienes demostrarán el procedimiento serán Pheno, una investigadora posdoctoral, y Camil Riva, una estudiante de doctorado en mi laboratorio. Tres días antes del desafío en el ratón, inóculense un asa completa de Pseudomonas aeruginosa desde el cultivo almacenado a -80 grados Celsius en una placa de agar soya tripticasa y séquese a 37 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, tome una colonia individual inoculada en cinco mililitros de caldo de soya tripticasa y siéntela durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador agitador a 200 RPM. A la mañana siguiente, diluya una pequeña alícuota del cultivo bacteriano nocturno en solución salina tamponada con fosfato en una proporción de uno a 50. Luego, mida la densidad óptica a 600 nanómetros.

A continuación, diluya la cultivo bacteriano nocturno añadiendo dos OD de la suspensión bacteriana en un nuevo tubo que contiene 20 mililitros de TSB fresco incubado a 37 grados Celsius durante aproximadamente tres a cuatro horas hasta la fase logarítmica en un incubador con agitación a 200 RPM hasta alcanzar un total de 10 a 50 OD. Una vez que Pseudomonas aeruginosa alcance la fase logarítmica, recolecte las células bacterianas mediante centrifugación a 2.700 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante. Después de eso.

Re-suspenda el sedimento bacteriano en un mililitro de PBS estéril y vortexee completamente para resuspenderlo por completo. Luego, mezcle un mililitro de la suspensión bacteriana con nueve mililitros de TSA líquido pre-equilibrado a 50 grados Celsius. Añada esta mezcla al aceite mineral pesado precalentado a 50 grados Celsius.

Agite inmediatamente durante seis minutos a temperatura ambiente. La agitación debe producir un vórtice visible en el aceite. Posteriormente, enfríe la mezcla a cuatro grados Celsius, agitando a la velocidad mínima durante 35 minutos.

Luego, deje reposar en hielo durante 20 minutos adicionales. Posteriormente, transfiera las perlas de agarosa a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 2.700 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.

Retire con precisión el aceite mineral y lave el sedimento de perlas de agar con PBS estéril. Repita el procedimiento seis veces tras tres lavados. Las perlas pueden sedimentarse por gravedad en lugar de usar la centrífuga tras el último lavado.

ReSuspender las perlas de agar en 20 a 30 mililitros de PBS de forma aséptica y homogeneizar 0,5 mililitros de las perlas. A continuación, diluir 100 microlitros de las perlas homogeneizadas en 900 microlitros de PBS estéril y diluir en serie las perlas seis veces hasta 10 a la menos seis en una proporción de uno a diez.

Luego, plaquee la dilución en serie sobre placas de TSA, incluyendo la muestra sin diluir. Diluya la muestra hasta 10 a la menos seis e incube las placas a 37 grados Celsius. Mida el diámetro de las perlas utilizando un microscopio óptico invertido en varios campos.

El diámetro de las perlas debe estar entre 100 y 200 micrones antes de la exposición en ratones. Cuente el número de unidades formadoras de colonias en las placas de TSA para determinar el número de UFC por mililitro en la suspensión de perlas de agar. Luego, ajuste el volumen de las perlas de agar a dos o cuatro veces 10 a la séptima UFC por mililitro para alcanzar un inóculo óptimo de una a dos veces 10 a la sexta en 50 microlitros.

Coloque un ratón macho de seis a ocho semanas de edad, previamente anestesiado con ketamina y xilacina, en posición supina sobre una almohadilla calefactora y desinfecte su pelaje con etanol al 70%. Exponga la tráquea mediante un corte vertical de la piel. A continuación, use pinzas para separar los músculos que cubren la tráquea.

Luego, aspire hasta 50 microlitros de suspensión de microesferas de agar con una jeringa de un mililitro. A continuación, entube la tráquea con un catéter y conecte la jeringa de un mililitro que contiene la suspensión de microesferas de agar al catéter. Presione suavemente el émbolo de la jeringa para permitir que las microesferas se impliquen en el pulmón.

Luego cierre la incisión utilizando clips de sutura. En este paso, coloque el ratón sacrificado en posición supina y desinfecte su pelaje con etanol al 70 %.

A continuación, exponga la tráquea y la caja torácica mediante un corte vertical de la piel. Después, exponga los pulmones cortando el diafragma. Inserte un hilo de sutura bajo la tráquea utilizando pinzas e intubé la tráquea con un catéter.

Luego, jale de los dos extremos del hilo de sutura para fijar el catéter a la tráquea y no el hilo alrededor de la tráquea. Ahora, tome un mililitro del medio de cultivo celular utilizando una jeringa de un mililitro y acóplela al catéter. Presione el émbolo de la jeringa para lavar los pulmones, recupere inmediatamente el líquido y guárdelo en un tubo de 15 mililitros.

Repita este paso tres veces con un total de tres mililitros de medio, y luego almacene el líquido de lavado broncoalveolar en hielo para la recolección y el análisis de los pulmones. Extraiga los pulmones del ratón. Enjuáguelos en PBS estéril.

