Name: Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende el protocolo de extensión de probóscide en abejas melíferas para estudiar plasticidad del comportamiento. Este método permite evaluar el aprendizaje asociativo y los efectos de factores ambientales en insectos polinizadores.

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Esta investigación fue financiada por los NIH CNRR (R01 RR014166 a BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (J Trumble PI; BH Smith co-PI) y la Universidad Estatal de Arizona. Los fondos para el taller para capacitar a los estudiantes (datos de la Figura 4) fue proporcionado por la Fundación de Ciencias de Chile.

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<li>Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+blocking+in+odorant+mixtures%3A+an+increase+but+not+a+decrease+in+intensity+of+reinforcement+produces+unblocking%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking.</a> Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Este protocolo presenta dos métodos fiables para el acondicionamiento mediante el procedimiento de PER. Estos son dos de los varios métodos que se han empleado con éxito 27, 21. Empleamos el método 2 para todos los estudios experimentales utilizando PER, ya que es siempre fiable, incluso a través de diferentes experimentadores. El mismo procedimiento básico se ha adaptado a muchos tipos diferentes de estudios con abejas de la miel, como el uso de diferentes estímulos y condicionantes diferentes reflejos conductuales. También se ha relacionado a las investigaciones de la base genética de las diferencias en el aprendizaje de 28,29, las correlaciones fisiológicas de la percepción olfativa y la memoria en el cerebro 13,14,30, y los moduladores y moleculares bases genéticas de la conducta 15,16,31 . Debido a la avanzada del conocimiento de la relevancia ecológica de aprendizaje olfativo para las abejas de miel, que comenzó con los primeros estudios realizados por Karl von Frisch hace más de 100 años <sup&gt; 31, los resultados de PER puede ser fácilmente vinculado a las necesidades de supervivencia de una colonia. Más recientemente, se ha adaptado a un estudio agrícola para investigar los efectos de comportamiento subletales de pesticidas y toxinas del medio ambiente 17. El procedimiento básico es de gran alcance en el que se puede aplicar a investigar los problemas en otras especies también. Dos especies de polillas, Manduca sexta y Spodoptera littoralis, se han utilizado en estudios de POR para investigar la base neural de la identificación del olor y las capacidades de aprendizaje olfativo de cada especie 32,33. POR experimentos con moscas de la fruta han proporcionado muchos conocimientos sobre las cascadas de señalización moleculares implicados en chemosensation y el aprendizaje 34. Y POR recientemente se ha utilizado para estudiar la habituación en la pulga (Rhodnius prolixus) 35, un vector de la enfermedad importante. En general, el procedimiento es robusto a cambios en el método; el uso de dmétodos ifferent probablemente producirán la misma diferencia relativa entre los grupos de tratamiento. A pesar del procedimiento relativamente simple, varios problemas a veces puede evitar que las abejas de miel de aprendizaje de la asociación de olores sacarosa. Los temas siguientes son las posibles adaptaciones del protocolo y algunos de los problemas más comunes que pueden surgir durante PER acondicionado. Consideraciones sobre el número y tipo de ensayos en el Protocolo acondicionado Cualquier protocolo de aprendizaje requerirá la exposición de las abejas a una serie de ensayos en la fase de adquisición. Este número depende en gran medida de la dificultad de la tarea. Las abejas pueden aprender una tarea sencilla después de un único ensayo, pero necesitan al menos unos tres ensayos para inducir la formación de la memoria a largo plazo. Como era de esperar, las abejas de la miel requerirán significativamente más ensayos para aprender adecuadamente una tarea difícil. Generalmente, hay un número máximo de ensayos más allá del cual las abejas ya no mejoran significativamente larendimiento IR. Este máximo depende de la tarea específica, los tipos de olores y concentraciones, y la concentración de sacarosa. Cuando se utiliza más de un tipo de ensayo con diferentes olores, presentar los diferentes tipos de ensayos en una secuencia pseudoaleatoria para mantener las abejas a partir de la memorización de una simple secuencia de presentaciones de olores en lugar de aprender las diferencias entre los olores 36. En estas secuencias pseudoaleatorias, debe haber un número igual de los ensayos para cada uno de los tipos de olores. Además, la probabilidad de un ensayo de un tipo de olor está precedida por y seguido por el mismo olor, o cualquiera de los otros olores, debe ser igual para todos los olores. Durante dos olores - A y B - utilizar la siguiente secuencia: ABBABAAB. Más de ocho ensayos cada olor se presenta cuatro veces. Concatenar secuencias idénticas para alcanzar el número deseado de ensayos para cada olor. Independientemente del diseño experimental, hay algunos parámetros que deben permanecerconstante con el fin de optimizar el aprendizaje. La coincidencia entre el CS y los EE.UU. es fundamental para el acondicionamiento eficaz. El intervalo entre ensayos (Figura 1, Tabla 1) tiene que ser constante y estar optimizado debido a irregularidades o el intervalo entre ensayos demasiado corto o demasiado largo, pueden influir significativamente en la eficacia del protocolo acondicionado 1. Consideraciones sobre la importancia y el diseño de los ensayos de pruebas de comportamiento Las respuestas registradas durante la &#39;fase de adquisición&#39; de un experimento, cuando el EC y el EI se presentan juntos, pueden ser útiles. Sin embargo, ten en cuenta que las condiciones de presentación de olores pueden variar de un tipo de ensayo a otro. Durante los ensayos reforzados, el olor seguido de sacarosa se presenta en relación con un estímulo visual (movimiento del dispositivo para la entrega de la gotita de sacarosa) que puede afectar a la respuesta de la abeja. Y las abejas tienen sólo tres