Name: La Xenopus Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Aprende la técnica de corte con brecha de vaselina en oocitos de Xenopus para registrar corrientes iónicas con alta resolución temporal. Este método permite estudiar la cinética de canales iónicos con bajo ruido.

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Todos los miembros de la Universidad de Washington en St. Louis cardiaca Molecular Laboratorio de Ingeniería. A Burroughs Welcome Premio Fondo Carrera en la interfaz de la Ciencia - 1010299 (JS).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La vaselina ovocito técnica de fijación de voltaje brecha de corte abierto permite una rápida resolución de los datos, de poco ruido, aumenta el control sobre la solución interna y composición de la solución externa y grabaciones estables a través de protocolos relativamente largos 19. Estas ventajas establecen esta técnica, aparte de la fijación de voltaje de dos electrodos estándar y técnicas de patch clamp. Aunque se requiere equipo especializado y el protocolo es relativamente difícil, muy pocos problemas...

Técnicas de fijación de voltaje especializados permiten la grabación de corrientes iónicas en los potenciales de membrana controlados. Ampliamente utilizado de fijación de voltaje de dos electrodos (TEVC) y las técnicas de patch clamp proporcionan información electrofisiológica fiable sobre las propiedades de muchos canales iónicos. Sin embargo, ambos de estos métodos tienen inconvenientes que impiden la adquisición de datos fiables para los canales de sodio dependientes de voltaje rápidos y otros canales de activación rápida en membranas tales como las de los oocitos de Xenopus. Los laboratorios Bezanilla y Stefani consecuencia desarrollaron la técnica de fijación de voltaje brecha vaselina a cielo abierto (COVG) de ovocitos 2. La técnica se ha aplicado ampliamente para grabar, Na +, K + y Ca 2 + canales 3-8. Durante la grabación COVG, una membrana del oocito que expresa la proteína heteróloga se divide en tres regiones. Los datos de corriente iónica se graba desde la región superior de la ovocito como labaño que rodea la región de la parte superior se sujeta a un potencial de comando, que se puede cambiar fácil y rápidamente. Los guardias región de Oriente contra corrientes de fuga al ser sujetado al mismo potencial que la región superior 9. La región inferior es que la apertura de los ovocitos (cut-open) se produce mediante el uso de una solución de saponina o una cánula. Químico o la apertura manual de la membrana en la zona del fondo permite el control del potencial interno, que está fijado a tierra, y hace que el interior de la célula contigua con la solución de cámara inferior. La perfusión de soluciones en la cámara inferior puede ajustar las propiedades del medio interno, mientras que el intercambio de solución en la cámara superior altera el entorno externo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51040/51040fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Ovocitos-Cut abierto Voltaje-Clamp Bath esquema de instalación. (A) Topabajo de la vista de los tres cuartos de baño separados el uno del otro. Las dimensiones de las cámaras para COVG se muestran en la figura. (B) Vista lateral de la configuración de los baños en posición de prueba. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/51040/51040fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Las ventajas de la técnica de COVG incluyen bajo ruido de corriente (nA 1 a 3 kHz), el control de la composición iónica de los medios de comunicación externos, la capacidad de modular los medios de comunicación interna, el tiempo de resolución rápida (20-100 microsegundos constante de tiempo de decaimiento de la capacidad transitoria), y grabaciones estable durante varias horas 9. Las desventajas son que requiere un equipo especializado y es más difícil de realizar en comparación con dos de fijación de tensión de electrodos (TEVC) 10. Si bien el enfoque COVG requiere un equipo altamente especializado y elementos de procedimiento intrincados, puede permitir la adquisición de valiosadatos electrofisiológicos capaces. Estos datos, como conmutar corrientes con cinética rápida y corrientes de cola 4, se puede grabar sin algunos de los problemas asociados con otros protocolos de fijación de voltaje, incluyendo canal de decadencia. Pequeñas modificaciones en la configuración COVG pueden permitir el uso de controladores de temperatura y fluorometría fijación de voltaje (VCF). La inclusión de elementos de sujeción de fluorometría de tensión dentro del conjunto COVG puede aumentar la salida de datos por conferir la capacidad de monitorizar los cambios conformacionales de la proteína mientras que al mismo tiempo la grabación actual 11-13.

