Name: Intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende a realizar inmunoterapia intralinfática en ratones mediante inyección directa en ganglios inguinales. Este método mejora la eficacia de vacunas y reduce las dosis necesarias en estudios de inmunología.

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Los autores agradecen la ayuda experimental en el desarrollo del método de inmunización intralinfática en ratones de Iris Erdmann, Barbara von Beust, y Julia María Martínez-Gómez. Gracias también a Maggy Arras y Nikola Cesarovic para dejarnos usar su teatro quirúrgico para esta producción de vídeo.

1. Anestesia de ratones <ol><li> Preparar los anestésicos mediante la mezcla de ketamina (anestésico disociativo) y xilazina (sedante y analgésico) en solución salina. Las concentraciones de ketamina y xilazina en la solución final son 12.5 y 2 mg / ml, respectivamente. </li><li> Inyectar los anestésicos a los ratones mediante administración intraperitoneal usando una jeringa con una aguja de calibre 25-30. Utilice 0,1 ml/10 g de peso corporal. </li><li> Aplique una pomada oftálmica a los ojos de los ratones con el fin de evitar que se reseque de las córneas. </li><li> Asegúrese de que el ratón esté suficientemente anestesiado pellizcando su pie o del pie con las pinzas. Si el ratón no reacciona con reflejos para la pizca, proceder a la cirugía. Si el ratón reacciona a la pizca con los reflejos o contracciones musculares, esperar 1-2 minutos y repetir la prueba del pellizco. Si el ratón sigue reacciona, sustituya el ratón con un animal nuevo y repita el procedimiento desde el paso 1.2 en adelante. </li></ol> 2. Me quirúrgicancision del Área inguinal del ratón <ol><li> Coloque el ratón en la espalda. </li><li> Humedecer una región inguinal con etanol desinfección (70%). Para proporcionar una mejor desinfección, la región inguinal puede afeitar para quitar la piel antes de la desinfección con etanol. </li><li> Tome la pata trasera y doble la articulación de la cadera para producir un ángulo de aproximadamente 90 ° de la articulación de la cadera. </li><li> El uso de un fórceps curvados microdissecting, tomar la piel de ratón en la zona inguinal, donde la articulación de la cadera está doblado y tire de la piel humedecida ligeramente. </li><li> Mientras mantiene la piel con las pinzas, corte una pequeña incisión (&lt;5 mm) a través de la piel utilizando tijeras quirúrgicas. </li><li> Coloque la punta de las tijeras cerradas en la incisión y abrir aún más la incisión mediante la apertura de las tijeras mientras lo mantiene dentro de la incisión. Esto hará que la piel a desgarrarse y debe producir un diámetro de menos de 10 mm. Nota: Una fuente de luz fría con guías de luz flexibles se puede utilizar para mejorar la visibilidad. En más viejosratones, especialmente los varones, la identificación del ganglio linfático puede ser difícil debido a la cantidad de tejido de grasa en la región inguinal. </li></ol> 3. Inyección intralinfática <ol><li> Preparar una jeringa (0,5 ml o menos) con una aguja hipodérmica 28-30 G; un bisel corto puede ser preferible a una larga bisel. Aspirar 10 l de la vacuna que se inyecta