Name: Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-27T23:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Descubre el cocultivo con amebas para aislar patógenos intracelulares de muestras ambientales o clínicas. Este método innovador permite identificar nuevas bacterias y virus desconocidos mediante microscopía y secuenciación.

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Agradecemos Pr. Bernard La Scola para consejos técnicos útiles y discusión interesante sobre el co-cultivo de amebas y enriquecimiento de amebas. También agradecemos a la Dra. Vincent Thomas por su ayuda en la implementación de la técnica en nuestro laboratorio.

1. Amebas Coculture 1.1 Preparación de la muestra <ol><li> Muestra Ambiental <ol><li> Las muestras de agua Se filtra la muestra de agua (500 ml a 1 L) a través de una membrana de tamaño de poro 0,22 micras. Luego, sacuda la membrana en solución salina ameba medianas PAS de Página (120 mg de NaCl, 4 mg de MgSO4 • 7H 2 O, 4 mg de CaCl2 • 2H 2 O, 142 mg de Na 2 HPO 4, y 136 mg de KH 2 PO 4 en 1 L de agua destilada). </li><li> Las muestras sólidas Resuspender muestras sólidas como muestras de suelo o de arena y las muestras semi-sólidas, tales como lodos activados en agua destilada o PBS y filtrar a través de una membrana de tamaño de poro 0,22 micras. Luego, sacuda la membrana en el PAS. </li><li> Las muestras altamente contaminadas con amebas endógeno y protozoos Primera sedimentar las muestras mediante centrifugación a baja velocidad (180 xg) foR 10 minutos o por filtración a través de una membrana de tamaño de poro 5 micras. Además procesar el sobrenadante (filtrado, respectivamente), como en 1.1.1. Nota: Otras técnicas de descontaminación podrían utilizarse para descontaminar más muestras ambientales: Se calienta la muestra a 50 ° C durante 30 minutos o tratar con soluciones ácidas o básicas 14. </li></ol></li><li> Muestra clínica Procesar las muestras clínicas en función de sus propiedades físico-químicas. Filtrar o centrifugar líquidos para eliminar las impurezas grandes. Resuspender muestras sólidas. Para utilizar los tejidos, se muelen, por ejemplo mediante el uso de un homogeneiser Dounce o perlas de vidrio, y lisar las células para liberar las bacterias intracelulares. </li></ol> 1.2 Preparación Amebas <ol><li> Preparación Caldo Prepare los siguientes medios: a ricos medios que contienen peptona, extracto de levadura y glucosa (PYG; 100 g de peptona proteasa, 10 g de extracto de levadura, 4,9 g de MgSO4 • 7H 2O, 5 g de citrato de sodio • 2H 2 O, 0,1 g de Fe (NH4) 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, 1,7 g de KH 2 PO 4, 1,97 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O , 45 g de glucosa, y 0,295 g de CaCl2 en 5 L de agua destilada) y un medio no nutritivo tales como el PAS para las especies de Acanthamoeba. </li><li> Cultura amebas <ol><li> Cultivar amebas (preferentemente Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 o A. polyphaga Linc-AP1) a 25 ° C en frascos de cultivo de células que contienen 30 ml de medio PYG. </li><li> Se recoge el amebas por agitación vigorosa del matraz y se centrifuga la suspensión celular durante 10 min a 1500 x g. Lavar el pellet dos veces con medio PAS. Contar las células en un portaobjetos Kova y ajustar el volumen para obtener una suspensión de 5 x 10 5 células por ml. </li><li> Transferir la suspensión de amebas en microplacas. Utilice 1 ml por pocillo de 12 - y 24-wplacas de ELL, 500 l de placas de 48 pocillos y 300 l de placas de 96 pocillos. Incubar la microplaca durante al menos 2 horas a 25 ° C. Esto permite la sedimentación y la fijación de las amebas a la parte inferior de cada pocillo. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol><li> La inoculación de la muestra <ol><li> Inocular la placa de 2.3.3 con diluciones seriadas de la muestra de 1,1 o 1,2, por lo general con la serie de dilución de 10 veces, comenzando con 100 l de muestra no diluida. </li><li> Centrifugar la microplaca a 1800 xg durante 10 min a sedimentos en el césped de amebas los microorganismos potencialmente presentes en la muestra. Esto aumenta el contacto y la fagocitosis de los microorganismos por amebas. </li><li> Las placas se incuban durante 45 minutos a 25 ° C y lavar tres veces con PAS mediante la sustitución de los medios de comunicación con el PAS fresco. Añadir 1 ml por pocillo de PAS con o sin adición de antibióticos (estreptomicina, penicilina, gentamicina y / o vancomicina), dependiendo de las bacteriuriacol especies que se buscan. </li><li> Incubar la microplaca a 32 ° C en una atmósfera humidificada para evitar el enquistamiento de las amebas. Observar cada pocillo a diario con un objetivo 20X para detectar la presencia de bacterias invasoras y de lisis amebas. </li><li> En el caso de la lisis, realizar un subcultivo en amebas fresco mediante la inoculación de 100 l de cocultivos a una monocapa de aproximadamente 10 5 amebas / cm 2. Para aislar específicamente una determinada especie bacteriana, inocular también medios de agar específico diseñado para estas bacterias (por ejemplo, agar BCYE por Legionella spp.). </li><li> En ausencia de lisis, tome 100 l de cocultivos cuatro a siete días después de la primera inoculación y inocular un cultivo fresco de amebas de 900 l en una placa de 24 pocillos. Si se observa la lisis rápida de las amebas sin proliferación de bacterias, un virus puede estar presente. En este caso, se filtra el sobrenadante a 0,22 micras y utilizar la suspensión se filtró para infectar amebas fresco. </li></ol&gt; </li></ol> 1.4 Aislamiento bacteriano y caracterización <ol><li> Tinción bacteriana Realice cocultivos directamente en cubreobjetos de vidrio en 24-así microplacas. Retire el medio y llevar a cabo la tinción o inmunofluorescencia. <ol><li> Tinción de Romanowsky Modificado <ol><li> Deje que el portaobjetos seco. Sumergir el cubreobjetos cinco veces en la solución de fijación (2 mg / L de Fast Green en metanol). </li><li> Sumergir el cubreobjetos cinco veces en la solución de tinción I (1,22 g / L de Eosina G en tampón fosfato pH 6.6) </li><li> Finalmente, sumerja el cubreobjetos 5 veces en la solución de tinción II (1,1 g / L de tiazina en tampón fosfato pH 6,6). </li><li> Enjuague la muestra con agua destilada. Dejar secar y observar por microscopía. </li></ol></li><li> La tinción de Ziehl-Neelsen <ol><li> Deje que el portaobjetos seco. Cubra la muestra con Ziehl fucsina. Calentar el tinte con una llama hasta que aparezcan vapores. </li><li> Enfriar a temperatura ambiente durante al menos 5 miny enjuague con agua destilada. Cubra la muestra con solución de ácido clorhídrico al 3% en isopropanol durante 2 minutos y enjuagar con agua destilada. </li><li> Cubra durante 30 segundos con azul de metileno y enjuague con agua destilada. Dejar secar y observar por microscopía 22. </li></ol></li><li> Tinción Gimenez <ol><li> Preparar una solución de fucsina básica de stock mediante la mezcla de 100 ml de 10% fucsina básica (10 g de fucsina básica en 100 ml de etanol al 95%), fenol acuosa 250 ml de 4% y 650 ml de agua destilada. Incubar a 37 ° C durante 48 horas antes de su uso. </li><li> Deje que el portaobjetos se seque y fije haciéndolo pasar a través de la llama. Cubra la muestra con fucsina básica recién filtrada (4 ml de solución de fucsina básica de stock en 10 ml de 0,1 M de tampón de fosfato de sodio, pH 7,45) durante 2 min. </li><li> Enjuague la muestra con agua y se incuban en verde de malaquita (0,8% en agua destilada) durante 