<table><tbody><tr><td>Solución externa</td><td>Marca</td> Número de <td>catálogo</td><td>[Final], peso o volumen</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>25mM</td></tr><tr><td>MES Sal de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>90mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Hidróxido de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variable (pH a 7.4)</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td><td></td>interna</tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>105mM</td></tr><tr><td>MES Sal de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5057</td><td>10mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>20mM</td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>2mM</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variable (pH a 7.4)</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td><td></td>despolarizante</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>110mM</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>1.5mM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Cajón</td><td>C021</td><td>0.8mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td>3M</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td></td>de<td>saponina</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>0.125g</td></tr><tr><td>Interno Solución</td><td>Ver arriba</td><td></td><td>50 ml</td></tr> de <tr><td>solución puente de agar</td> N-metil-D-glucamina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>100 ml de 1M</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International</td><td>H75030</td><td>1.2g</td></tr><tr><td>MES Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td>variable (pH a 7.4)</td></tr><tr><td>Agar granulado</td><td>Productos de investigación Internacional</td><td>A20250</td><td>3%</td></tr><tr><td>NMDG Solución</td><td></td><td></td><td></td>de almacenamiento</tr><tr><td>NMDG, HEPES, MES Solución hidratada</td><td>ver arriba</td><td></td><td>40 ml</td></tr> de <tr><td>agua</td><td></td><td></td><td>60 ml</td></tr><tr><td>Nombre del material/equipo Número de</td><td>catálogo</td> de <td>la empresa</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>Pinza de ovocitos de alto rendimiento</td><td>Dagan</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de adquisición de datos</td><td>Axon CNS</td><td>&nbsp; Osciloscopio Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tektronix&nbsp;</td><td>TDS 210</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de potencia para rack</td><td>APC&nbsp;</td><td>G5</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura de baño de calentamiento/enfriamiento</td><td>Dagan</td><td>HCC-100A</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Dell</td><td>Optiplex 990</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.3 Abrazadera de voltaje Software</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>pCLAMP10.3</td><td></td></tr><tr><td>TMC Plataforma de mesa de control de vibraciones</td><td>TMC SERIE</td><td>TMC 64 TMC</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aire de control de vibraciones TMC</td><td></td><td><a name="¡RANGO! Serie C10">20&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>V1/I Colector de datos de electrodos</td><td>Dagan</td> parte del micromanipulador <td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>MX10L</td><td>Siskiyou</td><td>MX10L</td><td></td></tr><tr><td>Baño/Protector (I/V) Headstage (con los conectores adecuados)</td><td>Dagan</td> parte del microscopio <td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Omano</td><td>OM2300S-JW11</td><td></td></tr><tr><td>Baño de control de temperatura</td><td>personalizado o Dagan personalizado o Dagan</td><td>personalizado o HE-204C</td><td>Cámara personalizada fabricada con materiales de polímeros fríos (serie D). Dagan también proporciona una etapa prefeabricada (HE-204C).