y aseguran que la jeringa esté libre de aire. </li><li> Localizar el ganglio linfático inguinal con ayuda de las pinzas curvas y la punta de la tijera cerrado. El ganglio linfático aparecerá grisáceo en el tejido graso más blanquecina y puede ser identificado más a través de aferentes y eferentes capilares que entran y salen del ganglio linfático. </li><li> Inmovilizar el ganglio linfático sosteniéndolo entre las ramas de las pinzas curvas. </li><li> Coja la jeringa e inserte la aguja en el ganglio linfático con el bisel hacia arriba, asegurándose de que todo el bisel entra en el ganglio linfático. </li><li> Se inyecta la vacuna (10 l). Si el visto bueno linfáticoe Es la hinchazón (voladura), la inyección se puede asumir con éxito. Si la aguja no está colocada lo más profundo en el ganglio linfático, una parte o la totalidad de la vacuna puede filtrarse y no entrar en el ganglio linfático. Si se inserta la aguja demasiado profunda, la vacuna se inyecta por vía subcutánea se dará a conocer a continuación el nodo linfático. En este último caso, repetir la inyección o sustituir el ratón con un nuevo ratón no tratado. </li></ol> 4. Cerrar la incisión suturando <ol><li> Abra un paquete de sutura quirúrgica estéril. </li><li> Agarre de la aguja de sutura con un soporte de aguja en la parte distal del cuerpo de aguja. Apriete el soporte de la aguja apretando hasta que las primeras capturas de trinquete. </li><li> Agarre de la piel en un lado de la incisión utilizando fórceps (dependiendo de la preferencia del cirujano, fórceps o ganchos de la piel dentada o de las Naciones Unidas de dientes puede ser utilizado). Insertar la aguja CA. 2-3 mm del borde de la incisión, que entra desde el exterior de la piel. </li><li> Loosen el asimiento de la piel con los fórceps y sujete el lado opuesto de la incisión con los fórceps. Insertar la aguja CA. 2-3 mm del borde de la incisión, que entra desde el interior de la piel. </li><li> Afloje el soporte de la aguja y sujete el extremo de la aguja con los fórceps. Tire de la aguja con la banda de rodadura a través de la piel, dejando una longitud conveniente de la banda de rodadura fuera del primer punto de inserción de aguja (si son varios ratones a tratar, dejar un extremo más corto; 5-10 ratones puede ser operado con una aguja de sutura / Paso). </li><li> Hacer el nudo preferido de acuerdo con protocolos estándar cirujano. Una puntada es suficiente si la incisión no es mayor de 10 mm. Para incisiones más grandes, hacer una segunda puntada. </li></ol> 5. Tratamiento post-operativa <ol><li> Coloque el ratón en la jaula y cubrir con los tejidos para mantener el calor. En el tratamiento de varios ratones, colocarlos cerca unos de otros para mantener el calor. Como alternativa, coloque el ratón sobre una almohadilla caliente hasta que han despertadoarriba. </li><li> Observar los ratones hasta que se despiertan. </li><li> Observar los ratones diariamente con respecto a la cicatrización de heridas, así como otros síntomas clínicos tales como infecciones de la herida. La herida suele ser lo suficientemente cerrado dentro de dos días, y sanó a los siete días del procedimiento. </li></ol>