10 seg. Enjuagar nuevamente con agua y repita la tinción de verde malaquita. Enjuagar nuevamente con agua. Deje que el cubreobjetos secos, mporte, y observar por microscopía 23. </li></ol></li><li> Inmunofluorescencia <ol><li> Fijar el cubreobjetos incubando en metanol durante 5 min o con paraformaldehído al 4% durante 10 min. </li><li> Lavar tres veces con PBS y se incuba durante 2 horas en solución de bloqueo (5% de BSA, 0,1% de saponina en PBS) a temperatura ambiente. </li><li> Incubar el portaobjetos durante 1 hora en solución de bloqueo que contiene anticuerpos producidos contra el microorganismo de interés. </li><li> Lavar de nuevo tres veces en PBS e incubar durante 1 hora con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario y enlazada a un fluoróforo. Lavar tres veces con PBS, montar el cubreobjetos y observar por microscopía de fluorescencia. </li></ol></li></ol></li><li> La detección de ADN por PCR Extracto de ADN de 100 a 200 l de cocultivo de amebas. Detectar microorganismos con cebadores universales dirigidos al gen 16S rRNA o cebadores específicos para especies de interés tales como micobacterias 24, Legionella 25 o los miembros de la 26 Chlamydiales. </li></ol> 2. Enriquecimiento amebas 2.1. Preparación de la muestra Resuspender muestras sólidas y semi-sólidos en el PAS por agitación. Centrifugar la suspensión a baja velocidad (180 xg) durante 10 min. Esto permite el enriquecimiento de las amebas de vida libre en el sedimento. El sobrenadante puede ser utilizado para el cocultivo de amebas y el sedimento para el enriquecimiento de amebas 21. 2.2. Preparación Mediana <ol><li> Añadir 1,5 g de agar a 100 ml de PAS y autoclave el medio 15 minutos a 121 ° C. Verter el medio caliente en placas de Petri y dejar que se solidifique a temperatura ambiente. </li><li> Crecer Escherichia coli (ATCC 25922) en LB o caldo de tioglicolato la noche a 37 ° C. Lavar las bacterias dos veces con PBS y resuspender en medio de PAS. Diluir 10 veces en PAS y difundir 2-3 ml de esta dilución en una placa de agar PAS y dejar secar. </li></ol> Añadir una gota de muestra (o un trozo de filtro) en un lado de la placa y dejar que fluya sobre la placa de Petri para formar una línea en el centro del plato. 2.4. Crecimiento amebas amebas y la subcultura <ol><li> Observar la placa de Petri diaria. Si se detecta un frente de migración amebas, cortar un pequeño trozo de agar en el frente de migración e inocular un fresco plato de Petri NNA cubierto con un césped de E. coli. </li><li> Repita la reinoculación varias veces dependiendo de la pureza de la muestra, con el fin de tener un cultivo puro de una cepa de amebas dado. </li></ol> 2.5. Las amebas y bacterias caracterización <ol><li> Raspar las células y resuspender en PAS. </li><li> Extraer el ADN y determinar la identidad de las amebas y / o endosimbiontes bacterianos por PCR y secuenciación (amplificación de 16S rRNA para las bacterias, resp. 18S ARNr de las amebas y secuenciación, por ejemplo). </li> &lt;li&gt; Utilice estas células tomadas por raspado en PAS para inocular amebas nuevo y hacer una co-cultivo de amebas para detectar bacterias posiblemente presentes en la muestra. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Cocultivo amebas y enriquecimiento amebas son métodos eficientes que permitieron el aislamiento de muchas nuevas especies de bacterias y amebas. Los resultados obtenidos con estos métodos confirman la presencia ubicua de los dos amebas y bacterias ameba-resistencia en el medio ambiente, y lo más interesante de las redes de agua artificiales que se consideran para ser controlada por tratamientos químicos tales como cloración y ozonización. Cocultivo amebas y enriquecimiento amebas son herramientas esenciales para aislar ...