</td></tr><tr><td>Contenedor de pellets de AgCl</td><td>personalizado Personalizado</td><td></td><td>Personalizado Electrodo</td></tr> de <tr><td>Ag/AgCl mecanizado a medida, pellet, 2.0 mm</td><td>Warner</td><td>E-206</td><td></td></tr><tr><td>Baño de ovocitos externo</td><td>Personalizado o Dagan</td><td>Personalizado o CC-1-T-LB</td><td>Mecanizado a medida o comprado en Dagan</td></tr><tr><td>Baño de ovocitos interno Personalizado</td><td>o Dagan</td><td>Personalizado o CC-TG-ND</td><td>Mecanizado a medida o comprado en Dagan</td></tr><tr><td>Capilares para puentes de agar y electrodos tirados</td><td>Warner</td><td>G150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Soportes giratorios para el microscopio, micromanipulador y baño</td><td>Siskiyou</td><td>SD-1280P</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner</td><td>LMI-600</td><td></td></tr><tr><td>Regular Bleach</td><td>Clorox</td><td>470174-764</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis Ovocitos</td><td>Nasco</td><td>LM535M (hembras sexualmente maduras)</td><td></td></tr><tr><td>90 Na+ Solución Externa</td><td>Ver Ficha</td><td></td><td></td>de Soluciones</tr><tr><td>10 Na+ Solución Interna</td><td>Ver Ficha</td><td></td><td></td>de Soluciones</tr><tr><td>3 M KCL</td><td>Ver ficha</td><td></td><td></td>de Soluciones</tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>NMDG Solución de almacenamiento</td><td>Ver ficha</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de solucionesPipetas de transferencia de 5 ml</td><td>SciMart</td><td>GS-52</td><td></td></tr><tr><td>Inyector de electrodo KCl modificado</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Punta de jeringa de plástico fundida para permitir la inyección de solución en los electrodos. Alternativamente, se puede comprar un Microfil de WPI.</td></tr><tr><td>Microvaccum</td><td>Pinza</td><td>personalizada</td><td></td></tr> personalizada <tr><td></td><td>VWR</td><td>63040-458</td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de manipulación de ovocitos (bomba de pipeta)</td><td>VWR</td><td>53502-222</td><td></td></tr><tr><td>Botella de agua desionizada</td><td>VWR</td><td>16649-911</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina vaselina Jelly</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Materiales adicionales necesarios para las grabaciones VCF:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio VCF</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI APO 40XW Objetivo NIR</td><td>Nikon</td><td>N40X-NIR</td><td></td></tr><tr><td>X-Y Sistema traductor para microscopios verticales de etapa fija</td><td>Sutter Instruments</td><td>MT500-586</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Baño</td><td></td> <td>de ovocitos VCF externo personalizadoMecanizado a medida. Las dimensiones de la cámara son 2,7 x 1,9 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Baño interno de ovocitos VCF</td><td>Custom</td><td></td><td>Mecanizado a medida. Las dimensiones de la cámara son 1,6 x 1,6 x 0,4 cm.</td></tr><tr><td>Baño de control de temperatura modificado</td><td>Custom</td><td></td><td>Cámara personalizada fabricada con materiales de polímeros fríos (serie D). Las dimensiones de la cámara del baño controlador de temperatura modificado son 2,7 x 1,9 x 0,3 cm para la cámara horizontal y 1 x 2,5 x 0,5 cm para la cámara vertical.</td></tr></tbody></table>

