Name: En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprende a realizar microscopía de dos fotones in vivo para estudiar dinámicamente las terminaciones nerviosas cutáneas en ratones transgénicos YFP. Este método permite observar cambios longitudinales y lesiones selectivas con láser.

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Los autores desean agradecer a Neurotar Ltd. para la asistencia técnica, la Fundación de la CIMO y FGSN de apoyo financiero.

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por la Junta Nacional Experimental Animal, Finlandia. 1. Preparación Animal for Imaging <ol><li> Anestesiar a un ratón mediante inyección intraperitional (IP) de ketamina (0,08 mg por peso corporal) y xilazina (0,01 mg por peso corporal). Compruebe la anestesia con la parte trasera reflejo del pellizco del dedo del pie. </li><li> Sumergir los ojos de animales en gotas para los ojos (Viscotears) para proteger los ojos de la deshidratación. </li><li> Ponga el mouse sobre una almohadilla eléctrica (Supertech) a 37 ° C para evitar la hipotermia. </li><li> Limpiar la almohadilla de la pata designado para formación de imágenes con etanol al 70%. </li><li> Añadir una gota de agua sobre la piel de la almohadilla de la pata de inmersión para el acoplamiento entre la piel y la cubierta de vidrio. </li><li> Coloque el material de embalaje de plástico debajo de la pata trasera que se coloca debajo de un anillo de metal con clase de cobertura. </li><li> Ajustar el grosor del material de embalaje de plástico para aplanar la piel. </li><li> Ponga una gota de agua sobre la cubierta glass para la inmersión entre cubreobjetos y el objetivo. </li></ol> 2. metal Fixator Preparación Anillo <ol><li> Para la estabilización de la piel utilizar el fijador de metal. Utilizamos protegido Diseño Comunidad fijador de dos hojas con un anillo de metal (cortesía de Neurotar Ltd, Finlandia). Llene la jeringa con superglue, poner la pequeña gota de pegamento a través de la aguja en el anillo y extender suavemente el pegamento para la cobertura uniforme de la superficie del anillo. Es fundamental poner la mínima cantidad de pegamento que se necesita sólo para una cobertura uniforme, debido a la cantidad excesiva de pegamento puede reducir el campo de la visión y obstruir la imagen posterior. NOTA: Como alternativa, la combinación de una barra de metal (de debajo) y portaobjetos de vidrio de microscopio estándar (como una tapa) podría ser utilizado para aplanar la piel y para asegurar el acoplamiento óptico adecuado del conjunto 14. Dos clips de papel podrían ser utilizados para fijar la pata entre el vidrio y la superficie de la barra de metal (figura 4 </strong&gt;). </li><li> Cubra el anillo con tapa deslizante microscopio (5 mm de diámetro, Microscopía Electrónica de Ciencias). </li><li> Tornillo en el fijador de anillo de la barra de metal rígido que se montaged en la platina del microscopio motorizado. </li></ol> 3. Procedimiento Imaging <ol><li> En caso de utilizar los ratones Thy1-YFP-H, elija la parte azul del espectro de fluorescencia de la lámpara para visualizar las fibras nerviosas. Encuentra el nervio de interés en el modo de epifluorescencia y se centran en ella. </li><li> Anote las coordenadas de un lugar para la imagen longitudinal. Use una almohadilla carpiano como punto de referencia. Durante las siguientes sesiones de formación de imágenes, detectar primero la almohadilla del carpo y luego encontrar las mismas fibras nerviosas grandes aguas arriba y vuelva usando las coordenadas guardadas. Es esencial para posicionar la almohadilla de la pata en la misma dirección perpendicular a la barra de metal para mantener el mismo sistema de referencia. </li><li> Activar el modo de dos fotones. Para los ratones Thy1-YFP-H, es adecuado utilizar la longitud de onda de 950 nm de radiación láserpara visualizar las fibras nerviosas. </li><li> Seleccionar la longitud de onda de emisión láser y canales (450 a 480 nm para la detección de segunda generación armónica, 520-550 nm para la obtención de imágenes de los nervios etiquetados-YFP y 580-630 nm para la detección de fluorescencia y YFP autofluorescencia del cabello), comenzar con láser de baja potencia (3-5%) para prevenir el fotodaño y blanqueo. La tensión típica en los tubos fotomultiplicadores es 600-700 V para este tipo de formación de imágenes. </li><li> Ajuste la resolución deseada (512 x 512 o 640 x 640 para mediciones de procesos rápidos, 800 x 800 o 1024 x 1024 para imágenes morfológicas), paso axial (1-3 micras), el espesor de la muestra y los intervalos de tiempo (1-10 min). El tiempo de exposición es en el orden de 1 ms por un píxel. </li><li> Primero marcar los límites superior e inferior del volumen de formación de imágenes en el software. </li><li> Adquirir la pila de imágenes de referencia para la referencia antes de la lesión. Cuando sea necesario, es posible grabar la línea de base durante varios minutos. </li><li&gt; Repetidamente (al menos cada 10-15 minutos) comprobar el ritmo respiratorio de los animales y los reflejos, cuando sea necesario aplicar una cantidad adicional de anestésicos. </li><li> Después de la formación de imágenes limpia la almohadilla con un pañuelo de papel y poner el ratón en una caja de recuperación a 36 ° C hasta que esté completamente despierto. NOTA: Por lo general, la duración de una sesión de imágenes combinadas con lesión inducida por láser (ver más abajo) no sea superior a 1 hora. Se recomienda verificar que el animal está profundamente anestesiado cada 10-15 minutos; esto no debería interferir con la formación de imágenes en sí, sino que debe ser considerado, mientras que está previsto procedimiento experimental. La duración del efecto de una dosis única de ketamina / xylazyne es de alrededor de 30 a 40 min, por lo tanto se recomienda aplicar adicional de ¼ a ½ dosis después de 25-30 min. NOTA: Se debe considerar también cuando la experimentación es la planificación que la frecuencia de las sesiones de formación de imágenes de un animal individual no debe exceder de 1 sesión por 2 días para evitar los efectos adversos de la reanestesia competitiva. </li></ol> 4. Laser lesión <ol><li> Después de la adquisición de la imagen de referencia de pila, utilice el protocolo de blanqueo para hacer una lesión micro. </li><li> Aumentar la potencia del láser al 100%. </li><li> Aumentar el tiempo de exposición a 100-1.000 ms por región de interés (100-1,000x más que en el caso de las imágenes estándar). </li><li> Esquema de la zona de la lesión. </li><li> Hacer la lesión por el cambio en el blanqueo. </li><li> Vuelva al modo de imagen normal y continuar con las grabaciones time-lapse. </li></ol> 5. Procesamiento y Análisis de Datos <ol><li> Proceda con desmezcla espectral usando desmezcla plugin en ImageJ 8 (Joachim Walter, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html</a> ). </li><li> Abra la pila de imágenes y dividir los canales. </li><li> Encuentra el área libre de los nervios o de pelo para las mediciones de fondo. Ponga una región of interés en esa área. </li><li> Esquema cuidadosamente la parte del cabello donde se distingue claramente de los nervios. </li><li> Esquema del nervio en la parte de la imagen donde es separado del cabello. </li><li> Ahorra desmezcla matriz. </li><li> Aplicar matriz desmezcla medido para toda la pila. </li><li> Guarde los nuevos pilas de imágenes procesadas en formato * .tif. </li></ol>

