Name: Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células endoteliales del cerebro anterior embrionario mediante separación magnética con microesferas CD31. Este método genera poblaciones puras para estudiar angiogénesis cerebral e interacciones neurovasculares.

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Este trabajo fue apoyado por una Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD) Young Investigator Award y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01NS073635 a AV.

1. Preparación de los reactivos y soluciones <ol><li> El recubrimiento de 35 mm de placa de cultivo: Colágeno Tipo 1 solución se suministra como una solución acuosa en 20 mM de ácido acético (~ proteína de 100 mg / vial). Diluir un volumen apropiado de solución de colágeno a una concentración de trabajo de 0,01% usando agua de calidad de cultivo de tejido estéril. Platos capa con 1 ml de solución de colágeno durante 3-4 horas a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la noche a 2-8 º C. Retire el exceso de solución de la placa recubierta y deje que se seque durante la noche. Enjuague el recipiente con agua de calidad de cultivo de tejidos o PBS antes de la adición de medios de comunicación. Placas revestidas se pueden almacenar a 4 ° C durante un mes. </li><li> Preparar medio Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM). Complementar la DMEM (500 ml) con 10% de FBS y solución de antibiótico-antimicótico (concentración 1x; 1 ml/100 ml). DMEM completo se puede almacenar a 4 ° C durante dos meses. </li><li> Prepare una parte alícuota (50 ml) de DMEM con DNasa I (0,001 mg / ml), (a que se refiere como DMEM-DNasa I). </li><li> Preparar otra alícuota (10 ml) de DMEM con colagenasa y dispasa (1 mg / ml) (referido como DMEM-collagenase/dispase). </li><li> Preparar endotelial medio de cultivo celular (ECCM, 500 ml), suplementado con EGF (5 g), DE ECG (100 mg) y 5 l de solución de antibiótico-antimicótico. ECCM se puede almacenar a 4 ° C durante dos meses. </li><li> Precalentar todos los medios de comunicación antes de su uso. </li><li> Preparar tampón de purificación: PBS, pH 7.2 con 0.5% BSA y 2 mM de EDTA. Mantener tampón frío (2-8 ° C). </li></ol> 2. La eliminación de los embriones y la disección de Telencéfalo Todos los experimentos con animales de laboratorio han sido aprobados por los comités de cuidado y uso de animales de Hospital McLean y se ajustan a las directrices del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. <ol><li> Utilice ratones CD1 embarazadas cronometrados (día embrionario 15). El día del descubrimiento tapón vaginal se considera el día embrionario 0 (E0). Presas CD1 generalmente producen camadas grandes, por lo que 10 a 12 embrioness se espera de una presa embarazada. </li><li> Para histerotomía, anestesiar a los ratones embarazadas con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg). Para los ratones aproximadamente 20-30 g, entregar 0,3 ml de una solución anestésica 10 ml / kg de ketamina / xilazina y asegurarse de que el dolor y la angustia es mínima durante las inyecciones intraperitoneales de la anestesia. Utilice la restricción de mano para las inyecciones. </li><li> Compruebe anestesia profunda por pizca dedo del pie. Retire los embriones de los ratones anestesiados profundamente. Decapita a cada embrión inmediatamente después de retirarlos de la madre. Coloque las cabezas de embriones en placas de Petri estériles en hielo frío PBS. </li><li> Siga la histerectomía por eutanasia inmediata con sobredosis de anestesia (130 mg / kg de pentobarbital, IP), un método para la eutanasia, que es coherente con las Directrices AVMA de eutanasia de Animales: 2013 Edition. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico, retire el cerebro de la cabeza con unas tijeras MicroTip finas y unas pinzas finas. Nota: Una disección de alta calidadion es esencial para eliminar con éxito la membrana de la pía madre del cerebro embrionario. Esto se logra mediante la práctica. Bellas pinzas y tijeras MicroTip también son herramientas clave para conseguir una buena disección. </li><li> Utilice las pinzas para obtener un firme control sobre el cerebro y las tijeras MicroTip para despegar la membrana pial. Retire el mesencéfalo y metencephalon y aislar el telencéfalo. Traslado telencéfalo-pial libre de todos los embriones a una placa de cultivo de 35 mm con 2 ml de PBS en hielo. </li></ol> 3. El aislamiento de la célula <ol><li> Picar el telencéfalo en fragmentos de 1-2 mm con una hoja de bisturí y recoger el tejido en un tubo Falcon de 15 ml que contiene 2 ml de DMEM completo. </li><li> Disociar el tejido suave pero completamente con una pipeta de 1 ml hasta grumos desaparecen y se consigue una suspensión lechosa. </li><li> Centrifugar las células disociadas a 800-1.000 xg durante 5 min a TA. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante y el sedimento se vuelve a suspender en DMEM-DNasa I. suavemente disociar la ceLLS de nuevo utilizando 1 ml de la pipeta y se centrifuga a 800-1.000 xg durante 5 min a TA. </li><li> Resuspender el precipitado en caliente DMEM completo. Las células de filtro a través de una malla de nylon de 70 micras estéril. Recoger las células filtradas y mantenerse en hielo. </li><li> Recoge las proporciones de células retenidas en la malla y digerir más con DMEM-collagenase/dispase (2 ml) durante 1-2 minutos a temperatura ambiente. Lavar las células 3 veces en DMEM-DNasa I a través de centrifugación a 800-1.000 xg durante 5 min a TA. Reunir estas células con las células filtradas recogidos en el paso 3.5. Lavar las células una vez con un total de DMEM completo. Procederá a determinar el número de células y medidas de etiquetado magnéticos. Nota: Es importante para obtener una suspensión de células individuales antes de su etiquetado magnético. </li></ol> 4. Etiquetado magnético <ol><li> Este protocolo muestra el etiquetado magnético de 10 7 células. Para el número de células inferior a 10 7, utilice el mismo volumen de reactivo y para el número de células mayor que 10 7, la escala de todos los volúmenes de reactivo y el volumen totalen consecuencia (por ejemplo, para 2 x 10 7 células totales, utilizar dos veces el volumen de todos los reactivos indicados). Mantenga todos los reactivos y las células en hielo. </li><li> Determinar el número de células con un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 10 min a TA. Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Añadir 90 μl/10 7 células de tampón de purificación para el sedimento de células seguido de 10 l de microperlas CD31. Los Microbeads proporcionadas por el fabricante se conjugan al anticuerpo monoclonal anti-CD31 de ratón. </li><li> Mezclar bien e incubar durante 15 min en la nevera. Nota: Las temperaturas más altas y / o un mayor tiempo de incubación durante etiquetado magnética pueden dar lugar a la unión no específica. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 1-2 ml/10 7 células de tampón de purificación y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retire las células sobrenadante y resuspender en 500 l de tampón de purificación. Proceder a la separación magnética o etapa de purificación. </li></ol> 5. Purificación <ol><li> Colocar la columna de la EM en el campo magnético del separador MACS. </li><li> Enjuague la columna con 500 l de tampón de purificación. </li><li> Aplicar la suspensión celular en la columna. Carga número apropiado de células a la columna de MS como el número de células más alta puede obstruir la columna. Precaución: Cada columna MS puede acomodar a un número máximo de 2 x 10 7 celdas, para un número mayor de células, utilizar más columnas. </li><li> Recoger y desechar de flujo continuo que contiene células no marcadas. </li><li> Lavar la columna con 500 l de tampón de purificación tres veces. Durante las etapas de lavado, asegúrese de que el depósito de la columna esté vacía antes de la adición de alícuotas sucesivas tampón de purificación. </li><li> Retire la columna del separador de MACS y colocarlo en un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Un émbolo se suministra junto con la columna de la MS. Pipetear 1 ml de tampón de purificación en la columna de la MS y de inmediato a eliminar las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo en la columna. </li><li> Cel Platels en una placa de cultivo de 35 mm recubierto previamente con colágeno de tipo 1 y crecer las células en ECCM en una incubadora a 37 ° C con 95% de O2 y 5% de CO 2. </li><li> Cambiar el medio cada cuatro días. Utilice PVECs para experimentos o subcultura después de 10-12 días cuando el plato es confluente. </li></ol> 6. Subcultura de PV ECS <ol><li> Retire el CCME y enjuague la monocapa de PVECS con 1-2 ml de PBS estéril. </li><li> Añadir con cuidado 1,5 ml de solución de tripsina-EDTA 0,25% para cubrir la monocapa de células. </li><li> Devuelva el plato a la incubadora. Dentro de 5-7 minutos, las células se separará de la superficie del plato. </li><li> Después las células se han separado, añadir inmediatamente un volumen igual de inhibidor de la tripsina y se tritura varias veces. </li><li> Transferir las células a un tubo Falcon de 15 ml estéril. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de precalentado ECCM. </li><li> Sembrar las células para la expansión de la cultura, el imenvejecimiento u otros ensayos. </li></ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