Antes de la llegada del diagnóstico molecular, los microorganismos presentes en los nichos ambientales o en las muestras clínicas se detectan generalmente mediante su cultivo en diferentes medios selectivos, principalmente en agar en placas de Petri. El fenotipo de las colonias bacterianas y su actividad metabólica después se dejó clasificación bacteriana a nivel de especies. Caldo también puede utilizarse para aumentar la sensibilidad de detección. Sin embargo, ambas técnicas no permiten la recuperación de bacterias que crecen lentamente o en absoluto en estos medios. Esta es la razón por qué los enfoques moleculares se usan tan ampliamente hoy en día. Sin embargo, la detección de ADN no proporciona ninguna pista sobre la viabilidad de las bacterias. Por otra parte, contrariamente a la cultura, enfoques moleculares no dan lugar a una cepa que puede caracterizarse adicionalmente. El estudio de los patógenos que crecen pobremente en medios sólidos o que las células necesitan para crecer es complicado. La mayoría de estos &quot;difíciles de cultivar&quot; las bacterias son intr fastidiosobacterias acelulares, a menudo descubiertas y caracterizadas siguiente brotes grandes como lo fue el caso de la Legionella pneumophila. Esta bacteria se caracterizó después de un brote que se produjo durante una convención de la Legión Americana. Nada menos que 182 personas fueron infectadas y 29 murieron a causa de una neumonía grave 1,2. Se demostró más tarde que las amebas son los huéspedes naturales de esta bacteria y que su presencia en las redes hotel de sistemas de aire acondicionado y el agua estaba en el origen del brote de la enfermedad de la llamada del legionario 3. Las amebas están presentes en todo el mundo y fueron aisladas de suelo, el aire, el agua y la mucosa nasal de voluntarios humanos (revisado en 4). Estas amebas &quot;vida libre&quot; generalmente se divide de forma autónoma en el medio ambiente, pero en ocasiones puede invadir anfitriones permisivas 5. Las amebas de alimentación en varios microorganismos a través de la fagocitosis y la posterior digestión lisosomal por Hydrolases 6. Muchas bacterias intracelulares facultativas o obligar son capaces de resistir la digestión y así infectar y dividir en amebas como por ejemplo bacterias o micobacterias relacionadas con clamidia Legionella, (revisado en 7 y 8). Amebas de vida libre, probablemente, representan un importante reservorio potencial de bacterias intracelulares que aún no han sido descubiertos. Esto llevó a nuestro grupo para implementar en Lausana dos técnicas principales, llamados co-cultivo de amebas amebas y enriquecimiento, lo que permitió los diferentes grupos para aislar varios nuevos microorganismos intracelulares obligados de diversas muestras ambientales 9-15. Desde amebas son fagocitos profesionales que pastan en las bacterias, una bacteria capaz de resistir la fagocitosis y de crecer dentro de estos protistas también puede colonizar los fagocitos humanos y ser patógeno para los seres humanos. Esto fue parcialmente demostrada por algunas bacterias relacionadas con la clamidia, como Waddlia chondrophila. W. chondrophila puede crecer no sólo en las amebas, sino también en varios tipos de células, tales como células de mamífero epiteliales, macrófagos, y las líneas celulares de peces 16-18. El cocultivo de amebas también aparece relevante para la detección de bacterias intracelulares en muestras clínicas 19,20, incluyendo las heces, que están fuertemente contaminados con diferentes especies bacterianas 21. Aquí se describen los pasos principales de cocultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas, incluyendo (a) el tratamiento de muestras ambientales o clínicos; (b) el crecimiento de las amebas en medios axénicos y en un césped bacteriano de Escherichia coli y (c) la selección y caracterización de bacterias intracelulares.

