Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo implementar el condicionamiento conductual de una respuesta refleja simple ante los alimentos en abejas melíferas. Esto se logra primero capturando abejas melíferas, restringiéndolas en arneses, alimentándolas con una pequeña cantidad de solución azucarada y luego permitiendo que se acostumbren a la restricción. A continuación, se seleccionan abejas para el condicionamiento que muestren suficiente motivación cuando sus antenas son tocadas con sacarosa.

Durante el condicionamiento, la presentación del olor se asocia con una recompensa de sacarosa para provocar la respuesta condicionada. A continuación, ensayos sin refuerzo miden la presencia o ausencia de la respuesta, la latencia de la respuesta y la duración de la respuesta. El paso final consiste en el análisis de datos y la presentación gráfica de los ensayos de condicionamiento y prueba.

Esta técnica se ha aplicado con éxito a estudios sobre la biología y la salud de las abejas melíferas; su comportamiento de aprendizaje es particularmente sensible a tratamientos disruptivos como los pesticidas, lo que permite evaluar el impacto de este tipo de tratamientos sobre el comportamiento de las abejas melíferas a niveles subletales. La demostración visual de este método facilita la comprensión de la temporización del estímulo necesaria para una condicionamiento eficaz, así como de los errores comunes que reducen su efectividad. Una persona nueva en este método tendrá dificultades con la atención al detalle requerida tanto por el protocolo como por las condiciones ambientales que lo rodean.

Para comenzar, recolecte abejas obreras de la entrada de la colonia cuando hagan una pausa antes de salir o al regresar de forrajear. Capture solo una abeja por vial. Sostenga la abertura del vial en posición horizontal o hacia abajo mientras coloca la tapa para evitar que escape.

Una vez recolectadas las abejas, regrese al laboratorio y coloque varios de los frascos a la vez en una mezcla de hielo y agua. Cuando una abeja esté inmóvil, retire inmediatamente el frasco del hielo para evitar una exposición excesiva y coloque la abeja en un arnés de sujeción. Sujete la abeja con el tórax dorsal enfrentando la sección recortada del soporte y la cabeza justo por encima de la parte superior.

Presione suavemente la abeja para que sus partes bucales sobresalgan del borde del soporte. Deslice una tira de cinta adhesiva entre la cabeza y el tórax por el lado dorsal y fije firmemente el extremo libre al costado del soporte. Asegúrese de que la cinta en el arnés quede lisa y tensa.

No debe haber espacios visibles entre la parte frontal del soporte para abejas y la cinta. Si hay espacios, es posible que la abeja no pueda extender adecuadamente su per bovis o que pueda escapar. Deje que las abejas se recuperen aproximadamente 30 minutos de la sujeción antes de alimentarlas.

Luego, en un área alejada del área de entrenamiento, administre a cada abeja de tres a cuatro microlitros de sacarosa 0,5 molar durante el intervalo entre la alimentación y el condicionamiento. Coloque las abejas en un área tranquila del laboratorio y dentro de un recipiente de plástico con toallas de papel húmedas. Durante este tiempo, unos minutos antes de comenzar el condicionamiento, evalúe la motivación de la abeja para alimentarse tocando sus antenas con una pequeña gota de solución de sacarosa 0,5 molar.

No los deje alimentarse durante esta prueba. Si responden extendiendo sus psis, probablemente estén suficientemente motivados para aprender y pueden utilizarse en el protocolo. Cuando esté listo, coloque la jeringa de vidrio para olores en un soporte de arcilla modelable y ajústela de modo que la abertura en el extremo ancho apunte directamente hacia las abejas y a 10 E. El extremo de la jeringa debe estar a uno o dos centímetros de la abeja, colocando firmemente el adaptador que conecta el cartucho al sistema de tubos y válvulas de flujo de aire en el extremo estrecho de la jeringa.

Al comienzo de cada ensayo, coloque la abeja sujeta en el soporte del área de condicionamiento con sus antenas orientadas directamente hacia el cartucho de olor. Permita que la abeja descanse en el área durante 15 a 25 segundos antes de iniciar el estímulo olfativo, para que se acostumbre a su nuevo entorno. Presione el botón de inicio para activar el mecanismo de temporización para la entrega del olor.