segundoss para mostrar una respuesta (cuatro segundos de estimulación olor menos el solapamiento con uno sec presentación sacarosa; Figura 1). Si el experimento implica las abejas de aprendizaje para diferenciar dos olores (por ejemplo, reforzado y no reforzado), el olor no reforzado presentado en ensayos alternativos se produce sin el estímulo visual de la presentación recompensa y las abejas tienen los total de cuatro segundos para responder. Por lo tanto, las respuestas a los dos olores no son totalmente comparables durante la adquisición. Con cualquier protocolo acondicionado, no se basan exclusivamente en las curvas de adquisición 1. Para conocer mejor lo que las abejas han aprendido, introducir una serie de ensayos de prueba sin refuerzo, durante el cual se refuerza ni olor, lo que asegura que las pruebas de todos los estímulos tiene lugar bajo condiciones idénticas. Dependiendo de la finalidad específica del experimento, la prueba puede consistir en ensayos de prueba individuales del olor acondicionado o una serie de ensayos con el OD acondicionadoo o una combinación de los olores acondicionado y novedosos. Un único ensayo de prueba del olor acondicionado ofrece un sencillo ensayo de si las abejas recuerdan el olor acondicionado. Sin embargo, la respuesta a la primera prueba de ensayo puede reflejar el nivel de motivación de las abejas, así como su recuerdo del olor acondicionado. Una serie de ensayos de prueba, ya sea de una serie de ensayos de extinción del olor acondicionado o una serie de pruebas individuales de lo condicionado y uno o más nuevos olores, también se puede utilizar para evaluar la memoria. La serie de ensayos de extinción puede evaluar la fuerza con las abejas recuerdan la asociación acondicionado. Cuanto más fuerte es el retiro del mercado del mayor número de ensayos necesarios para extinguir la respuesta condicionada. Una serie de pruebas individuales de olores condicionados y novedosas también puede evaluar la especificidad de memoria del olor acondicionado de las abejas. También es imprescindible para acondicionar y poner a prueba tanto el control y los grupos tratados en los mismos momentos. Comparción del rendimiento de las abejas pronto después del acondicionamiento a las abejas mantenidas por períodos de tiempo más largos es problemático debido a la exposición a los EE.UU. sacarosa al alimentar a las abejas hasta la saciedad. Por ejemplo, una disminución en el rendimiento después de largos intervalos podría ser debido a la desintegración de memoria o podría ser debido a cambios en el estado de motivación y / o de aprendizaje inducidos por la exposición no reforzada a los EE.UU., haciendo que los resultados ambiguos. Por lo tanto, el rendimiento de un grupo de tratamiento siempre debe ser juzgada en relación con un grupo de control acondicionado y probado en los mismos puntos de tiempo. Concentración de olor e Integridad Hay varias formas en las que la concentración y la integridad del olor (CS) puede ser comprometida. El problema más frecuente con la entrega de olor es el agotamiento de los cartuchos de olor por el uso excesivo (Figura 2). Vuelva a colocar los cartuchos de 10-12 usos (cada 2 o 3 ensayos con grupos de 5 abejas) para evitar este escollo. También es importante utilizarcartuchos frescos para ensayos de prueba, ya que los cartuchos usados ​​pueden ser agotados diferencialmente y por lo tanto presentan desiguales estímulos de olor. Otro problema común es la contaminación cartucho de olor debido al uso del cartucho para más de un olor sin limpiar completamente. Un flujo de aire sucio o contaminado puede también introducir involuntariamente estímulo olfativo adicional (filtros de carbón activo pueden prevenir la contaminación de fondo). Esto es especialmente problemático cuando el acoplamiento de acuerdo acondicionado con las mediciones de las respuestas fisiológicas al olor. Cartuchos de olor con fugas presentan un problema puesto que las abejas melíferas están expuestos al olor antes de que comience el ensayo, lo que reduce la saliencia del estímulo de olor. Suelta en el suministro de aire para la entrega olor puede resultar en poca o ninguna entrega olor cuando se abre la válvula, reduciendo artificialmente la respuesta de las abejas al olor previsto. Solución de sucrosa y estímulo incondicionado (recompensa) El unmontaje, la concentración, y la integridad de la solución de sacarosa utilizado como los EE.UU. son vitales para el éxito del experimento. Acondicionado es una función de la cantidad y concentración de la solución de sacarosa-agua usado como los EE.UU. 37. Las jeringas micrómetro utilizados en el método 2 permite un control muy preciso (hasta 0,2 l) de la prestación de los Estados Unidos, y recomendamos su uso para ambos métodos. El uso de los palillos de dientes (Método 1) es adecuada para las circunstancias en las que las jeringas caros no se pueden utilizar, como, en la formación de grandes grupos de estudiantes, el trabajo en el campo, o con presupuestos más bajos. Aplicación cuidadosa del método 1 es bien siempre y cuando el tiempo se mantiene con el reemplazo regular de palillos de dientes para evitar la acumulación de sacarosa (y la concentración administrada). Sin embargo, usando palillos de dientes es más difícil de controlar con precisión y calcular la cantidad y la magnitud de los EE.UU. entregado, que es importante para los estudios de acondicionamiento 1. La concentración de sacarosa necesaria paraproporcionar una recompensa suficiente para mantener a las abejas motivados para aprender la asociación acondicionado puede depender de la dificultad de la tarea y el estado interno de las abejas o época del año. Las tareas más difíciles requieren una solución de sacarosa más alto para las abejas para aprender con éxito la tarea. El moho puede acumular en soluciones de sacarosa incluso a 5 ° C, lo que pondrá en peligro la integridad de la solución, lo que afecta la salud y la percepción de la recompensa de las abejas durante el experimento. Es mejor reemplazar la solución cada pocos días. Precisión, oportunidad y consistencia de EC y Entrega El problema más crítico sobre la correcta aplicación de un