Luego separen los lóbulos. Colóquenlos en un tubo de fondo redondo con dos mililitros de PBS estéril y guárdenlos en hielo. Homogenice asépticamente los pulmones y de forma sucesiva.

Diluya el homogenato en PBS en una proporción de uno a 10. Luego, plaque diluciones seriadas, incluyendo la muestra sin diluir, en placas de TSA e incube a 37 grados Celsius durante la noche. Tome el líquido de lavado broncoalveolar del hielo y dilúyalo con solución de Turk en una proporción de uno a dos bajo un microscopio óptico invertido.

Cuente el número total de células en una cámara de recuento de células Burker para el recuento diferencial de células. Centrifugue el líquido de lavado broncoalveolar a 330 veces la gravedad durante ocho minutos a cuatro grados Celsius. A continuación, deseche el sobrenadante y re suspenda el sedimento a una concentración de 1 millón de células por mililitro en medio de cultivo celular que contenga 10% de suero bovino fetal. Coloque las laminillas y los filtros en las ranuras adecuadas del citocentrífugo con los filtros de cartón orientados hacia el centro del aparato.

Pipetee 150 microlitros de cada muestra en los pozos correspondientes del citocentrífugo y centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Luego, se debe observar un frotis de células; tras la tinción, se puede realizar el recuento diferencial al microscopio. Esta figura muestra el curso temporal de la infección crónica por Pseudomonas aeruginosa con la cepa de referencia PA O1 y RP 73.

CE clínica para cada punto temporal. Los histogramas representan el porcentaje de mortalidad inducida por bacteriemia en rojo y supervivencia en gris, o el porcentaje de animales que eliminaron la infección en blanco y aquellos capaces de establecer una infección crónica en verde. La cepa clínica Pseudomonas aeruginosa RP73 es más eficiente en establecer una infección crónica en comparación con la cepa de laboratorio PAO1.

Los ratones supervivientes fueron sacrificados en los momentos indicados y se recolectaron los pulmones, homogenizaron y cultivaron en placas de TSA para determinar la carga bacteriana. Las curvas de crecimiento de las cepas P oh uno y RP 73 en pulmones de ratón muestran que la cantidad de bacterias a los tres días posteriores a la infección es mayor para P oh uno en comparación con RP 73. Luego, a partir de los siete días en adelante, cuando se establece la infección crónica, la carga bacteriana se estabiliza entre 10⁴ y 10⁵ UFC por pulmón para ambas cepas. Tras siete días de infección crónica con la cepa clínica RP 73, se evaluó el reclutamiento de células inflamatorias en el líquido de lavado broncoalveolar.

El número de leucocitos totales es considerablemente mayor en ratones infectados con RP 73 en comparación con ratones no infectados. Las células más representadas son los neutrófilos, lo que indica una respuesta considerable del sistema inmunitario innato a la infección crónica. En el cuadro inferior, las flechas indican neutrófilos y un macrófago tal como se observan en un punto de una lámina tras un centrifugado citológico.

Se muestran aquí tinciones de hematina y eosina en secciones histológicas de pulmones de ratón tras siete días de infección crónica con la cepa clínica rp. 73. Las perlas indicadas mediante flechas pueden observarse en el lumen bronquial y microcolonias de células bacterianas. En las áreas infectadas, los bronquios y el parénquima pulmonar se caracterizan por el reclutamiento masivo de células inflamatorias.

Mientras que las vías respiratorias de un ratón no infectado estaban libres de células inflamatorias, el diámetro y la concentración final de los BES son detalles muy importantes. Para obtener un buen resultado, es fundamental recordar que el tamaño se ve afectado por la velocidad de enfriamiento durante la fase de enfriado, y que la cantidad inicial de bacterias puede influir en la dilución final de las perlas. Además, la selección de una cepa adecuada de pseudomona, que cause baja mortalidad en ratones y un alto porcentaje de infección crónica, minimizará el número de ratones utilizados.

Después de la infección de los ratones, se realiza el conteo bacteriano. Además, se puede realizar el análisis de la respuesta inflamatoria en términos de conteo total y diferencial de células, nivel de virus en el líquido bronquial, análisis de citocinas, ensayo de mieloperoxidasa y análisis histológico, con el fin de estudiar la respuesta de la úlcera ante la infección bacteriana. No olvide que al trabajar con patógenos oportunistas como Pseudomonas se deben tomar siempre precauciones y aplicaciones, tales como el uso de guantes, manipulación de las bacterias bajo una cabina de seguridad biológica y empleo de técnicas estériles.

El desarrollo de modelos animales adecuados permitió la evaluación preclínica de nuevas moléculas antibacterianas y antiinflamatorias. Este es un paso importante para futuras intervenciones terapéuticas de infecciones pulmonares en pacientes afectados por fibrosis quística u otras enfermedades respiratorias.