<ol><li>Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sensory+transduction+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sensory transduction in the skin.</a> Nature. 445, 858-865 (2007).</li>
<li>Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+epidermal+nerves+in+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy.</a> Neurology. 47, 1042-1048 (1996).</li>
<li>Wu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morton%27s+interdigital+neuroma%3A+a+clinical+review+of+its+etiology%2C+treatment%2C+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Foot+Ankle+Surg%22%5BJournal%5D)">Morton's interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results.</a> J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).</li>
<li>Lauria, G., Lombardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy%3A+a+new+tool+for+diagnosing+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy.</a> BMJ. 334, 1159-1162 (2007).</li>
<li>Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+plasticity+of+axons+within+a+cutaneous+milieu%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu.</a> J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).</li>
<li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J Vis Exp. (46), e2062(2010).</li>
<li>Sacconi, L., O'Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502(2007).</li>
<li>Rasband, W.S., ImageJ. , US National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Robinson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+injury+to+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Traumatic injury to peripheral nerves.</a> Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Amit, S., Yaron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+systems+for+in+vivo+monitoring+and+microenvironmental+investigations+of+diabetic+neuropathy+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model.</a> J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).</li>
<li>Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+the+dorsal+root+ganglion+of+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats.</a> Mol Pain. 7, 63(2011).</li>
<li>Yuryev, M., Khiroug, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+longitudinal+investigation+of+individual+nerve+endings+in+the+skin+of+anesthetized+mice+using+in+vivo+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy.</a> J Biomed Opt. 17, 046007(2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este protocolo de vídeo se demuestra el método para longitudinal dos fotones de imágenes no invasiva de las terminaciones nerviosas individuales. La dinámica de la inervación de la piel se ve afectada en enfermedades tales como la psoriasis y la neuropatía periférica 2, y en lesiones traumáticas 9. Dos fotones de imágenes permite el análisis detallado de las estructuras de fibras nerviosas en la matriz de colágeno. El uso de ratones transgénicos reportero ayuda a evi...