De PVEC son fisiológicamente más relevantes de adultos células endoteliales cerebrales y EC de otras fuentes de tejidos para estudios que se centran en las interacciones neurovasculares y también tienen un potencial terapéutico. Para la preparación PVEC, es principio fundamental con la disección que trabajar rápido para lograr una buena viabilidad ya que las células muertas se pueden unir de forma no específica a microperlas CD31. Además, si la suspensión de una sola célula no se consigue antes de la etapa de marcaje ma...

La angiogénesis, la neurogénesis y la migración neuronal son eventos críticos en el sistema nervioso central (SNC) el desarrollo, la reparación y la regeneración. Varios estudios elegantes han demostrado que las células endoteliales estimula la proliferación neuronal y viceversa a través de la liberación de factores solubles y por contacto directo. Encontramos curioso que en la mayoría de estos estudios 1-3, mientras que progenitoras neuronales células madre neurales / están aislados del cerebro embrionario, que se co-cultivaron con células endoteliales del cerebro adulto, otras fuentes de tejidos adultos, o con líneas de células endoteliales. Esto podría ser en parte debido a las dificultades técnicas asociadas con el aislamiento y el cultivo de poblaciones puras de células endoteliales del cerebro embrionario. Sin embargo, la angiogénesis, la neurogénesis, y la migración neuronal son eventos concurrentes que ocurren en órdenes de magnitud más robusto en el cerebro embrionario que en el cerebro adulto normal. La red vascular periventricular del embryonic cerebro anterior (telencéfalo) se origina a partir de un recipiente situado en el primordio ganglios basales y se desarrolla en la forma de un gradiente ordenada de ventral a dorsal telencéfalo por día embrionario 11 (E11) de 4,5. Este plexo de vasos de la red vascular periventricular son distintos de los buques de pial basada en orígenes, localización anatómica, patrones de crecimiento y regulación del desarrollo 4,5. La dirección de propagación de la pendiente de la angiogénesis periventricular coincide con el gradiente transversal neurogenetic telencephalic. Dentro del telencéfalo, el gradiente de la angiogénesis periventricular y el gradiente de las neuronas GABA que migran tangencialmente superpone espacialmente y 6. Con respecto a la sincronización, el gradiente de la angiogénesis es antes de la pendiente y de la neurona de GABA gradiente neurogenético en aproximadamente un día. Así, las células endoteliales periventriculares son espacial y temporalmente en buena posición para proporcionar señales vitales para ayudar en la neurogénesis y telencephalic4,6 migración neuronal. Por lo tanto, el uso de células endoteliales periventriculares embrionarias en experimentos de cocultivo con células progenitoras y / o neuronas neuronales proporcionaría un modelo más favorable para el estudio de interacciones neurovasculares y el desarrollo de nuevas vías para el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa o una lesión cerebral isquémica / traumática. Hacemos hincapié en la importancia de eliminar la membrana pial, no sólo para limitar la contaminación de las células epiteliales, sino también para separar las células endoteliales pial que son molecularmente y funcionalmente distinta de las células endoteliales de la red vascular periventricular 4,6 (PVECs denominados de distinguir de pial EC) . Aquí se describe el método que utilizamos habitualmente en nuestro laboratorio para obtener un rendimiento rica y pura de PVECs. Estas células endoteliales se preparan a partir de prosencéfalos embrionarios aislados a partir de un solo ratón temporizado-embarazada. Se pueden expandir, subcultivaron, y congelaron con éxito para su uso futuro.