procedimiento de PER, o para el caso cualquier procedimiento de acondicionamiento, implica precisión, oportunidad y coherencia de CS y la entrega de Estados Unidos (Figura 1). Los investigadores que son nuevos en el procedimiento con frecuencia son imprecisos acerca de la entrega de uno o ambos estímulos. ISIque no permitan que la superposición de la EC y resultar en un rendimiento acondicionado. El PLC automatiza una señal audible para el experimentador para entregar sacarosa 3 segundos después del inicio de la entrega olor. Los investigadores deben mantener la sacarosa / gota de agua cerca de la abeja para la entrega rápida después de la señal. Estos procedimientos ayudan a arrastrar un ISI consistente. La colocación de un cronómetro por la arena acondicionado permite una conveniente ubicación momento del juicio, así como el seguimiento de tiempo de las abejas en la arena antes y después de la entrega de estímulos. De esa manera los de ITI puede ser relativamente constante y todo el procedimiento se puede correr a un ritmo controlado. De ITI que son demasiado cortos, por ejemplo menos de 1 min, o por mucho tiempo puede conducir a malos resultados acondicionado 1. Efectos estacionales, ambientales y contextuales en la miel de abeja Performance Rendimiento de miel de abeja puede ser influenciado significativamente por su entornotanto antes como durante el acondicionamiento. Con frecuencia, las fluctuaciones en la temperatura y la disponibilidad de alimentos que vienen con el cambio de estaciones alterarán la motivación de las abejas para aprender. Cuando las flores están en flor, la motivación de las abejas para aprender la asociación en el laboratorio acondicionado disminuye 38. Cuando se insistió en la colonia - de las temperaturas extremas, escasez de alimentos, o el estrés relacionado con la enfermedad - de las abejas mostrarán una reducción de su capacidad de aprendizaje en el interior. Las abejas de miel mantienen en un cuarto vuelo puede aprender bien por un tiempo, pero allí también el estrés de la enfermedad y el envejecimiento degradan su rendimiento de aprendizaje a través del tiempo. El contexto durante el acondicionamiento también puede disminuir el rendimiento de las abejas. Cualquier olores extraños, el movimiento, y otros estímulos pueden distraer la abeja de los estímulos experimentales. Para evitar este problema, mantener un contexto visual razonablemente coherente, simplificado. Genotipo y Experiencia Afecta POR Performance &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; trabajadores de abejas pueden diferir considerablemente en el rendimiento en cualquier procedimiento de acondicionamiento debido a la especialización de tareas, genotipo, u otros factores ambientales 20. Por lo tanto, es importante para estandarizar, tanto como sea posible, los tipos de animales utilizados en un experimento con el fin de reducir la variación inter-individual. En una colonia dirigida por una reina-acoplado abierto, lo que significa que se aparearon con muchos zánganos diferentes, los trabajadores serán diferentes en el genotipo paterno. Antecedentes genéticos puede dar lugar a grandes diferencias en la capacidad de respuesta sensorial 39 y los resultados del aprendizaje 29. Con colonias encabezadas por reinas inseminadas instrumentalmente por el esperma de los zánganos individuales 28 reduce esta variación interindividual. Los protocolos descritos anteriormente, incluye un método para recopilar los trabajadores de abejas de la entrada del nido. Sin embargo, estas abejas difieren entre sí en lo que respecta a la edad o la tarea de comportamiento. Pueden ser jóvenes (inexperienced) o mayores () recolectores más experimentados. Pueden ser jóvenes abejas que hacen sus primeros vuelos de orientación. O pueden ser abejas guardianas. Para reducir la variabilidad, marque las abejas con una pintura de esmalte de secado rápido o etiquetas de marcado, ya sea como emergen como adultos (para controlar para la edad) y / o cuando empiezan forrajeo (para el control de la experiencia). Luego, unos días después, recoger las abejas marcadas para el acondicionamiento. Los trabajadores que se dedican a la conducta de enfermería se pueden recoger de los marcos dentro de la colmena. Las enfermeras pueden ser identificados positivamente cuando se meten con sus cabezas en una celda de cría para alimentar y cuidar a la larva en el interior. Usando Virgen Queens o Drones para PER acondicionado Además de las abejas obreras, reinas y zánganos de abejas vírgenes se pueden acondicionar fácilmente en un procedimiento PER a estudios destinados a desarrollar las líneas genéticas de abejas de la miel que se diferencian en los resultados del aprendizaje 28. Reinas vírgenes deben recogerse poco después ªey emergen de la fase de pupa y se coloca directamente en los arneses de sujeción y sin anestesia. Drones jóvenes, inmaduros obtenidos de los panales de cría dentro de la colonia en general, no están motivados para aprender. Después de que hayan comenzado el apareamiento vuelos, drones aprenden fácilmente POR tareas 28. Deben ser recogidos, ya que volver a partir de un vuelo de apareamiento y se mantienen durante la noche en una pequeña jaula en una colonia utilizadas para la cría reinas. No intente aprovechar el día anterior acondicionado; no sobreviven bien en arneses durante la noche. Un par de horas antes del acondicionamiento de los aviones no tripulados pueden ser recogidos de las jaulas y se colocan en los arneses de sujeción y sin anestesia. Conclusiones Este procedimiento PER, en el camino de métodos, asciende a un punto de partida para el diseño de experimentos POR. La mayoría de los protocolos POR requerirán que el procedimiento esbozado ser cambiado de alguna manera de poner en práctica los objetivos específicos del experimento y accommodate los grupos de tratamiento múltiples. Es fácil de implementar. Sin embargo, la aplicación adecuada requiere la atención al detalle y la práctica. Una vez dominado, puede ser un procedimiento de gran alcance para agregar una herramienta de investigación para varios programas de investigación básica y aplicada con diferentes especies de insectos.