A correction was made to <a href="/video/51045">In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin</a>.
Leonard Khiroug was removed as an author.

Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Terminaciones nerviosas cutáneas experimentan cambios dinámicos en diferentes estados fisiopatológicos. Las fibras nerviosas pueden pasar por el proceso de degeneración y regeneración o reestructuración en el curso de estas enfermedades como la neuropatía periférica 2 o Morton neuroma 3. Después de una lesión traumática, una parte importante de la dinámica de terminaciones nerviosas en la piel es la reinervación de la zona dañada. Sin embargo, el enfoque común para la investigación de las terminaciones nerviosas es ex vivo seccionamiento histológico que carece de información en tiempo real sobre los procesos en curso 4. El uso de marcadores fluorescentes codificadas genéticamente, es posible realizar un seguimiento de las terminaciones nerviosas en la piel de animales vivos, obteniendo así información rica y significativamente más pertinente sobre los cambios estructurales. La investigación de las terminaciones nerviosas cutáneas es posible utilizando microscopía de fluorescencia convencional, sin embargo, la luz fuerte dispersión de la tejido de la piel socava fuertemente en la calidadde los datos adquiridos 5. Microscopía multifotónica permite la adquisición de imágenes de alta resolución en los tejidos debido a la fuerte dispersión de la suma no lineal de la energía de los fotones de luz de excitación resultantes en la emisión de fluorescencia sólo desde el punto focal del objetivo. Este efecto conduce a un fuerte incremento en la profundidad de penetración y la mejora de la relación señal-ruido para la medición en los tejidos de la piel 6. Utilizando el mismo láser como para formación de imágenes, es posible producir la disección selectiva de las fibras nerviosas 7. En el siguiente protocolo se muestra el método de formación de imágenes longitudinal de las terminaciones nerviosas cutáneas in vivo en ratones transgénicos reportero combinado con lesión selectiva por láser utilizando el sistema de microscopio multifotónica disponible comercialmente.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos redondos&nbsp;</td><td>Microscopía Electrónica Ciencia</td><td>72296-05</td><td>5 mm de diámetro #1.5 espesor</td></tr><tr><td>Gotas para los ojos Viscotears</td><td>Novartis</td><td></td><td>2 mg/g</td></tr><tr><td>Superglue Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>135429</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol</td><td>Intervet</td><td></td><td>Ketamina 50 mg/ml, solución de trabajo 10 mg/ml (úselo 80 y micro; g por gramo de peso animal)</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>Xilacina 20 mg/ml, solución de trabajo 1,25 mg/ml (úselo 10 y micro; g por gramo de peso animal)</td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada o agua</td><td></td><td></td><td></td>Milli-Q</tr><tr><td>Jeringas 1 ml</td><td>BD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>30 G Agujas de 1/2"</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr>Material <td></td><td></td> de<td>embalaje de plástico</td><td>Se puede comprar en la ferretería</td></tr><tr><td>general Microscopio FV-1000MPE</td><td>Olympus</td><td>FV-1000MPE</td><td>Microscopio con platina motorizada y barra metálica rígida para la fijación</td></tr><tr><td>Objetivo XLPlan 25X Olympus XLPLN</td><td></td><td>25XWMP</td><td>Objetivo de inmersión en agua optimizado para imágenes multifotónicas</td></tr><tr><td>Láser Mai-Tai DeepSee (2 W)</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td>Almohadilla térmica con controlador de temperatura</td></tr><tr><td>Fijador</td> <td>de anillo metálicoNeurotar Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Software de código abierto para el procesamiento y análisis de imágenes, http://rsbweb.nih.gov/ij/&nbsp;</td></tr><tr><td>Thy1-YFPH ratones cepa</td><td>JaxLab</td><td>003782</td><td></td></tr></tbody></table>

