Generación de Shear Adhesión Mapa Utilizando SynVivo redes microvasculares sintético

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener un mapa de adhesión por cizallamiento de la adhesión de partículas celulares a partir de un único experimento utilizando redes microvasculares sintéticas. Esto se logra primero recubriendo el dispositivo microfluídico con la proteína de interés, en este caso avadon. Como segundo paso, se inyectan partículas biotiniladas en el dispositivo a tasas fisiológicas de cizallamiento, las cuales se unen al dispositivo recubierto con avadon presentando patrones diferenciales dependiendo de las tasas locales de cizallamiento.

A continuación, se cuenta el número de partículas unidas con el fin de generar un mapa de adhesión al cizallamiento de las partículas utilizando una base de datos creada computacionalmente de valores de velocidad de cizallamiento en la red. Los resultados muestran que se puede obtener un mapa de adhesión al cizallamiento a partir de un único experimento, lo que supone un ahorro significativo de tiempo y reactivos en comparación con las cámaras de flujo de placas paralelas convencionales. La ventaja principal de esta tecnología frente a los métodos existentes, como los canales de flujo lineales, es que podemos generar mapas de cizallamiento a partir de un solo experimento, lo que resulta en un ahorro significativo de costos y tiempo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como la capacidad de los vehículos de administración para unirse a los objetivos deseados. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando estábamos utilizando cámaras de flujo con placas de agitación para comprender lesiones celulares particulares. Sin embargo, bajo condiciones de fluido, el enfoque de este ensayo es proporcionar información básica sobre la adhesión de partículas y células.

La plataforma syn vivo puede aplicarse a una variedad de otros sistemas, como el cáncer y la administración al SNC, infección e inflamación, trombosis y disfunción de la microcirculación. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos con el dispositivo microfluídico son difíciles de aprender, acostumbrarse a volúmenes de muestra pequeños y las mejores prácticas para evitar la formación de burbujas se comunican mejor visualmente. Ashley Smith, científica investigadora de nuestro laboratorio, realizará la demostración del procedimiento.

El dispositivo microfluídico SynVivo SMN consta de dos conjuntos de puertos paralelos, uno para hacer fluir el recubrimiento superficial, las agrupaciones y/o las células para su fijación, y otro para realizar el ensayo. Para comenzar, sumerja completamente el dispositivo en una placa de Petri que contenga agua desionizada estéril y coloque la placa en una cámara de vacío. Desecue, permitiendo que la desecación continúe hasta que todo el aire sea eliminado de los canales del dispositivo.

Esto debería tardar aproximadamente 15 minutos antes de retirar el dispositivo del agua. Utilice pinzas de punta fina para colocar tubos de tigon previamente llenados con agua en cada puerto del dispositivo. Los tubos deben tener una longitud aproximada de una pulgada.

El dispositivo ya puede retirarse del agua utilizando una pipeta o una jeringa. Coloque una gota de agua alrededor de la base de uno de los tubos del puerto de entrada. Retire cuidadosamente el tubo.

La gota de agua evitará que entre aire en el dispositivo. A continuación, prepare una jeringa de un mililitro cargada con avadon a una concentración de 20 microgramos por mililitro. Conecte la jeringa a una aguja de acero inoxidable de calibre 24 y sujete el puerto de entrada que no se esté utilizando con una pinza de mordaza.

Inserte el tubo en el puerto de entrada del dispositivo. Inyecte avadon a un flujo de un microlitro por minuto durante 10 minutos para permitir la perfusión completa del dispositivo. Al final del tiempo de flujo.

Sujete todos los tubos con pinzas de mordaza y coloque el dispositivo a cuatro grados durante la noche. Deje que el dispositivo alcance la temperatura ambiente. Luego, coloque el dispositivo en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con una platina motorizada y una cámara de alto rendimiento.

Prepare una solución de partículas biotiniladas de dos micrones a una concentración de 5 millones de partículas por mililitro en tampón salino fosfato o PBS. Cargue las partículas en una jeringa de un mililitro. Prepare una segunda jeringa de un mililitro con PBS.

Solo cargue cada jeringa en una bomba de jeringas y luego conéctelas a la aguja y al tubo utilizando una jeringa pipeteadora. Coloque una gota de agua alrededor de la base del tubo del puerto de entrada y retire cuidadosamente el tubo utilizado para recubrir el dispositivo. Inserte cuidadosamente el tubo para las partículas biotiniladas y el tubo para el PBS en cada uno de los puertos de entrada.