Muchos insectos aprenden sobre estímulos ecológicamente pertinentes, y luego cambiar sus respuestas de comportamiento a los estímulos con el fin de adaptarse a las nuevas relaciones predictivas en su entorno. Varios mecanismos diferentes pueden ser la base de esta plasticidad de comportamiento (por ejemplo, no asociativo, asociativo / pavloviano y operante / instrumentales 1). Este tipo de plasticidad difieren en cómo los estímulos o comportamientos están asociados con eventos importantes, tales como la aparición de la comida, un compañero, o peligro. La comprensión de estas formas de plasticidad es muy importante para la investigación básica sobre cómo el sistema nervioso cambia de codificar nuevos recuerdos 2. También es importante para la comprensión de los comportamientos de adaptación de los insectos que son importantes vectores de la enfermedad (por ejemplo, la mosca tsetsé y los mosquitos) e insectos que son importante para la agricultura, ya sea en la producción de cultivos (abejas) o como plagas. El estudio de la plasticidad de comportamiento en cualquier animal requiere un nivel de control experimental sobre un número de variables que no se puede lograr en el campo 1. Se requiere el desarrollo de un protocolo robusto acondicionado que pueden ser empleados en condiciones más controladas, pero que aún son relevantes para el comportamiento en condiciones naturales. La abeja de la miel (Apis mellifera) es un excelente modelo de cómo desarrollar un protocolo para la realización de análisis controlados de 3,4 plasticidad conductual. La respuesta de Extensión probóscide (PER) en las abejas de miel es un reflejo del comportamiento natural en el que la abeja de la miel se extiende su probóscide en respuesta a la estimulación de las antenas con una solución de azúcar. Durante comportamiento de alimentación normal, PER se produce cuando la abeja de la miel se encuentra el néctar en una flor. Afortunadamente, las abejas exhibirán fácilmente este comportamiento simple y fácilmente cuantificable en el laboratorio. Esto hace que sea posible estudiar, en un entorno controlado, los mecanismos que influyen en este comportamiento ecológicamente relevante 5. POR can también ser utilizado dentro de un protocolo acondicionado para investigar la percepción del estímulo y el aprendizaje y la memoria bajo diferentes condiciones de tratamiento, que están diseñados para revelar los mecanismos de comportamiento y neuronales que subyacen a la plasticidad 6. Desde los primeros estudios realizados por Kuwabara 7, PER acondicionado ha sido ampliamente utilizado para revelar no asociativo, asociativo y mecanismos operantes que subyacen a la plasticidad de comportamiento en las abejas melíferas 8. Estos mecanismos son idénticos a los revelados en los estudios de abejas de la miel que vuelan libremente 9. A diferencia de los estudios de las abejas que vuelan libremente, protocolos de acondicionamiento POR pueden acoplarse con la electrofisiología 10,11 o de células vivas imágenes de fluorescencia 12-14 del cerebro. Además, los protocolos POR permiten la manipulación experimental de las vías nerviosas a través de tratamientos farmacológicos o genéticos moleculares para probar hipótesis acerca de los roles de los componentes específicos de la red, tales como neuromodulators 15,16. Protocolos PER también han proporcionado una forma importante para evaluar los efectos subletales de las condiciones ambientales, así como las toxinas en la salud y la eficiencia de forrajeo de las abejas 17. Este procedimiento describe dos métodos de entrega olor en paralelo. Método 1 es una versión del olor y estímulo no condicionado (sacarosa) de entrega que proporciona un método económico y técnicamente sencillo para presentar el olor y sacarosa recompensa. Este método es bueno para la formación básica y cuando la automatización no es posible. Es una excelente manera de introducir esta técnica a un laboratorio de clase o la enseñanza. Durante acondicionado para experimentos que implican tareas más difíciles y evaluaciones fisiológicas acopladas de la percepción del olor, el aprendizaje o la memoria, es muy importante para regular con exactitud y precisión el inicio, el tiempo de entrega duración de los estímulos. Para la entrega de estímulos más confiable, utilizar un medio de la automatización de la entrega de un olorencontrar un método preciso de entrega recompensa. Método 2 emplea automatizado de entrega olor y entrega sacarosa más precisa. Es técnicamente más sofisticado y requiere más para la configuración inicial del método 1, pero aumenta significativamente la coherencia del calendario y la cantidad de estímulos utilizados para el acondicionamiento y debe utilizarse siempre que sea posible.