Observe la respuesta de la abeja al olor después del inicio del estímulo y antes de la presentación del estímulo incondicionado. Tras cada ensayo, permita que la abeja descanse en el área de condicionamiento durante otros 15 a 25 segundos para permitir la formación inicial de la memoria. Mover a la abeja demasiado pronto después del ensayo reducirá significativamente la eficacia de cada ensayo de condicionamiento.

Para administrar la sacarosa, mantenga la punta de la aguja a dos o tres centímetros de la abeja mientras se presenta el olor. Utilice el borde del recinto de entrenamiento para evitar sacudir la jeringa, ya que este movimiento puede distraer a la abeja. Un sonido de señal de alimentación se emitirá durante la presentación del estímulo olfativo.

En cuanto suene la señal de alimentación, toque ligeramente las antenas hasta que la abeja extienda el probóscide y, a continuación, aliméntela. El momento entre la presentación del olor y la presentación de la sacarosa es fundamental. Idealmente, estos dos estímulos deben superponerse brevemente.

Si transcurren más de unos pocos segundos entre la presentación del olor y la presentación de la sacarosa, el rendimiento en el condicionamiento disminuirá. Tras el condicionamiento, utilice ensayos de prueba sin refuerzo para evaluar qué tan bien las abejas recuerdan la asociación condicionada. Primero, coloque una cámara de video sobre un trípode por encima del área de entrenamiento y enfoque la cámara hacia la parte frontal de la cabeza de la abeja, de modo que las antenas y el probóscide queden nítidamente enfocados.

Asegúrese de que una pequeña luz LED, que indica la presentación del estímulo olfativo, esté en un área detrás de la abeja y sea visible en el video, pero no para la abeja. Esto permite identificar el momento de inicio y finalización del olor durante el análisis. Para obtener los resultados más consistentes, utilice cartuchos de olor recién preparados para las pruebas una vez que todo esté configurado.

Comience la prueba presentando el olor como se mostró anteriormente. Comience a grabar 20 segundos antes de presentar el olor y continúe grabando al menos 20 segundos después. Tras la prueba, utilice un software de edición de video para calificar la respuesta de cada abeja a la condición frente al estímulo.

Utilice un sistema de puntuación binario para evaluar la respuesta de extensión del psis, calificando las respuestas como positivas o negativas. Califique la respuesta del individuo B como positiva. Cuando el psis de B se extiende más allá de la línea formada al conectar las puntas de las mandíbulas abiertas, solo califique la respuesta como positiva si B extiende su probóscide después del inicio del olor, pero antes del cese del olor. Califique la respuesta de B como negativa cuando no haya extensión de la probóscide durante el ensayo, o si la probóscide se extiende después del cese del odorante. También se pueden recopilar otros parámetros, como la latencia de la extensión, el número y la duración total de las respuestas de extensión frente a la condición.

El estímulo aumentó en los ensayos de condicionamiento posteriores. Las respuestas a olores de prueba novedosos, que diferían del estímulo en la longitud de la cadena de carbono y/o en la posición del enlace carbono-carbono, se redujeron proporcionalmente al grado de diferencia entre el estímulo condicionado y el olor de prueba novedoso. Estos datos ilustran la variabilidad y el éxito del condicionamiento entre nuevos investigadores.

Las respuestas al octal variaron según el grupo que realizó las pruebas. Durante los ensayos de prueba, el olor utilizado como estímulo condicionado provocó la respuesta más intensa. Cuando el octal se utilizó como estímulo condicionado, la respuesta fue más fuerte durante la prueba en comparación con la metilciclona, un olor novedoso.

De manera similar, el ciclonato de metilo produjo respuestas más intensas cuando se utilizó como estímulo condicionado. Cuando se empleó un apareamiento inverso, la respuesta condicionada se redujo hasta niveles cercanos a los del olor novedoso, lo que ilustra la importancia de la temporización precisa para un condicionamiento exitoso tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las bases neuronales del aprendizaje y la memoria en organismos modelo de insectos, como la abeja melífera.

No olvide que trabajar con insectos, especialmente con abejas melíferas, puede ser peligroso. Asegúrese de usar equipo de protección adecuado cuando trabaje con estos animales.