<table><tbody><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colágeno, solución tipo 1 de cola de rata &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Productos biológicos de calidad DPBS</td><td></td><td>114057-131</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Columna MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microperlas CD31</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Separador MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MACS multi stand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro de células 70 &micro; m</td><td>BD Biociencia</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución antibiótica y antimicótica</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenasa/Dispasa</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 35 mm</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de halcón de 15 ml&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit ECCM</td><td>BD Bioscience</td><td>355054</td><td>kit Incluye suplemento de crecimiento de células endoteliales, EGF y suplemento de</td></tr><tr><td>crecimiento de células endoteliales (ECGS)</td> inhibidor de tripsina de sojaBD <td>Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aplicaciones de celda</td> <td>RBECGM</td><td>R819-500</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologías de vida GlutaMAX</td><td></td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo de tejidos</td><td>Life Technologies</td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.25% Tripsina Life</td><td>Technologies</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina de soja</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Kit de etiquetado de celdas Life Technologies</td><td></td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Membrana plasmática CellLight-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo de isolectina B4 biotinilado</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Factor anti-Von Willebrand</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Medios de montaje rígidos VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Butler Schein Suministro de Salud Animal</td><td>44028</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de micropunta fina</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Células endoteliales cerebrales embrionarias pueden servir como una herramienta importante en el estudio de la angiogénesis y el desarrollo neuro-vascular y las interacciones. Las dos redes vasculares del cerebro anterior embrionario, pial y periventricular, son espacialmente distintivo y tienen diferentes orígenes y patrones de crecimiento. Las células endoteliales de las redes vasculares pial y periventriculares tienen perfiles de expresión de genes únicos y funciones. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el aislamiento, la cultura, y la verificación de las poblaciones puras de células endoteliales de la red vascular periventricular (PVECs) del cerebro anterior embrionario (telencéfalo). En este enfoque, telencéfalo desprovisto de membrana de la pía madre obtenido a partir de día embrionario 15 ratones se pica, se digirió con colagenasa / dispasa, y se dispersa mecánicamente en una suspensión de células individuales. PVECs se purificaron a partir de la suspensión celular utilizando selección positiva con el anticuerpo conjugado con microperlas anti-CD-31/PECAM-1 usando un fuerte magnéticamétodo de separación. Las células purificadas se cultivan en placas de cultivo de colágeno 1 recubiertas en medio de cultivo de células endoteliales hasta que se vuelven confluentes y más subcultivado. PVECs obtiene con este protocolo de adoquines de exposiciones y fenotipos en forma de huso, como se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. Pureza de los cultivos PVEC se estableció con marcadores de células endoteliales. En nuestras manos, este método produce de forma fiable y consistente poblaciones puras de PVECs. Este protocolo se beneficiarán los estudios dirigidos a la obtención de conocimientos sobre mecánica en angiogénesis cerebro anterior, la comprensión de las interacciones PVEC y cruzadas las conversaciones con los tipos de células neuronales y tiene un enorme potencial para angiogénesis terapéutica.

La caracterización fenotípica de PVECs de días 1-12 se muestra con contraste de fase microscopía de luz (Figura 2). Las células unidas a la placa en el día 1 muestran la morfología característica de la división celular (Figura 2A). Entre 5-8 días, PVECs transición de la piedra del adoquín de husillo morfología en forma típica de las células endoteliales y más afín a su estado in vivo (Figuras 2B y 2C). Durante el día 12 la cultura PVEC logre la...