<table><tbody><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Compuestos odoríferos (por ejemplo)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;1-hexanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471402-100ML</td><td>Para más ejemplos</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;2-octanona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W280208-800G-K</td><td>de odorantes, véase cualquiera de</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;heptanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51778-5ML</td><td>los artículos sobre olfato</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;geraniol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163333-25G</td><td>procesamiento desde el</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;nonanal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131210-100ML</td><td>Laboratorio Smith</td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral pesado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>Asegúrese de que&amp;rsquo;sin olor.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190535-1PAK</td><td>Utilice una broca pequeña para perforar un orificio pequeño en la tapa de los viales.</td></tr><tr><td>Arnés para abejas</td><td></td><td></td><td>Fabricado a medida a partir de pajillas de plástico para refrescos de 0,9 cm de diámetro o tubos de plástico rígido/metal.</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de lavado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560847-3EA</td><td>Para el etanol al 70 %.</td></tr><tr><td>Tubo secador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;SÓLO PARA EL MÉTODO 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>jeringas plásticas desechables de 20 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-07945-18</td><td></td></tr><tr><td>círculos de papel de filtro de 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274844-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Chinchetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palillos de dientes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;SÓLO PARA EL MÉTODO 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Jeringa micrométrica Gilmont, 0,2 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07840-00</td><td></td></tr><tr><td>Punta de jeringa micrométrica Gilmont</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07841-00</td><td></td></tr><tr><td>26 G 3/8&amp;rdquo; Agujas hipodérmicas Leur hub</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-10</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de tuberculina de 1 cc (plástico/vidrio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z181641-1EA o Z192090-200EA</td><td>Existen jeringas de tuberculina de vidrio, pero las jeringas de plástico son mucho menos costosas y funcionarán bien para un número limitado de usos.</td></tr><tr><td>Pequeños restrictores de goma/silicona</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-02</td><td>Hecho de tubo de silicona con un diámetro exterior de 4,8 mm o de las puntas de goma de los émbolos de jeringas de 1 cc.</td></tr><tr><td colspan="4">[cabecera]</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>papel de filtro de 75 x 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695106-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Controlador Lógico Programable Direct Logic 05</td><td><a href="http://www.koyoele.co.jp/english/product/plc/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Koyo Electronics Industries Co, Ltd</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm, 4 mm, &amp;amp; Tubo de PVC o silicona de 6 mm de diámetro interno</td><td>Cole-Parmer</td><td>Varios</td><td>Cole-Parmer dispone de una amplia selección de tubos adecuados.</td></tr><tr><td>Conectores de polipropileno &amp;amp; sus conexiones</td><td>Cole-Parmer</td><td>Varios</td><td>Cole-Parmer ofrece una amplia selección de conectores y accesorios para muchos tamaños de tubos.</td></tr><tr><td>Flujoímetro correlacionado de 65 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03216-08</td><td>Aluminio con flotador de vidrio; para líquidos y gases, con válvula.</td></tr><tr><td colspan="4">O</td></tr><tr><td>Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Bomba de aire para acuario</td><td><a href="http://www.aquacave.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquacave</a></td><td>AE-TETRA-300</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas solenoide serie LIF para tubos de 0,042" de diámetro interno, configuración "E"</td><td><a href="http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> The Lee Company</a></td><td>LFAA1200118H</td><td>Neopreno, acero inoxidable 430, acero inoxidable 302, 280 mW</td></tr><tr><td>Zumbador piezoeléctrico de 12 VCC, 70 dB, para placa de circuito</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> RadioShack</a></td><td>273-074</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo de respuesta de probóscide extensión para la investigación de la plasticidad de comportamiento en insectos: aplicación a basic, biomédica y de investigación agrícola

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insectos modifican sus respuestas a los estímulos a través de la experiencia de la asociación de esos estímulos con los acontecimientos importantes para la supervivencia (por ejemplo, alimentos, compañeros, amenazas). Hay varios mecanismos de comportamiento a través del cual un insecto aprende asociaciones sobresalientes y los relaciona con estos eventos. Es importante entender esta plasticidad conductual para los programas encaminados hacia la asistencia a los insectos que son beneficiosos para la agricultura. Esta comprensión también se puede utilizar para descubrir soluciones a los problemas biomédicos y agrícolas creadas por los insectos que actúan como vectores de enfermedades y plagas. La respuesta de Extensión probóscide (PER) protocolo acondicionado fue desarrollado para las abejas de miel (Apis mellifera) hace más de 50 años para estudiar cómo perciben y aprender acerca de los olores florales, que señalan los recursos de néctar y polen a las necesidades de colonias para la supervivencia. El procedimiento PER proporciona un marco sólido y fácil de emplear para el estudio de varios diferentes mecha ecológicamente relevantenismos de la plasticidad de comportamiento. Es fácilmente adaptable para su uso con varias otras especies de insectos y otros reflejos de comportamiento. Estos protocolos pueden ser fácilmente empleados en conjunto con diversos medios para el seguimiento de la actividad neuronal en el SNC a través de electrofisiología o bioimagen, o para la manipulación de las vías de neuromoduladores específicos. Es un sólido ensayo para detectar rápidamente efectos subletales sobre el comportamiento causado por factores de estrés ambientales, toxinas o pesticidas. Mostramos cómo el protocolo PER es sencillo de implementar el uso de dos procedimientos. Uno de ellos es adecuado como un ejercicio de laboratorio para estudiantes o para ensayos rápidos del efecto de un tratamiento experimental. El otro proporciona más control exhaustivo de variables, que es importante para los estudios de condicionamiento conductual. Se muestra cómo varias medidas para la respuesta de comportamiento que van desde binarios sí / no a más variable continua como la latencia y duración de la trompa de extensión se puede utilizar para probar hypotheses. Y, discutimos algunas trampas que los investigadores suelen encontrar cuando utilizan el procedimiento por primera vez.