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</ol>

TMK es nombrado como inventor de patentes que tratan con inmunoterapia intralinfática en el hombre. TMK ha sido asesor científico y ha recibido los gastos de viaje desde ImVisioN GmbH, Cytos Biotecnología, MannKind Corporation, y XBiotech EE.UU. Inc. PJ no le interesa el conflicto de revelar.

La inmunización intralinfática e inmunoterapia han demostrado ser apropiados para la estimulación de las respuestas tanto de anticuerpos y respuestas de células T. Como se ha demostrado en este video-artículo, el procedimiento intralinfática de la vacunación es un método rápido y fácil para la estimulación de respuestas inmunes fuertes en ratones. Un cirujano entrenado puede realizar el procedimiento durante 3-4 min. En la sesión también se puede compartir entre dos cirujanos donde uno es típicamente haciendo la anestes...

Las vacunas se inyectan típicamente por vía subcutánea o intramuscular para la estimulación de respuestas inmunes. El éxito de este procedimiento requiere un drenaje eficaz de la vacuna a los ganglios linfáticos donde las células presentadoras de antígeno pueden interactuar con linfocitos para la generación de T y las respuestas de células B. Además, la fuerza y ​​el tipo de respuesta inmune inducida también dependen de la densidad o de la frecuencia de tales interacciones, así como el propio microambiente, especialmente el contenido de citoquinas. Como sólo una pequeña fracción de una vacuna se inyecta en un tejido periférico llega a un nodo de linfa, las vacunaciones de ratones y seres humanos mediante inyección directa de la vacuna en los ganglios linfáticos, el sitio se se generan respuestas inmunes, se han realizado. En el hombre, el procedimiento es guiado por ultrasonido, un procedimiento también se utiliza para la administración de agentes de formación de imágenes para la visualización y el diagnóstico en el sistema linfático. En ratones, el procedimiento es invasivo. Aquí, una pequeña (5-10 mm) incision se realiza en la región inguinal de los animales anestesiados 1, el nodo linfático se localiza y se inmoviliza con fórceps, y un volumen de 10-20 l de la vacuna se inyecta bajo control visual; 10 l se utiliza para la primera inyecciones y en ratones jóvenes con pequeñas ganglios linfáticos, mientras que 20 l pueden ser inyectados en los ganglios linfáticos de los ratones más viejos o ya cebados, que tienen ganglios linfáticos más grandes. La incisión se puede cerrar con una sola puntada utilizando suturas quirúrgicas. Por este método, los ratones han vacunados con el plásmido de ADN de 2,3, el ARN mensajero 4, 1,3,5,6 péptido, proteína 7-10, las partículas 11, 12 bacterias, así como adyuvantes 7,13, y fuerte mejora de inmunológico Se han observado respuestas contra todo tipo de vacunas. El método intralinfática de la vacunación es especialmente apropiada en situaciones en las que la vacunación convencional produce inmunidad insuficiente o cuando la cantidad de vacuna disponible es limitado o very costoso. En humanos, el método intralinfática de la inmunización se ha aplicado a los pacientes de alergia 14,15 o para pacientes con cáncer de 16-21. Aunque la idea actual es que el método intralinfática es más invasivo que otros métodos inyectables tales como inyecciones intramusculares y subcutáneas, la percepción del dolor no es mayor que después de una punción venosa 15. Se espera que la vacunación intralinfática se convertirá en una alternativa o complemento a otros métodos de vacunas profilácticas y terapéuticas especialmente. En este artículo se describe en detalle cómo se realiza el procedimiento de vacunación intralinfática en ratones. Todos los procedimientos descritos, fueron aprobados por la Agencia Veterinaria Cantonal de Zúrich, y llevaron a cabo según las directrices y directivas sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos federales suizos.

<table><tbody><tr><td>Ketamina (Ketasol-100)</td><td>Graeub AG, Suiza</td><td></td><td>Anestésicos</td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun)</td><td>Bayer, Alemania</td><td></td><td>Anestésicos</td></tr><tr><td>Viscotears Eye-Gel</td><td>Novartis, Suiza</td><td></td><td>Para evitar que los ojos se sequen durante la anestesia.</td></tr><tr><td>BD Micro-Fine 0,5 ml</td><td>BD Medical, Francia</td><td></td><td>Jeringas de insulina de 29 g con agujas fijas</td></tr><tr><td>6-0 Dermalon Monofilament Nylon</td><td>Covidien, MA, USA</td><td></td><td>Para suturas (0,7 métricas, 18 G, 45 cm, azul)</td></tr><tr><td>Pinzas curvas, 4,5 en</td><td>Polymed, Suiza</td><td></td><td>Para incisión y sujeción de ganglios linfáticos</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas rectas, 4,5 en</td><td>Polymed, Suiza</td><td></td><td>Para</td></tr><tr><td>incisión Portaagujas, 5.5 en</td><td>Polymed, Suiza</td><td></td><td>Para cerrar la incisión con sutura</td></tr></tbody></table>

intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Las vacunas se inyectan típicamente por vía subcutánea o intramuscular para la estimulación de respuestas inmunes. El éxito de este requiere un drenaje eficaz de la vacuna a los ganglios linfáticos donde las células presentadoras de antígeno pueden interactuar con linfocitos para la generación de las respuestas inmunes buscadas. La fuerza y ​​el tipo de respuesta inmune inducida también dependen de la densidad o la frecuencia de las interacciones, así como el microambiente, especialmente el contenido de citoquinas. Como sólo una fracción de minuto de vacunas periféricamente inyectados llega a los ganglios linfáticos, las vacunaciones de ratones y seres humanos se realizaron por inyección directa de la vacuna en los ganglios linfáticos inguinales, es decir, la inyección intralinfática. En el hombre, el procedimiento es guiada por ultrasonido. En ratones, una pequeña incisión (5-10 mm) se realiza en la región inguinal de los animales anestesiados, el ganglio linfático se localiza y se inmoviliza con unas pinzas, y un volumen de 10-20 l de la vacuna se inyecta bajo control visual.La incisión se cierra con una única puntada utilizando suturas quirúrgicas. Los ratones fueron vacunados con el ADN plásmido, ARN, péptido, proteína, partículas, y bacterias, así como adyuvantes, y se observó una fuerte mejora de la respuesta inmune contra todo tipo de vacunas. El método intralinfática de la vacunación es especialmente apropiada en situaciones en las que la vacunación convencional produce inmunidad insuficiente, o cuando la cantidad de vacuna disponible es limitado.

El procedimiento de inyecciones intralinfáticas en ratones, a pesar de la cirugía, es sencillo y relativamente rápido. Una persona capacitada puede realizar el procedimiento en 3-4 min. La incisión que se cierra con una puntada típicamente se cura dentro de dos días (Figura 1) Vacunación o inmunización intralinfática se ha realizado con ARNm, ADN plásmido, péptidos, proteínas, virus y bacterias. Figura 2 ilustra la producción de anticuerpos después de la inm...

La vacunación profiláctica y terapéutica a menudo falla para estimular respuestas inmunes fuertes debido a la semana de drenaje de la vacuna a los ganglios linfáticos y en consecuencia pobres implicación de células inmunes. Por inyección directa de la vacuna a los ganglios linfáticos, así llamada inyección intralinfática, eficacia de la vacuna puede ser fuertemente mejorada y dosis de la vacuna se puede reducir.

Intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

El objetivo general de este procedimiento es estimular las respuestas inmunitarias de ratones mediante la inyección directa de vacuna en sus ganglios linfáticos. Esto se logra primero anestesiando al ratón y realizando una pequeña incisión en la región inguinal. A continuación, localice y fije los ganglios linfáticos inguinales.El paso final consiste en inyectar la vacuna en el nódulo linfático inguinal. En última instancia, la administración intra-linfática de vacunas puede evaluarse midiendo su respuesta ti y comparándola con métodos de administración tradicionales, como las inyecciones subcutáneas. Por lo general, las personas nuevas en este método tienen dificultades para alcanzar el nódulo linfático con la vacuna.Puede requerir algo de entrenamiento coordinar la inmovilización del ganglio linfático, la inserción de la aguja y la inyección de la vacuna, ya que la aguja se sale fácilmente de posición y entonces la vacuna se inyecta fuera del ganglio linfático. Para comenzar, anestesie al ratón según se describe en el protocolo de texto adjunto. Lo antes posible, aplique una pomada oftálmica a los ojos del ratón con el fin de evitar que las córneas se sequen.Luego, coloque al ratón en posición supina y pellizque la pata del ratón con pinzas para verificar que esté suficientemente anestesiado. Si no se observa ninguna reacción, coloque un tejido sobre la cabeza del ratón para protegerla de la luz y desinfecte una región inguinal con etanol al 70%. A continuación, levante la pata trasera y doble la articulación de la cadera formando un ángulo de 90 grados.Ahora, con pinzas microdisectoras curvas, levante la piel unida en la curvatura y realice una pequeña incisión a través de la piel. Luego, coloque la punta de las tijeras cerradas dentro de la incisión. Abra las tijeras para rasgar un diámetro de menos de 10 milímetros en la región inguinal.Identifique el ganglio linfático por su apariencia esférica y grisácea en contraste con el tejido graso circundante más claro. Utilice una jeringa de 0,5 mililitros con una aguja hipodérmica de bisel corto de calibre 28 para aspirar 10 microlitros de la vacuna que se inyectará. Ahora inmovilice el ganglio linfático entre las ramas de la pinza curva.Luego, con la bisel hacia arriba, inserte la aguja de la jeringa en el ganglio linfático. Asegúrese de que todo el bisel entre en el ganglio linfático. Inyecte la vacuna y observe la hinchazón que indica una inyección exitosa.Abrir un paquete de sutura quirúrgica estéril con un portagujas. Sujetar la aguja de sutura en la porción distal del cuerpo de la aguja. A continuación, apretar el portagujas presionándolo hasta que encaje el primer trinquete y extraer el hilo.A continuación, tome la piel por un lado de la incisión. Introduzca la aguja desde el exterior de la piel en el borde de la incisión. Ahora suelte ligeramente el agarre de la piel y sostenga el lado opuesto de la incisión con la pinza.Inserte la aguja desde el interior de la piel, aproximadamente dos o tres milímetros desde el borde de la incisión. Nuevamente, sujete la aguja con la pinza y afloje el portagujas.Introduzca la aguja con el hilo a través de la piel, dejando una longitud conveniente del hilo fuera del primer punto de inserción de la aguja. Haga el nudo quirúrgico preferido. Si la incisión es mayor de 10 milímetros.Realice una segunda puntada cuando la incisión esté suficientemente cerrada. Transfiera el ratón a una almohadilla térmica para su recuperación. Observe diariamente a los ratones la cicatrización de la herida, así como otros síntomas clínicos como infección.Estas inyecciones intra linfáticas en ratones son sencillas y relativamente rápidas. Una incisión que se cierra con una sola puntada generalmente cicatriza en dos días. Aquí, la producción de anticuerpos se midió tras la inmunización con la proteína fosfolipasa A dos.El alérgeno principal de la veneno B. La estimulación intralinfática indujo fuertes respuestas de anticuerpos con una inyección de 0,01 microgramos de PLA A dos, mientras que se requirió una inyección subcutánea de 10 microgramos de PLA A dos para lograr una respuesta adecuada.En este experimento, se utilizó la vacunación intra-linfática para estimular las respuestas de linfocitos T citotóxicos. Una sola inyección subcutánea en ratones TCR 3 1 8 con G 33 indujo una respuesta esperada de linfocitos T citotóxicos de ocho. Esta respuesta se amplificó aproximadamente seis órdenes de magnitud tras una inyección intra-linfática. Las funciones de los linfocitos T CD cuatro también se evaluaron en un ensayo de desafío tumoral.Cuando los ratones inmunizados fueron desafiados por vía intravenosa con células tumorales EL4 sinérgicas que expresaban NP52, los ratones desarrollaron linfoma sistémico. La inmunización mediante la vía intralinfática dio como resultado tiempos de supervivencia mucho más largos que la inmunización mediante la vía subcutánea. En humanos.La administración intra-linfática de vacunas se realiza con la ayuda de ultrasonido mediante la localización de ganglios linfáticos subcutáneos. Curiosamente, en humanos, los trazadores proteicos radiomarcados indican que las inyecciones subcutáneas tienen una biodistribución deficiente hacia los ganglios linfáticos, mientras que la inyección intra-linfática directa facilita una entrega eficiente a las células inmunitarias para la estimulación de la respuesta inmune. Una vez dominado, este procedimiento de vacunación intra-linfática puede realizarse en aproximadamente de dos a tres minutos por ratón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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