Un Protocolo de Respuesta de probóscide Extensión para la Investigación de la plasticidad de comportamiento en Insectos: Aplicación a Basic, Biomédica y de Investigación Agrícola

El protocolo de acondicionamiento de la Respuesta de Extensión de la Probóscide (PER), desarrollado para la abeja melífera (Apis mellifera), proporciona un medio ecológicamente relevante y fácilmente cuantificable para estudiar varios mecanismos diferentes de aprendizaje en muchas especies de insectos.

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo implementar el condicionamiento conductual de una respuesta reflexiva simple a la comida en las abejas melíferas. Esto se logra capturando primero a las abejas melíferas, sujetándolas con arneses, alimentándolas con una pequeña cantidad de solución secreta y luego permitiéndoles acostumbrarse a la restricción. A continuación, se seleccionan las perlas para el acondicionamiento que muestran suficiente motivación cuando sus antenas se tocan con sacarosa.

Durante el acondicionamiento, la presentación del olor se combina con una recompensa de sacarosa para provocar la respuesta condicionada. A continuación, los ensayos no reforzados miden la presencia o ausencia de la respuesta, la latencia de la respuesta y la duración de la misma. El paso final es el análisis de los datos y la presentación gráfica de los ensayos de acondicionamiento y prueba.

Esta técnica se ha aplicado con éxito a los estudios de la biología de las abejas melíferas y el comportamiento de aprendizaje de la salud es particularmente sensible a tratamientos disruptivos como los pesticidas, lo que permite evaluar el impacto de este tipo de tratamientos en el comportamiento de las abejas melíferas a niveles subletales. La demostración visual de este método ayuda a comprender el momento del estímulo requerido para un condicionamiento efectivo y los errores comunes que reducen la efectividad. Una persona nueva en este método tendrá dificultades con la atención al detalle requerida tanto por el protocolo como por las condiciones circundantes.

Para empezar, recoja las abejas obreras de la entrada a la colonia cuando se detienen antes de partir o cuando regresan de buscar alimento. Capture solo una abeja por vial. Sostenga la abertura del vial horizontalmente o mirando hacia abajo mientras sujeta la tapa para evitar que se escape.

Una vez que se hayan recolectado las abejas, regrese al laboratorio y coloque algunos de los viales a la vez en una suspensión de agua helada. Una vez que una abeja esté inmóvil, retire el frasco del hielo inmediatamente para evitar la sobreexposición y coloque a la abeja en un arnés de sujeción. Sujete a la abeja con su tórax dorsal mirando hacia la parte recortada del soporte y su cabeza justo por encima de la parte superior.

Presione suavemente la abeja para que las partes de su boca se extiendan más allá del borde del soporte. Deslice una tira de cinta adhesiva entre la cabeza y el tórax en el lado dorsal y fije firmemente el extremo libre al costado del soporte. Asegúrate de que la cinta del arnés esté lisa y tensa.

No debe haber espacios notables entre la parte delantera del portaabejas y la cinta. Si hay huecos, es posible que la abeja no pueda extender su per bois correctamente o que pueda escapar. Permita que las abejas duren unos 30 minutos para recuperarse del arnés antes de alimentarse.

Luego, en un área bien alejada del área de entrenamiento, alimente a cada abeja con unos tres o cuatro microlitros de sacarosa molar durante el intervalo entre la alimentación y el acondicionamiento. Coloque las abejas en un área tranquila del laboratorio y en un recipiente de plástico con toallas de papel húmedas. Durante este tiempo, unos minutos antes de comenzar el acondicionamiento, Testa se motiva a alimentarse tocando sus antenas con una pequeña gota de solución de sacarosa 0,5 molar.

No permita que se alimenten durante esta prueba. Si responden extendiendo su psis, probablemente estén suficientemente motivados para aprender y pueden ser utilizados para el protocolo. Cuando esté listo, coloque la jeringa de olor a vidrio en un soporte de arcilla para modelar y ajústelo de modo que la abertura en el extremo ancho apunte directamente a las abejas y 10 E. El extremo de la jeringa debe estar a uno o dos centímetros de la abeja, colocado de forma segura, el accesorio que conecta el cartucho al tubo Airstream y al sistema de válvulas sobre el extremo estrecho de la jeringa.