Se presentan dos ejemplos de uso de los protocolos POR descritos anteriormente. El primer ejemplo de uso que se haga Método 2 para estudiar cómo las abejas perciben diferentes olores como una función de la similitud molecular al olor utilizado como el CS 5,24,25. El segundo es un ejemplo del uso del método 1 y algunas de las precauciones que deben tomarse al comenzar a utilizar PER experimentos de condicionamiento en el laboratorio de investigación. Estudios como éste se han utilizado para describir el &quot;espacio perceptual &#39;olfativo de las abejas y polillas en conjunto con Bioimagen 13 o electrofisiológico análisis 26. Las abejas de miel (n = 20) fueron condicionados para asociar el odorante decanal con refuerzo de sacarosa en 12 hacia adelante emparejamiento ensayos de condicionamiento (Figura 3A). Aproximadamente el 10% de las abejas de la miel respondió &quot;espontáneamente&quot; en el primer juicio, que es normal. Después de que el porcentaje que Responded aumentará en los próximos ensayos hasta el 100% de las abejas de la miel respondió en el quinto ensayo y cada juicio posterior. Varios estudios han demostrado que este aumento de la respuesta es específica a la condición de emparejamiento hacia adelante (Figura 1) con relación a varios procedimientos de control importantes 3. Después de la fase de adquisición, cada abeja de la miel fue sometido a una serie de ensayos de prueba no reforzadas (Figura 3B), que implicó la exposición al olor CS y para varias otras sustancias olorosas que sistemáticamente diferían de la CS en las estructuras moleculares. Las abejas de miel respondieron más fuertemente a la CS. Sus respuestas a los otros olores disminuyeron en función de los cambios sistemáticos en la estructura, con las respuestas más bajas a los odorantes menos igual que el CS. En la Figura 4, los resultados de un reciente taller en el que los estudiantes aprendieron, por primera vez, cómo condicionan las abejas que utilizan el método 1 se ilustran. Estudiantes abetos<html> t condicionada abejas por methycyclohexanone adelante emparejamiento (MCH) o octanol (OCT) con refuerzo de sacarosa (Figura 4A). Porcentaje respuestas fueron más bajos en el primer juicio y se incrementaron en ensayos posteriores, lo que indica que las abejas aprendieron la asociación de olores sacarosa. Hubo diferencias en el grado en que las abejas aprendieron la asociación entre los diferentes grupos de estudiantes condicionado. En nuestra experiencia, este tipo de diferencias podrían deberse a que el olor que se usó como el CS, a los elementos imprecisos en el método (Método 1), o con el nivel de formación de los experimentadores. En el tercer caso, el rendimiento se vuelve rápidamente más consistente con el aumento de la experiencia de los experimentadores. Después del acondicionamiento, cada abeja de la miel se probó dos veces con cada olor. En grupos de abejas que se había acondicionado con maridaje delantero de octubre o MCH, la respuesta fue, como se esperaba, más fuerte que el olor acondicionado (Figura 4B). <html> ent &quot;&gt; El segundo grupo de abejas de la miel que experimentaron adelante emparejamiento de octubre se acondicionó en paralelo a otro grupo en el que el olor octubre fue hacia atrás emparejado con sacarosa. maridaje con versiones anteriores es uno de los varios tipos de procedimientos de control para demostrar que el aumento de la respuesta es específico para reenviar el emparejamiento y no se debe a otro proceso, como la excitación no específica de sensibilización. Para emparejar hacia atrás, los EE.UU. sacarosa y olor CS se presentan en orden inverso a lo que se muestra en la Figura 1. Adquisición de datos de emparejamiento hacia atrás somos no se muestra porque la CR no se puede marcar da la presentación del olor CS después de la presentación de la sacarosa. como se predijo para el acondicionamiento asociativo, los niveles de respuesta a octubre fueron mayores en el grupo hacia adelante emparejado con respecto al grupo hacia atrás (Figura 4C). 7fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 1. Diagramas de diseño experimental para el acondicionamiento utilizando adelante emparejamiento. Véase la Tabla 1 para las definiciones de los términos utilizados en esta figura. (A) El CS (olor) precede y se superpone con los EE.UU. (solución / agua sacarosa). La relación entre el CS y los Estados Unidos se muestra es óptima para las abejas de miel acondicionado y polillas. Pero la óptima ISI puede depender del protocolo de condicionamiento y de los animales de especies 1. (B) Desglose y tiempo relativo de CS, CR, Estados Unidos, y UR. El CR que se produce, ya sea antes de la presentación de Estados Unidos o durante los ensayos no reforzados &#39;prueba&#39; es la medida depende de los protocolos experimentales. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. agotamiento de Olor con reutilización de cartuchos. Para estos datos, los cartuchos de olor eranset-up con hexanol como se describe en el texto. Hexanol se usa comúnmente como un CS en estudios PER; sin embargo, la tasa real de agotamiento dependerá del olor y disolvente. Cartuchos fueron utilizadas una vez durante 4 segundos cada minuto más de 8 ensayos (suponiendo 5 abejas / ensayo en un experimento estándar que sería igual a 40 usos). Las diluciones en el disolvente indicado, que eran relativamente estándar para PER experimentos, fueron de 2,0 M (A) y 0,2 M (B). (A, B) El olor se tomaron muestras después de la primera y la octava ensayos de adsorción sobre una fase sólida microextracción (SPME) de la fibra, que luego se desorbe en un cromatógrafo de gases. Las áreas relativas bajo los picos fueron más altos después de la primera prueba relativa a la octava para ambos disolventes y para ambas concentraciones (pares de Wilcoxon firmado prueba de rango p &lt;0,05 [*] o superior), lo que demuestra que menos olor fue entregado desde el cartucho después de que el cartucho se ha utilizado en varias ocasiones. (C, D) Los mismos datos muestran sólo la octava tr<html> Ial con el eje y ampliado. Se muestra que el agotamiento fue ligeramente mayor en relación con hexano para aceite mineral, sino sólo a la concentración más baja. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Adquisición y prueba utilizando decanal como el CS y el método 2 al condicionamiento. (A) de prueba por prueba de respuesta (CR) de más de 12 ensayos de apareamiento hacia adelante (Figura 1). Los datos proceden de las abejas n = 20 miel acondicionado en cuatro grupos de 5 abejas cada una. El ISI fue de 3 segundos y el ITI era 6 min. (B) utilizando pruebas no reforzadas olores que difieren de decanal por la longitud y / o la posición del carbono del carbonilo de la cadena de carbono. Los olores se presentaron en una serie aleatorio a través de los cuatro grupos y se intercalan con los ensayos reforzados con decanal (cada dos o tres ensayos) con el fin de evitar la extinción de la CR. e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Los datos de un taller en el que se gradúan los estudiantes fueron entrenados para condicionar las abejas utilizando PER método 1. datos (A) Adquisición de tres grupos de abejas condicionadas a octanol (n = 23 y 15 para Gps 1 y 2, respectivamente) y metilciclohexanona (n = 10) (B) durante las pruebas de CRs no reforzadas con ambos olores.; cuatro ensayos presentados en la serie al azar entre los grupos. (C) las pruebas no reforzadas con dos olores en dos grupos de abejas de la miel, uno hacia adelante emparejado (Gp 1, n = 23) y uno hacia atrás emparejados (n = 25). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Término (abreviatura) </td><td> Definición </td><td> Ejemplo relevante </td></tr><tr><td> Estímulo condicionado (CS) </td><td> Aestímulo que provoca poca o ninguna respuesta al primero y las señales de los Estados Unidos </td><td> OLOR </td></tr><tr><td> Respuesta condicionada (RC) un </td><td> La respuesta a la CS después de la asociación con los EE.UU. </td><td> PROBÓSCIDE EXTENSION </td></tr><tr><td> Estímulo incondicionado (EI) </td><td> Un estímulo biológicamente significativo que provoca una respuesta </td><td> SACAROSA / SOLUCIÓN DE AGUA </td></tr><tr><td> Respuesta incondicionada (RI) un </td><td> La respuesta a los EE.UU. </td><td> PROBÓSCIDE EXTENSION </td></tr><tr><td> Inter-estímulo Intervalo (ISI) </td><td> El tiempo entre el inicio de la CS y la aparición de los EE.UU. </td><td> OLOR al intervalo SACAROSA </td></tr><tr><td> Inter-Trial Intervalo (ITI) </td><td> El tiempo entre los sucesivos emparejamientos CS-Estados Unidos para un solo animal </td><td> OLOR (ensayo n) a OLOR (ensayo n + 1) intervalo </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Importante Terminología. Consulte la Figura 1 para una ilustración de estos términos. un PER acondicionado Para el CR y UR son los mismos, aunque para otros tipos de asociaciones y reflejos del CR y UR pueden ser diferentes. <a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Película 1.</a> Un video de una abeja realizar PER después de que había sido condicionado para responder a un olor. Tenga en cuenta la respuesta de PER de la abeja alrededor de 1,5 seg después de la aparición de olores. Software de seguimiento de mapeado los movimientos de las antenas en respuesta a la presentación del olor. Las líneas trazadas en la esquina superior derecha del vídeo muestran los movimientos de las antenas reales. Los dos gráficos en la parte inferior de la pantalla muestran los movimientos de las antenas en la X (izquierda) e Y (derecha) coordina. Las líneas verticales en el gráfico que se muestra en el video indican, de izquierda a derecha, la luz ON, PER, luz apagada y probóscide retracción.

El protocolo de acondicionamiento de la Respuesta de Extensión de la Probóscide (PER), desarrollado para la abeja melífera (Apis mellifera), proporciona un medio ecológicamente relevante y fácilmente cuantificable para estudiar varios mecanismos diferentes de aprendizaje en muchas especies de insectos.

Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo implementar el condicionamiento conductual de una respuesta refleja simple ante los alimentos en abejas melíferas. Esto se logra primero capturando abejas melíferas, restringiéndolas en arneses, alimentándolas con una pequeña cantidad de solución azucarada y luego permitiendo que se acostumbren a la restricción. A continuación, se seleccionan abejas para el condicionamiento que muestren suficiente motivación cuando sus antenas son tocadas con sacarosa.Durante el condicionamiento, la presentación del olor se asocia con una recompensa de sacarosa para provocar la respuesta condicionada. A continuación, ensayos sin refuerzo miden la presencia o ausencia de la respuesta, la latencia de la respuesta y la duración de la respuesta. El paso final consiste en el análisis de datos y la presentación gráfica de los ensayos de condicionamiento y prueba.Esta técnica se ha aplicado con éxito a estudios sobre la biología y la salud de las abejas melíferas; su comportamiento de aprendizaje es particularmente sensible a tratamientos disruptivos como los pesticidas, lo que permite evaluar el impacto de este tipo de tratamientos sobre el comportamiento de las abejas melíferas a niveles subletales. La demostración visual de este método facilita la comprensión de la temporización del estímulo necesaria para una condicionamiento eficaz, así como de los errores comunes que reducen su efectividad. Una persona nueva en este método tendrá dificultades con la atención al detalle requerida tanto por el protocolo como por las condiciones ambientales que lo rodean.Para comenzar, recolecte abejas obreras de la entrada de la colonia cuando hagan una pausa antes de salir o al regresar de forrajear. Capture solo una abeja por vial. Sostenga la abertura del vial en posición horizontal o hacia abajo mientras coloca la tapa para evitar que escape.Una vez recolectadas las abejas, regrese al laboratorio y coloque varios de los frascos a la vez en una mezcla de hielo y agua. Cuando una abeja esté inmóvil, retire inmediatamente el frasco del hielo para evitar una exposición excesiva y coloque la abeja en un arnés de sujeción. Sujete la abeja con el tórax dorsal enfrentando la sección recortada del soporte y la cabeza justo por encima de la parte superior.Presione suavemente la abeja para que sus partes bucales sobresalgan del borde del soporte. Deslice una tira de cinta adhesiva entre la cabeza y el tórax por el lado dorsal y fije firmemente el extremo libre al costado del soporte. Asegúrese de que la cinta en el arnés quede lisa y tensa.No debe haber espacios visibles entre la parte