VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped

El objetivo general aquí es demostrar la metodología mediante el silenciamiento génico inducido por virus para identificar genes involucrados en la resistencia no huésped, con el fin de obtener VIGS de la planta endógena. Inocule plantas de nicotiana benthamiana con el constructo del virus del mosaico del tabaco que porta un fragmento del gen diana, prepare e inocule cultivos del patógeno no huésped que expresan la proteína verde fluorescente sobre las hojas de las plantas con el gen silenciado. A continuación, evalúe las colonias verdes fluorescentes del patógeno no huésped bajo luz ultravioleta en la oscuridad.

Con el fin de identificar plantas con genes silenciados que afecten la resistencia de no hospederos, identifique el gen diana mediante la secuenciación del inserto en el vector viral. En general, esta metodología de cribado genético directo mediado por VIX permite a los investigadores identificar fácilmente los genes implicados en la resistencia de no hospederos de las plantas frente a patógenos bacterianos. En un corto período de tiempo, comprendimos la importancia de combinar la genética directa mediada por silenciamiento génico inducido por virus con patógenos que expresan GFP bajo luz UV para identificar los genes responsables de la resistencia no-ST.

Cuando anteriormente realizamos una tediosa selección genética directa mediante la evaluación de la muerte celular inducida por hiperrrespuesta y la muerte celular inducida por enfermedad. Entonces, siembre semillas de Nicotiana benthamiana en una mezcla de siembra sin suelo y germine las semillas en una cámara de crecimiento. Después de tres semanas, trasplante las plántulas a macetas individuales y cultívelas en un invernadero durante al menos dos o tres días antes del virus del mosaico del tabaco.

Descongele gradualmente las cepas congeladas de Agrobacterium que contienen los clones de ADNc para la inoculación vectorial. Inocular individualmente, en condiciones estériles, los cultivos de Agrobacterium en agar Luria. Incubar las placas de agro de Berti a 28 grados Celsius durante hasta dos días.

Cultive cuatro colonias replicadas para cada clon para disponer de un inóculo adecuado de agrobacterium para la inoculación de dos plantas. Inocule TRV uno en medio líquido Luria-Bertani. Recupere los cultivos crecidos durante la noche mediante centrifugación, re suspenda las bacterias en tampón de inoculación e incube durante tres horas a temperatura ambiente en un agitador a 50 RPM.

Después de recolectar las células por centrifugación, mida la densidad óptica y resuspenda los pellet bacterianos en tampón MES cinco milimolar pH 5,5. A continuación, inocule el T RV uno de una cultura bacteriana con una DO600 de 0,3 en el envés de tres a cuatro hojas de nicotiana hamama utilizando una jeringa sin aguja en el sitio de inoculación del T RV uno. Pique las hojas con el inóculo de las colonias respectivas del T RV dos utilizando un palillo durante dos semanas. Mantenga las plantas a baja temperatura con nutrición adecuada porque un crecimiento vigoroso es importante para el silenciamiento génico eficiente mediante pigs.

Como ejemplo, en este experimento se utiliza Pseudomonas syringae pv. tomato T1. Los patógenos deben portar un plásmido que pueda expresar GFP-UV. Incube las cepas PGE en medio líquido King's B suplementado con 10 microgramos por mililitro de rifampicina y 50 microgramos por mililitro de canamicina a 28 grados Celsius durante 12 horas.

Recolecte los cultivos bacterianos mediante centrifugación y luego confirme la presencia de fluorescencia verde utilizando una lámpara de luz ultravioleta de onda larga en la oscuridad. Después de dos lavados con agua estéril, re suspenda las células en la concentración deseada de agua estéril y ajuste la DO 600. A continuación, inocule los patógenos respectivos en el lado axial del objetivo.

Las hojas con genes silenciados presentan círculos de aproximadamente 1,5 centímetros de diámetro, si es necesario. Pruebe simultáneamente varios patógenos no huéspedes para evaluar su crecimiento en las plantas con genes diana silenciados e incluya también un control vectorial para observación. Implante un crecimiento bacteriano entre dos y cinco días.

Exponga las hojas inoculadas a luz ultravioleta de longitud de onda larga en la oscuridad. Asegúrese de usar protección para la piel y los ojos. Observe las colonias bacterianas como puntos fluorescentes verdes en el lado axial de la hoja, sobre el fondo de fluorescencia roja emitida por la superficie de la hoja.

Verifique la fluorescencia verde emitida por el patógeno hospedador que actúa como control positivo. Observe el crecimiento del patógeno diariamente desde dos hasta cinco días posteriores a la inoculación. Elabore una lista de los clones cuyo silenciamiento resultó en el crecimiento de uno o más patógenos no hospedadores.

Para eliminar los falsos positivos de la primera selección, repita las VIGs para los clones seleccionados y vuelva a evaluar la respuesta de las plantas con genes silenciados frente a patógenos no relacionados. Utilice PCR de colonia en el clon seleccionado para amplificar el inserto empleando los cebadores A TTB uno y TB dos del vector T RV dos o cebadores que flanqueen el sitio de clonación.

Corra el producto de PCR en un gel de aros y verifique la amplificación de la banda única. Luego, secuencie el inserto del gen vegetal en el vector T RV dos utilizando los cebadores A TTB o cebadores que flanqueen el sitio de clonación. Realice un análisis BLAST con la secuencia e identifique los detalles del gen.

Un protocolo generalizado para silenciar un gran número de genes utilizando figs basados en el virus del mosaico del tabaco en nicotiana. Hamana se muestra en este diagrama de flujo. Algunas de las plantas con genes silenciados mostraron diversas alteraciones fenotípicas, incluyendo crecimiento enano, amarilleo y fenotipos de fotoblanqueo.

Estos datos muestran la fluorescencia verde de patógenos expuestos a luz UV en la oscuridad antes de la inoculación en la planta, y sus implantes de crecimiento tres días después de la inoculación; se muestra como control la misma hoja expuesta a luz blanca. Este experimento sigue el crecimiento de bacterias que expresan G-F-P-U-V en plantas. Tres no huéspedes.

Los patógenos se utilizaron para demostrar el proceso de identificación del gen silenciado en plantas susceptibles a patógenos no huésped en plantas silvestres de Nicotiana hamama no silenciadas con inmunidad. Estos patógenos no crecieron. Sin embargo, al menos dos patógenos no huésped crecieron en NB sgt.

Una hoja con un gen silenciado. Los datos cuantitativos sobre el crecimiento bacteriano demuestran el proceso de identificación de plantas con genes silenciados que presentan una resistencia deficiente frente a la no-ST. Mediante este enfoque de genética directa mediado por figs, hemos silenciado aproximadamente 5 000 genes en Nicotiana benthamiana e identificado plantas con resistencia comprometida frente a la no-ST en un período de alrededor de un año y medio.

Como ejemplo, aquí se muestra el crecimiento de patógenos no huésped en dos plantas con genes silenciados identificadas en este análisis. Esperamos haber explicado cómo realizar el silenciamiento génico inducido por virus para cientos de genes, y luego evaluar las plantas silenciadas observando el crecimiento de patógenos no huésped en plantas para desentrañar la resistencia no huésped. Mediante este protocolo mediado por silenciamiento génico inducido por virus, es posible silenciar cientos de genes en un período de dos a tres semanas, y luego evaluar el crecimiento de patógenos no huésped marcados con GFP UV en aproximadamente de dos a tres horas diarias, durante un lapso de alrededor de dos a cinco días.