<table><tbody><tr><td>Glucosa monohidrato</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; membrana de tamaño de poro</td><td>m Merck Millipore, Darmstadt, Alemania</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>peptona proteosa</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Kova slide</td><td>Hycor, Indianápolis, IN</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>microplacas de cultivo celular</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción Diff-Quik</td><td>Siemens Healthcare diagn., Múnich, Alemania</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fucsina</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>básico fucsina</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Oxalato verde de malaquita</td> corrosivo y mutagénico <td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 16%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas coculture y enfoques amebas enriquecimiento

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Los patógenos intracelulares tales como legionella, micobacterias y organismos Chlamydia como son difíciles de aislar porque a menudo crecen poco o nada en absoluto en un medio selectivo que por lo general se utilizan para cultivar bacterias. Por esta razón, muchos de estos patógenos fueron descubiertas sólo recientemente o después de los brotes importantes. Estos patógenos se asocian a menudo con las amebas, que sirven como la célula huésped y permitir la supervivencia y el crecimiento de las bacterias. Pretendemos aquí para proporcionar una demostración de dos técnicas que permiten el aislamiento y caracterización de patógenos intracelulares presentes en muestras clínicas o ambientales: el co-cultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas. Cocultivo de amebas permite la recuperación de bacterias intracelulares mediante la inoculación de la muestra investigada en un césped de amebas que puede ser infectado y se lisaron por las bacterias intracelulares presentes en la muestra. Enriquecimiento de amebas permite la recuperación de las amebas presente en una muestra clínica o ambiental. Thse puede conducir al descubrimiento de nuevas especies de amebas, pero también de nuevas bacterias intracelulares que crecen específicamente en estas amebas. Juntas, estas dos técnicas ayudan a descubrir nuevas bacterias intracelulares capaces de crecer en las amebas. Debido a su capacidad para infectar las amebas y resistir la fagocitosis, estas bacterias intracelulares también pueden escapar de la fagocitosis por los macrófagos y, por tanto, ser patógenos para los eucariotas superiores.

Uso de cocultivo de amebas y el enriquecimiento de amebas, toda una gama de bacterias del medio ambiente y / o patógenos se descubrió (Tabla 1). Cocultivo amebas fue utilizado por nuestro grupo y otros para analizar las muestras ambientales, plantas de tratamiento de agua y sistemas de distribución de agua. Una amplia gama de microorganismos puede ser aislado con esta técnica. Las bacterias más comunes aisladas por cocultivo amebas son miembros del género Mycobacterium</...

Cocultivo de amebas es un sistema de cultivo celular usando amebas adherente a crecer selectivamente a los patógenos intracelulares capaces de resistir las células fagocíticas tales como amebas y macrófagos. Por lo tanto, representa una herramienta clave para descubrir nuevos agentes infecciosos. Enriquecimiento amebas permite el descubrimiento de nuevas especies de amebas y de sus bacterias intracelulares específicos.

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en aislar nuevos patógenos intracelulares potenciales presentes en muestras ambientales o clínicas. Esto se logra mediante la inoculación de la muestra de interés en un cultivo de AME con el fin de seleccionar bacterias capaces de entrar y multiplicarse en amebas. A continuación, se analizan más a fondo las amebas que han sido lisadas o en las que se observa un crecimiento intracelular claro, con el propósito de identificar el microorganismo a nivel de especie.Luego, si no se obtiene crecimiento bacteriano utilizando el método de co-cultivo con amebas, se realiza un enriquecimiento de amebas para detectar amebas endógenas que podrían contener bacterias intracelulares específicas. Los resultados obtenidos incluyen el aislamiento de nuevas especies bacterianas y virus novedosos mediante este método innovador, que puede caracterizarse más a fondo mediante técnicas como microscopía y secuenciación del genoma. Las principales ventajas de estas técnicas frente a otros métodos existentes, como el cultivo cénico o el cultivo en células de mamífero, son que pueden aplicarse para aislar bacterias estrictamente intracelulares o incluso ut