la<em&gt; xenopus</em&gt; ovocitos-cut abierta vaselina gap técnica voltage-clamp con fluorometría

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

La brecha vaselina ovocito a cielo abierto (COVG) técnica de fijación de voltaje permite el análisis de las propiedades electrofisiológicas y cinéticos de los canales iónicos heterólogos en ovocitos. Las grabaciones de la instalación a cielo abierto son particularmente útiles para la resolución de bajas corrientes de compuerta magnitud, la rápida activación de corriente iónica y desactivación. Los principales beneficios más de la fijación de voltaje de dos electrodos técnica (TEVC) incluyen el aumento de velocidad de la abrazadera, la mejora de la relación señal-ruido, y la capacidad de modular la intracelular y el medio extracelular. Aquí, utilizamos el canal de sodio cardíaco humano (HNA V 1.5), expresado en ovocitos de Xenopus, para demostrar la disposición a cielo abierto y el protocolo, así como las modificaciones que se requieren para agregar la capacidad de fluorometría de fijación de voltaje. Las propiedades de los canales iónicos de activación rápida, tales como HNA V 1.5, no se pueden resolver por completo cerca de la temperatura ambiente usando TEVC, en which la totalidad de la membrana del ovocito se sujeta, haciendo difícil el control de tensión. Sin embargo, en la técnica de cielo abierto, el aislamiento de sólo una pequeña parte de la membrana celular permite la rápida de sujeción requerida para registrar con precisión cinética rápida, mientras que la prevención de canal de carrera hacia abajo asociada con las técnicas de patch clamp. En conjunción con la técnica COVG, la cinética de los canales iónicos y propiedades electrofisiológicas pueden ensayarse adicionalmente utilizando fluorometría de fijación de voltaje, donde el movimiento de proteínas se realiza un seguimiento a través de cisteína conjugación de fluoróforos aplicadas extracelularmente, la inserción de las proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, o la incorporación de aminoácidos no naturales en la región de interés 1. Estos datos adicionales se obtiene información sobre cinética reordenamientos conformacionales dependientes de voltaje de la proteína a través de cambios en el microambiente que rodea la molécula fluorescente.

La Figura 4 muestra el cambio en la permeabilidad de los ovocitos como una solución de saponina se aplica a la sección inferior del ovocito. Figura 5 demuestra la tasa de intercambio solución intracelular por difusión siguiente permeabilización de saponina. 20-40 min se requieren para llegar a un estado de equilibrio 2,18. Figura 6A presenten trazas generadas desde el protocolo de grabación. La figura muestra las corrientes iónica...

El enfoque de BPA vaselina de corte abierto se utiliza para obtener bajos grabaciones de ruido de corrientes iónicas y conmutación de canales iónicos dependientes de voltaje expresados ​​en oocitos de Xenopus con alta resolución de la cinética de canal rápido. Con modificaciones menores, fluorometría de fijación de voltaje puede estar acoplado con el protocolo de ovocitos de corte abierto.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener grabaciones con bajo nivel de ruido de corrientes iónicas y de compuerta procedentes de canales iónicos activados por voltaje, expresados en células zap, con alta resolución temporal de la cinética rápida del canal. Esto se logra primero inyectando el ARNm del canal iónico grabado en ovocitos de rana. El segundo paso consiste en crear puentes de agar al moldear el tubo capilar y luego llenar el tubo con una solución de agar que contiene sal. A continuación, se prepara el montaje abierto para el experimento colocando todos los componentes, incluyendo el sitio UO y los puentes de agar, en sus ubicaciones designadas. El paso final consiste en insertar el microelectrodo en el sitio UO para permitir grabaciones mediante el método de bloqueo de voltaje. En última instancia, el protocolo de grabación se utiliza para mostrar corrientes iónicas provenientes de los canales iónicos localizados en la membrana del ovocito.La principal ventaja de la técnica de bloqueo de voltaje con preparación abierta es que permite grabaciones estables con bajo ruido de una población muy grande de canales iónicos. También permite una resolución rápida de la

the-xenopus-oocyte-cut-open-vaseline-gap-voltage-clamp-technique-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Se describen procedimientos optimizados para el aislamiento de folículos individuales, microinyecciones de ARN citoplasmático, la eliminación de capas celulares circundantes y la expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus. Además, se presenta un método simple para cambios rápidos de solución en experimentos electrofisiológicos con canales iónicos activados por ligandos.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Las grabaciones de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster permiten medir las colisiones oscuras espontáneas, los baches cuánticos, las respuestas macroscópicas a la luz y las relaciones tensión-corriente bajo diversas condiciones. En combinación con las herramientas de manipulación genética de D. melanogaster , este método permite el estudio de la vía omnipresente de señalización de los inositol-lípidos y su objetivo, el canal TRP.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.

Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

Aprende la técnica de corte con brecha de vaselina en oocitos de Xenopus para registrar corrientes iónicas con alta resolución temporal. Este método permite estudiar la cinética de canales iónicos con bajo ruido.

La

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