frontal del soporte para abejas y la cinta. Si hay espacios, es posible que la abeja no pueda extender adecuadamente su per bovis o que pueda escapar. Deje que las abejas se recuperen aproximadamente 30 minutos de la sujeción antes de alimentarlas.Luego, en un área alejada del área de entrenamiento, administre a cada abeja de tres a cuatro microlitros de sacarosa 0,5 molar durante el intervalo entre la alimentación y el condicionamiento. Coloque las abejas en un área tranquila del laboratorio y dentro de un recipiente de plástico con toallas de papel húmedas. Durante este tiempo, unos minutos antes de comenzar el condicionamiento, evalúe la motivación de la abeja para alimentarse tocando sus antenas con una pequeña gota de solución de sacarosa 0,5 molar.No los deje alimentarse durante esta prueba. Si responden extendiendo sus psis, probablemente estén suficientemente motivados para aprender y pueden utilizarse en el protocolo. Cuando esté listo, coloque la jeringa de vidrio para olores en un soporte de arcilla modelable y ajústela de modo que la abertura en el extremo ancho apunte directamente hacia las abejas y a 10 E. El extremo de la jeringa debe estar a uno o dos centímetros de la abeja, colocando firmemente el adaptador que conecta el cartucho al sistema de tubos y válvulas de flujo de aire en el extremo estrecho de la jeringa.Al comienzo de cada ensayo, coloque la abeja sujeta en el soporte del área de condicionamiento con sus antenas orientadas directamente hacia el cartucho de olor. Permita que la abeja descanse en el área durante 15 a 25 segundos antes de iniciar el estímulo olfativo, para que se acostumbre a su nuevo entorno. Presione el botón de inicio para activar el mecanismo de temporización para la entrega del olor.Observe la respuesta de la abeja al olor después del inicio del estímulo y antes de la presentación del estímulo incondicionado. Tras cada ensayo, permita que la abeja descanse en el área de condicionamiento durante otros 15 a 25 segundos para permitir la formación inicial de la memoria. Mover a la abeja demasiado pronto después del ensayo reducirá significativamente la eficacia de cada ensayo de condicionamiento.Para administrar la sacarosa, mantenga la punta de la aguja a dos o tres centímetros de la abeja mientras se presenta el olor. Utilice el borde del recinto de entrenamiento para evitar sacudir la jeringa, ya que este movimiento puede distraer a la abeja. Un sonido de señal de alimentación se emitirá durante la presentación del estímulo olfativo.En cuanto suene la señal de alimentación, toque ligeramente las antenas hasta que la abeja extienda el probóscide y, a continuación, aliméntela. El momento entre la presentación del olor y la presentación de la sacarosa es fundamental. Idealmente, estos dos estímulos deben superponerse brevemente.Si transcurren más de unos pocos segundos entre la presentación del olor y la presentación de la sacarosa, el rendimiento en el condicionamiento disminuirá. Tras el condicionamiento, utilice ensayos de prueba sin refuerzo para evaluar qué tan bien las abejas recuerdan la asociación condicionada. Primero, coloque una cámara de video sobre un trípode por encima del área de entrenamiento y enfoque la cámara hacia la parte frontal de la cabeza de la abeja, de modo que las antenas y el probóscide queden nítidamente enfocados.Asegúrese de que una pequeña luz LED, que indica la presentación del estímulo olfativo, esté en un área detrás de la abeja y sea visible en el video, pero no para la abeja. Esto permite identificar el momento de inicio y finalización del olor durante el análisis. Para obtener los resultados más consistentes, utilice cartuchos de olor recién preparados para las pruebas una vez que todo esté configurado.Comience la prueba presentando el olor como se mostró anteriormente. Comience a grabar 20 segundos antes de presentar el olor y continúe grabando al menos 20 segundos después. Tras la prueba, utilice un software de edición de video para calificar la respuesta de cada abeja a la condición frente al estímulo.Utilice un sistema de puntuación binario para evaluar la respuesta de extensión del psis, calificando las respuestas como positivas o negativas. Califique la respuesta del individuo B como positiva. Cuando el psis de B se extiende más allá de la línea formada al conectar las puntas de las mandíbulas abiertas, solo califique la respuesta como positiva si B extiende su probóscide después del inicio del olor, pero antes del cese del olor. Califique la respuesta de B como negativa cuando no haya extensión de la probóscide durante el ensayo, o si la probóscide se extiende después del cese del odorante. También se pueden recopilar otros parámetros, como la latencia de la extensión, el número y la duración total de las respuestas de extensión frente a la condición.El estímulo aumentó en los ensayos de condicionamiento posteriores. Las respuestas a olores de prueba novedosos, que diferían del estímulo en la longitud de la cadena de carbono y/o en la posición del enlace carbono-carbono, se redujeron proporcionalmente al grado de diferencia entre el estímulo condicionado y el olor de prueba novedoso. Estos datos ilustran la variabilidad y el éxito del condicionamiento entre nuevos investigadores.Las respuestas al octal variaron según el grupo que realizó las pruebas. Durante los ensayos de prueba, el olor utilizado como estímulo condicionado provocó la respuesta más intensa. Cuando el octal se utilizó como estímulo condicionado, la respuesta fue más fuerte durante la prueba en comparación con la metilciclona, un olor novedoso.De manera similar, el ciclonato de metilo produjo respuestas más intensas cuando se utilizó como estímulo condicionado. Cuando se empleó un apareamiento inverso, la respuesta condicionada se redujo hasta niveles cercanos a los del olor novedoso, lo que ilustra la importancia de la temporización precisa para un condicionamiento exitoso tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las bases neuronales del aprendizaje y la memoria en organismos modelo de insectos, como la abeja melífera.No olvide que trabajar con insectos, especialmente con abejas melíferas, puede ser peligroso. Asegúrese de usar equipo de protección adecuado cuando trabaje con estos animales.

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