Al comienzo de cada prueba, coloque la abeja enjaezada en la clavija en la arena de acondicionamiento con sus antenas apuntando directamente hacia el cartucho de olor. Deje que la abeja descanse en la arena durante 15 a 25 segundos antes de comenzar el estímulo olfativo para permitir que se acostumbre a su nuevo entorno. Presione el botón de inicio para iniciar el mecanismo de temporización para la entrega de olores.

Controle la respuesta de la abeja al olor después del inicio del estímulo y antes de la presentación del estímulo incondicionado. Después de cada prueba, permita que la abeja descanse en el área de acondicionamiento durante otros 15 a 25 segundos para permitir la formación inicial de la memoria. Mover la abeja demasiado pronto después de la prueba reducirá significativamente la efectividad de cada prueba de condicionamiento.

Para liberar la sacarosa, sostenga la punta de la aguja a dos o tres centímetros de la abeja mientras se presenta el olor. Use el borde de la arena de entrenamiento para evitar agitar la jeringa, ya que este movimiento puede distraer a la abeja. Sonará una señal de alimentación durante la presentación del estímulo de olor.

Tan pronto como suene la señal de alimentación, toque ligeramente las antenas hasta que la abeja se extienda como probos, luego alimente a la abeja. El tiempo entre la presentación del olor y la presentación de la sacarosa es crítico. Lo ideal es que estos dos estímulos se superpongan brevemente.

Si transcurren más de unos segundos entre la presentación del olor y la presentación de la sacarosa, el rendimiento en el acondicionamiento disminuirá. Después del condicionamiento, use pruebas de prueba no reforzadas para evaluar qué tan bien las abejas recuerdan la asociación condicionada. Primero, coloque una cámara de video en un trípode sobre el área de entrenamiento y enfoque la cámara en la parte delantera de la cabeza de la abeja para que las antenas y el probus estén enfocados con nitidez.

Asegúrese de que una pequeña luz LED, que indica la presentación del estímulo de olor, esté en un área detrás de la abeja y donde sea visible en el video, pero no para la abeja. Esto permite identificar el momento de inicio del olor y el desplazamiento durante el análisis. Para obtener los resultados más consistentes, use cartuchos de olor recién preparados para realizar pruebas una vez que todo esté configurado.

Comience la prueba presentando el olor como se muestra anteriormente. Comience a grabar 20 segundos antes de presentar el olor y continúe grabando durante al menos 20 segundos después. Después de la prueba, use un software de edición de video para calificar la respuesta de cada abeja a la condición al estímulo.

Utilice un sistema de puntuación binario para puntuar la respuesta de la extensión psis, puntuando las respuestas como positivas o negativas. Puntúa la respuesta de B como positiva. Cuando el B extensus psis más allá de la línea que se hace conectando las puntas de las mandíbulas abiertas solo obtiene una respuesta positiva cuando el B extiende su prob bois después del inicio del olor, pero antes de la compensación del olor puntúa la respuesta de B como negativa cuando no hay extensión del prob Bois durante el ensayo, o si el Pro Bois se extiende después del desplazamiento del odorante, Se pueden recopilar otros parámetros, como la latencia de la extensión y el número y la duración total de las respuestas de respuesta de la extensión a la condición.

El estímulo aumentó a lo largo de los ensayos de condicionamiento posteriores. Las respuestas a los nuevos olores de prueba, que diferían del estímulo en la longitud de la cadena de carbono y/o la posición del carbono carbono, se redujeron proporcionalmente al grado de diferencia entre el estímulo de la condición y el nuevo olor de prueba. Estos datos ilustran la variabilidad y el condicionamiento exitoso entre los nuevos investigadores.

Las respuestas al octal difirieron según el grupo que realizó la prueba. Durante las pruebas de prueba, el olor utilizado como estímulo de la condición provocó la respuesta más fuerte. Cuando se utilizó octal como estímulo de la condición, la respuesta fue más fuerte durante las pruebas en comparación con el ciclón de metilo, un olor nuevo.

De manera similar, el ciclón de metilo produjo respuestas más fuertes cuando se utilizó como estímulo condicionado. Cuando se utilizó el emparejamiento hacia atrás, la respuesta condicionada se redujo a casi el nivel del nuevo olor, lo que ilustra la importancia de un tiempo preciso para un acondicionamiento exitoso después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran las bases neuronales del aprendizaje y la memoria y organismos modelo de insectos como la abeja melífera.

No olvide que trabajar con insectos, especialmente abejas melíferas, puede ser peligroso. Asegúrese de usar el equipo de protección adecuado cuando trabaje con estos animales.