Este video muestra una estrategia fácil y confiable para la preparación de cultivos puros de células endoteliales del cerebro anterior embrionario dentro de 10 a 12 días y será útil para la investigación se centró en muchos aspectos de la angiogénesis cerebral.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar cultivos puros de células endoteliales a partir de cuatro cerebros embrionarios para estudiar la angiogénesis cerebral y las interacciones neurovasculares. Esto se logra primero separando la membrana perivascular y aislando el cefalón de los cerebros embrionarios. El segundo paso del procedimiento consiste en obtener una suspensión de células individuales mediante la disociación, filtración y digestión del tejido recolectado.El tercer paso consiste en etiquetar magnéticamente las células utilizando microperlas CD 31. Los pasos finales son purificar las células etiquetadas con CD 31 mediante separación magnética y luego cultivarlas. Finalmente, se obtienen poblaciones puras de células endoteliales paraventriculares para su posterior estudio mediante microscopía de inmunofluorescencia y ensayos de angiogénesis.Este método beneficiará los estudios centrados en mecanismos celulares y moleculares. Para el anis cerebral, puede servir como una herramienta para elucidar las interacciones entre células endoteliales ventriculares y el crosstalk con tipos celulares neuronales. También posee un potencial enorme para la misión terapéutica del anis.La demostración de este método es fundamental para eliminar algunas de las dificultades técnicas asociadas con el aislamiento y cultivo de poblaciones puras de células endoteliales a partir de embriones cerebrales. Para este protocolo, tenga listas cabezas de crías E15 procedentes de hembras CD1 en PBS frío sobre hielo bajo un estereoscopio. Retire los cerebros utilizando tijeras de punta fina y pinzas delicadas.Una disección adecuada es fundamental y se adquiere con la práctica y con tener herramientas en excelentes condiciones. A continuación, utilice la pinza para sujetar firmemente el cerebro y las tijeras de punta fina para separar la membrana. Este paso es el más difícil del procedimiento, pero las habilidades necesarias se desarrollan con la práctica.Luego, retire el mesencéfalo y el met cefalón. Aísle el cefalón. A continuación, transfiéralo libre de membrana periférica a una placa de cultivo de 35 milímetros con dos mililitros de PBS sobre hielo.Recolecte todas las garras en un solo recipiente. Comience cortando las garras en fragmentos de uno o dos milímetros con una hoja de bisturí. Recoja el tejido en un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de DMEM completo.Disocie el tejido suave pero completamente mediante pipeteo con una pipeta de un mililitro hasta que desaparezcan los grumos y se obtenga una suspensión lechosa. Centrifugue la suspensión a 800-1000 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración y resuspenda.Suspenda el paladar en DMEM con DS uno. Ahora disocie las células nuevamente mediante agitación suave y repita el paso de centrifugación. Luego, re suspenda el sedimento en DMEM completo calentado.Filtre las células en suspensión a través de una malla de nailon de 70 micrones y recoja las porciones celulares retenidas en la malla. Dígales adicionalmente en dos mililitros de DMEM con colagenasa y dis bays. Espere unos minutos y luego lave el tejido. De tres a usando centrifugación y resus del sedimento en DMEM con DS un pool, la recolección lavada con el filtrado mantenido en hielo.Luego, lave la combinación con DMEM completo utilizando centrifugación y resuspensión. Ahora determine el número de células con un hemocitómetro y continúe con la marcación magnética. Los volúmenes en este protocolo son adecuados para hasta 10 millones de células. Para números mayores de células, simplemente aumente las proporciones.Comience centrifugando la suspensión celular a 300 G durante 10 minutos a temperatura ambiente, aspire completamente el sobrenadante y agregue 90 microlitros de tampón de purificación frío al precipitado celular, seguido de 10 microlitros de microesferas magnéticas conjugadas con CD31. Mezcle bien las células utilizando una pipeta de 200 microlitros e incube la suspensión durante 15 minutos en un refrigerador, pero no más tiempo, para que la marcación permanezca específica. Lave las células agregando uno a dos mililitros de tampón de purificación frío y centrifugue a 300 G durante 10 minutos.Elimine el sobrenadante y resuspenda las células en 500 microlitros de tampón de purificación frío. A continuación, cargue una columna MS en el campo magnético del separador máximo. Luego, enjuague la columna con 500 microlitros de tampón de purificación a temperatura ambiente.Luego aplique la suspensión celular a la columna. Es adecuada para hasta 20 millones de células. Recopile y deseche todo el flujo que contiene las células no marcadas.Lave la columna con 500 microlitros de tampón de purificación tres veces. Asegúrese siempre de que el reservorio de la columna esté vacío antes de añadir las siguientes alícuotas de tampón de purificación. Ahora retire la columna del separador máximo y colóquela en un tubo de 15 mililitros.Añada un mililitro de tampón de purificación a la columna e inmediatamente retire las células marcadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo suministrado dentro de la placa de la columna. Las células expulsadas se colocan en una placa de cultivo de 35 milímetros previamente recubierta con colágeno tipo I.Ahora incube las células con ECCM en un incubador ajustado a 37 grados Celsius con 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono. Cambie el medio cada cuatro días. Observe diariamente las células creciendo en la placa de cultivo mediante un microscopio.La caracterización fenotípica de las células endoteliales periventriculares o los cambios en el CS de PVE desde el día uno hasta el día 12, observados mediante microscopía de contraste de fase. Las células que se adhieren al recipiente el día uno muestran una morfología característica de división celular entre los días cinco y ocho. El CS de PVE transiciona de una morfología tipo adoquín a una forma alargada típica de las células endoteliales y más similar a su estado in vivo.Para el día 12, el cultivo de PVEC alcanza confluencia total. El p vs puede ser subcultivado fácilmente para expandir la colonia tras la subcultura.La pureza de los cultivos de células endoteliales se determinó en un 100 % utilizando los siguientes marcadores de células endoteliales: ISO selectina, factor de von Willebrand, CD31, PE-CAM-1 y VE-cadherina. Imágenes de alta magnificación de PVC preparadas a partir de embriones CD1, así como de embriones tie2-GFP cuyas células endoteliales expresaban GFP, se marcaron con ISO lectina antes; estas mostraron morfologías comunes en forma de adoquines y fusiformes, así como morfologías poligonales con prolongaciones delgadas en algunos platos de cultivo recubiertos con colágeno. En ausencia de Matrigel, las PVC formaron patrones en red que recuerdan la característica única de la red vascular periventricular in vivo.Esto refleja el alto potencial angiogénico de los PVE Cs. Se realizó un ensayo de angiogénesis en el que se añadieron 20.000 PVE Cs a placas de cultivo recubiertas con gel de matriz. Estos PVE Cs mostraron una formación robusta de tubos en 18 horas.Es posible realizar un estudio a largo plazo de las CVP, incluyendo migración, motilidad, morfología, ensayos de función celular, así como experimentos in vivo, mediante la marcación de las CVP aisladas de embriones CD1 con nanocristales de puntos cuánticos. Estos nanocristales proporcionan una fluorescencia intensa y estable en el citoplasma de células vivas.Las Pve EECS pueden transfectarse con trazadores celulares como CellLight Membrana Plasmática RFP, MAM 2.0, para una visualización clara de la morfología celular en experimentos de microscopía de células vivas. Las Pve CS se cultivaron en varios medios y se comparó la morfología celular mediante microscopía de contraste de fase y selectina ISO antes de la tinción.Aunque las CS de VP cultivadas en ECCM mostraron una morfología alargada y fueron confluentes al día 12, las CS de pve cultivadas en medio de crecimiento para células endoteliales cerebrales de rata mostraron una morfología muy alargada y alcanzaron la confluencia al día 20. Por otro lado, las CS de VP cultivadas en medio D-M-E-M-F 12 mostraron únicamente una morfología plana y poligonal sin formación de huso, presentaron un crecimiento muy rápido y alcanzaron la confluencia al día cuatro.Las PVEC se han cultivado en ECCM durante hasta tres pases sin pérdida del fenotipo ni de la función. Por lo tanto, ECCM es el medio preferido para el cultivo de PVEC. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres horas si se realiza adecuadamente.El cultivo conjunto de células endoteliales periventriculares con precursores neuronales probablemente estimule la neurogénesis y la migración neuronal mucho mejor que las células endoteliales del cerebro adulto u otras fuentes. Por lo tanto, podrían ser valiosas para ayudar a la recuperación de la función neurológica en muchos escenarios diferentes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Este video presenta el aislamiento de microvasos del cerebro de una rata utilizando una combinación de centrifugación en gradiente de densidad y mehods de digestión enzimática. Los microvasos aislados se pueden cultivar en un matraz de cultivo prerrecubierto con matriz de colágeno y fibronectina para obtener colonias de células endoteliales.

Cultivo de células endoteliales a partir de microvasos cerebrales de rata: un procedimiento para aislar y cultivar células endoteliales a partir de microvasos de cerebro de rata

Este video muestra un protocolo para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en células endoteliales cerebrales.

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Cultivo celular primaria es una técnica útil para el análisis de poblaciones específicas de células, en particular a partir de embriones de ratones transgénicos en etapas de desarrollo específicas. En esto, los ventrículos embrionarias se disecan y se disociaron, y los granos de anticuerpos conjugados reconocen y se separan las células endoteliales para su posterior análisis.

Aislamiento de células endoteliales embrionarias ventriculares

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Aislamiento y cultivo de expansión de las células endoteliales-tumorales específicas

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

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