Luego, comience a inyectar partículas biotiniladas a un caudal de 2,5 microlitros por minuto. Supervise el puerto de entrada en el microscopio ante la primera señal de partículas. Inicie el cronómetro y mantenga el flujo durante tres minutos.

Al finalizar los tres minutos, detenga el flujo de partículas biotiniladas mientras simultáneamente inicia el flujo de PBS a una velocidad de 2,5 microlitros por minuto. Permita que el PBS fluya por el dispositivo durante tres minutos para lavar las partículas no unidas. Para comenzar la adquisición, utilice la función de escaneo de imagen grande del software de imagen para obtener la imagen completa del dispositivo, luego numere secuencialmente las bifurcaciones en el dispositivo y cree un área circular de interés con un diámetro dos veces mayor que el de los canales.

En este caso, establezca el diámetro del área de interés en 200 micrones, ya que el diámetro del canal es de 100 micrones. Utilice la función de conteo automatizado del software de imagen para exportar el número de partículas en cada área de interés a una hoja de cálculo. Asimismo, utilice la función de recuento automatizado para exportar el número de partículas en todo el dispositivo.

Se realizan simulaciones de dinámica de fluidos computacional (CFD) y los resultados se almacenan en una base de datos para su posterior análisis. La información incluida en los resultados contiene tasas de cizallamiento en la pared, flujo de partículas por velocidad y adherencia al dispositivo. Esta información se utiliza para determinar el número de partículas que se adhieren en cada área de interés dada una concentración de partículas definida como entrada.

Para generar un mapa de adhesión por cizallamiento, calcule el porcentaje de adhesión según se detalla en el protocolo del texto como paso final. Represente el mapa de adhesión por cizallamiento utilizando la velocidad de cizallamiento en cada bifurcación de las redes y los valores de porcentaje de adhesión. Esta imagen muestra un dispositivo SMN syn vivo típico recubierto con avidina tras la unión de partículas biotiniladas de dos micrones.

Téngase en cuenta que las partículas se adhieren preferentemente cerca de las bifurcaciones en la red. Aquí se pueden ver las bifurcaciones numeradas en la red SMN syn vivo. Esta imagen es el mapa de esfuerzo cortante en la pared de la muestra generado por el modelo CFD del dispositivo.

La velocidad de corte varía en el dispositivo desde 250 segundos inversos hasta 15 segundos inversos, tal como se observa en la microvasculatura in vivo. Téngase en cuenta que estas velocidades de corte variables no pueden obtenerse simultáneamente en canales microfluídicos lineales, ya que estos proporcionan una velocidad de corte constante para cada caudal. La gráfica mostrada aquí con los valores de la velocidad de corte en cada una de las bifurcaciones de la red revela que los patrones de velocidad de corte son complejos y no pueden obtenerse mediante una relación analítica sencilla, a diferencia de los canales de flujo lineales.

Además, existen múltiples bifurcaciones en la red que caen dentro del mismo intervalo de esfuerzo cortante. Esto aumenta la confianza estadística de los datos mostrados. A continuación se presentan resultados de ejemplo del análisis CFD de los flujos de partículas en la red, los cuales se utilizan para calcular los flujos de partículas en las ramas y bifurcaciones de la red experimental.

El mapa de adhesión cortante calculado a partir de un único experimento SMN syn vivo sigue la relación inversa observada en los mapas de adhesión cortante obtenidos de experimentos con canales lineales. Sin embargo, mediante un ensayo SynVivo, un solo experimento permite generar este mapa cortante, mientras que con los canales lineales se requieren múltiples ejecuciones experimentales. Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo utilizar los dispositivos SMN SynVivo para generar la adhesión compartida a partir de un solo experimento.

Al realizar este experimento, es importante recordar no introducir burbujas en el dispositivo microfluídico SynVivo SMN después de su preparación. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inflamación estudiaran la interacción entre leucocitos y endotelio a diferentes tasas de cizallamiento en un solo experimento. En la próxima generación de dispositivos, los investigadores podrán estudiar la adhesión rodante y la migración de leucocitos en un único ensayo, algo que actualmente no es posible.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos para investigar la adhesión de fármacos, vehículos de entrega de fármacos y células, con el fin de estudiar preguntas como el efecto fisiológico del flujo sobre la adhesión célula-célula, célula-fármaco y fármaco-vehículo.