en vivo de dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Las terminaciones nerviosas en la piel están implicadas en procesos fisiológicos tales como la detección de 1, así como en procesos patológicos tales como dolor neuropático 2. Su posicionamiento de cerca a la superficie facilita imágenes microscópicas de las terminaciones nerviosas de la piel en la que viven los animales intactos. Usando microscopía multifotónica, es posible obtener imágenes finas superar el problema de la fuerte dispersión de la luz del tejido de la piel. Reportero ratones transgénicos que expresan EYFP bajo el control del promotor Thy-1 en las neuronas (incluyendo neuronas sensoriales periferia) son muy adecuados para los estudios longitudinales de las terminaciones nerviosas individuales durante períodos prolongados de tiempo hasta varios meses o incluso largo de la vida. Además, usando el mismo láser de femtosegundo como para la formación de imágenes, es posible producir lesiones altamente selectivos de fibras nerviosas para los estudios de la reestructuración de la fibra nerviosa. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable para multifotón longitudinal de imágenes in vivo ymicrocirugía láser basado en las terminaciones nerviosas de la piel de ratones.

Usando la técnica descrita es posible un seguimiento de la misma fibra después de la lesión y para estudiar la degradación de las terminaciones nerviosas dañadas (Figura 1). Adquisición de la pila con el espesor de 120-150 micras es generalmente adecuado para la formación de imágenes repetitivo durante varios días con el fin de mantener a toda la fibra en el campo de visión. La lesión típicamente se puede producir de forma concisa cuando el material de los envases de plástic...

Se presenta el protocolo para la formación de imágenes longitudinal dinámico y lesión selectiva por láser de las terminaciones nerviosas en ratones transgénicos reportero.

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

El objetivo del siguiente procedimiento es estudiar los cambios dinámicos longitudinales en las terminaciones nerviosas de la piel tras una lesión selectiva. Para ello, anestesiamos un ratón transgénico YFP y lo colocamos sobre una almohadilla calefactora para mantener la temperatura corporal. Coloque la pata trasera sobre un material de embalaje de plástico y coloque una gota de agua sobre la piel para lograr un mejor acoplamiento óptico.Cubra el polo posterior con un cubreobjetos de vidrio firmemente sujeto a una barra metálica para mayor estabilidad. Coloque una gota de agua para el objetivo de inmersión en agua y realice un aumento doble en la imagen microscópica. Combinado con la lesión inducida por láser en las terminaciones nerviosas, una variedad de condiciones patológicas afectan la dinámica de las integraciones cutáneas.Una de las mejores formas de comprobar este efecto es visualizar directamente los cambios patológicos en las terminaciones nerviosas cutáneas dentro de la piel de un animal vivo. La microscopía foto en vivo es una excelente herramienta para este enfoque. Antes de la imagen, pese al ratón e induzca anestesia mediante la inyección de ketamina en una concentr

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Investigación

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Aprende a realizar microscopía de dos fotones in vivo para estudiar dinámicamente las terminaciones nerviosas cutáneas en ratones transgénicos YFP. Este método permite observar cambios longitudinales y lesiones selectivas con láser.

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

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