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Eucariotas microbianos son tanto una fuente de carbono derivado de la fotosíntesis y las principales especies depredadoras en forma permanente lagos cubiertos de hielo del Antártico. Este informe describe un enfoque de enriquecimiento de la cultura para aislar microbios eucariotas metabólicamente versátiles desde el lago de la Antártida, el lago Bonney, y evalúa el potencial de fijación de carbono inorgánico utilizando un ensayo de radioisótopos para la ribulosa-1 ,5-bisphophate carboxilasa...

Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.

Las infecciones tratables con células de mamíferos Protozoarios cebados con bacterias

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

Describimos aquí los últimos avances en aislamiento viral para la caracterización de nuevos genotipos de Faustovirus, un nuevo linaje de virus gigantes relacionado con asfarvirus. Este protocolo se puede aplicar al aislamiento de alto rendimiento de virus, especialmente virus gigantes que infectan amebas.

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Se desarrolló un ensayo en tiempo real de alto rendimiento para identificar simultáneamente (1) antimicrobianos penetrantes en células eucariotas dirigidos a un patógeno bacteriano intracelular, y (2) evaluar la citotoxicidad de las células eucariotas. Posteriormente, se combinó una variación de la misma tecnología con la tecnología de dispensación digital para permitir estudios fáciles, de alta resolución, de dosis-respuesta y de sinergia bidimensional y tridimensional.

De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Aquí, presentamos dos protocolos para estudiar las interacciones de la fagocito -abscessus de la micobacteria : la proyección de una biblioteca mutante de transposon de deficiencia intracelular bacteriana y la determinación de transcriptoma bacteriana intracelular de RNA secuencia. Ambos enfoques proporcionan información sobre las ventajas genómicos y transcriptómicos adaptaciones mejorar la aptitud de las bacterias intracelulares.

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

Aquí, presentamos un protocolo para medir la virulencia de las bacterias planctónicas o conectado a superficie utilizando D. discoideum (ameba) como anfitrión. Virulencia se mide durante un período de 1 h y anfitrión matando se cuantifica usando análisis de imagen y microscopia de fluorescencia. Demostramos este protocolo utilizando la bacteria p. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Este artículo detalla un protocolo para preparar un cocultivo de células criptocócicas y amebas que se estudia utilizando imágenes fijas fluorescentes e imágenes de microscopio electrónico de transmisión de alta resolución. Aquí se ilustra cómo los datos cuantitativos pueden complementar esa información cualitativa.

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

Los ensayos de interacción de cocultura presentados en este protocolo son económicos, de alto rendimiento y simples. Estos ensayos se pueden utilizar para observar interacciones microbianas en el cocultivo, identificar patrones de interacción y caracterizar el potencial inhibitorio de una cepa microbiana de interés contra patógenos humanos y ambientales.

Ensayos de cocultura de alto rendimiento para la investigación de interacciones microbianas

Se demuestra un nuevo método de preparación de muestras para el análisis de macrocolonias bacterianas basadas en agar mediante espectrometría de masas de imágenes de ionización / desorción láser asistida por matriz.

Investigación de la cooperación microbiana a través del análisis de espectrometría de masas de imágenes de colonias bacterianas cultivadas en agar y en tejidos durante la infección

Descubre el cocultivo con amebas para aislar patógenos intracelulares de muestras ambientales o clínicas. Este método innovador permite identificar nuevas bacterias y virus desconocidos mediante microscopía y secuenciación.

Descubrimiento de nuevos patógenos intracelulares por amebas Coculture y Enfoques amebas Enriquecimiento

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