Name: Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de Drosophila Testículos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a preparar testículos de Drosophila para microscopía mediante disección, fijación e inmunofluorescencia. Este método permite observar etapas de espermatogénesis y localización de proteínas en células germinales.

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Los autores desean agradecer a Michael Anderson para establecer en el laboratorio Lee estos métodos aceptados para el estudio de la espermatogénesis con asesoramiento de expertos de Karen Hales. H. Oda y Y. Akiyama-AOD ofrecida generosamente la γ-tubulina-GFP de stock volar. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 a LAL (GM074044).

1. Testículos Disección <ol><li> Anestesie moscas en una botella o frasco con una corriente de CO 2 y la transferencia a una almohadilla de mosca. </li><li> Ordenar moscas bajo un microscopio de disección usando un pequeño pincel, y recoger un número apropiado (dependiendo del experimento) de los machos de Drosophila de los genotipos deseados. Los hombres jóvenes (0-2 días de edad) son ideales para el examen de las células a través de las primeras etapas de la espermatogénesis (por ejemplo espermatogonias, espermatocitos y espermátidas tempranas post-meióticas), mientras que los machos ligeramente mayores (2-5 días de edad) son ideales para el examen de las células en las últimas etapas de la espermatogénesis (en particular, maduran los espermatozoides). </li><li> Use unas pinzas para quitar las alas de cada vuelo (para evitar que las moscas que flotan en el líquido durante la disección). </li><li> Añadir ~ 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 130 mM, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) en una gota a una disección plato cubierto con silicona porun fondo negro. Otras soluciones acuosas se han utilizado con éxito para la disección testículos 3. </li><li> Punto fórceps hacia la parte anterior de la mosca, agarrarlo por el tórax, y sumergirlo en la gota de PBS. Mientras observa a través del microscopio de disección, utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de los genitales externos (estructura de color marrón oscuro situado en el extremo posterior del abdomen ventral) posteriormente hasta que se separe del abdomen. En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y las glándulas accesorias serán removidos del abdomen, junto con los órganos genitales externos, si fuera necesario, introduzca un solo par de pinzas en el abdomen y se burlan de los testículos. </li><li> Separe los testículos y las glándulas accesorias genitales externos utilizando dos pares de pinzas en la caída de PBS (Figura 2). Testículos de tipo salvaje se distinguen fácilmente de los tejidos blancos vecinos por su color amarillo. Proceda inmediatamente al paso 2. </li><li> Para aislar los testículos de los machos pharate (i.. E incluido dentro de la caja de pupa), un paso adicional primero se debe realizar que implica la eliminación de la marcha de la caja de pupa; este paso ha sido descrito previamente en otro lugar 31. Proceda con la disección como para los testículos adultos a partir del paso 1.2. </li><li> Para aislar los testículos de los machos de larvas, lleve a cabo una modificación de un protocolo para el aislamiento de ovarios de larvas de Drosophila 32. Brevemente, las larvas macho se puede distinguir de larvas hembra por la presencia de un par de estructuras grandes, claras ovales (testículos de larvas) incrustados en el tercio posterior de la grasa corporal. Para aislar los testículos de larvas, desollar parcialmente abierta la larva macho para aislar los testículos y el cuerpo de grasa que rodea el abdomen como se describe para el aislamiento de ovarios de larvas. Proceder inmediatamente al paso 2 del protocolo descrito en el presente documento; los testículos más tarde pueden ser eliminados del cuerpo grasa justo antes de montar (pasos 2.3 o 3.14) como se describió para los ovarios 32. </li></ol><ol><li> Use un par de pinzas para colocar suavemente 2-3 pares de testículos en una gota de 4-5 ml de PBS en una cubierta de vidrio cuadrado deslizamiento. Tenga en cuenta que puede necesitar la relación del número testículos al volumen de PBS para ajustar: el exceso de líquido evitar que las células se propaguen correctamente cuando aplastado, mientras que demasiado poco líquido hará que las células revienten cuando aplastada. Opcional: Uso cubierta siliconada desliza para minimizar la adherencia de tejido para cubrir deslizamiento en el paso 3.2. </li><li> Use un par de pinzas para rasgar cada testículo en una posición apropiada para maximizar la presencia de los tipos de células de la línea germinal deseadas en la preparación (tenga en cuenta que los contenidos de los testículos en su mayoría será la salida de la región desgarrada sobre el portaobjetos durante el aplastamiento paso.) Para enriquecer espermatogonias y espermatocitos, rasgar el testículo adyacente a su extremo apical (nivel 1, la Figura 2B). Para enriquecer espermatocitos y espermátidas, desgarro abrir los testículos a un position ligeramente basal al nivel 1 (nivel 2, la Figura 2B). Para enriquecer las células germinales más maduras, rasgar los testículos más cerca de donde comienza la curvatura (nivel 3, Figura 2B). </li><li> Con suavidad, coloque un portaobjetos de vidrio sobre la hoja de la cubierta para aplastar los testículos; no presione manualmente como el peso de la hoja de la cubierta es suficiente para obtener una muestra adecuada aplastada. Trate de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Opcional: Uso revestido de poli-L-lisina portaobjetos para promover la adhesión de tejido se deslice en el paso 3.2. </li><li> Utilice la preparación inmediata (idealmente dentro de 15 minutos de preparación) para observar células vivas por microscopía de contraste de fase, porque las moscas transgénicas con expresión de las proteínas marcadas con fluorescencia en los testículos, las células vivas pueden ser examinadas por microscopía de fluorescencia en este paso. Por otra parte, proceder a la fijación y la tinción de anticuerpos (Protocolo n º 3). </li><li> Absorber suavemente el exceso de líquido bajo el cubreobjetos usando una limpieza wipe para permitir que el aplanamiento de la preparación hasta que las células germinales son claramente enfocado. </li></ol> 3. Formaldehído La fijación y la tinción de anticuerpos <ol><li> Snap congelar cada diapositiva que contiene los testículos aplastados (del Protocolo 2) usando un par de pinzas de metal para sumergirlo brevemente en nitrógeno líquido (nitrógeno líquido hasta que se detiene el burbujeo). </li><li> Retire la hoja de la cubierta inmediatamente usando una cuchilla de afeitar. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio preenfriado lleno de etanol al 95% enfriado con hielo (grado espectrofotométrico, exento de metanol). Almacenar a -20 ° C durante 10 min. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas a un estante de portaobjetos de vidrio lleno con 4% de formaldehído en PBS más 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Guarde a temperatura ambiente durante 7 min. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio lleno de PBS. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 1x. Realice todos los lavados descartando la solución en la parrilla corrediza de vidrio ( <em&gt; Ie. vertiendo hacia fuera) y la sustitución con solución fresca. </li><li> Desechar el PBS y sumergir los portaobjetos en PBS-T durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x. </li><li> El bloqueo de paso (opcional): Sumergir los portaobjetos en PBS más 1% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente. </li><li> Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo en la diapositiva alrededor del tejido aplastado (fácilmente visible a simple vista) con el fin de limitar las soluciones de anticuerpos (agregado en los pasos 3,9 y 3,11). El tejido debe mantenerse húmedo en todo momento durante la realización de la inmunotinción. </li><li> Añadir 30-40 ml de anticuerpo primario (diluido en PBS-T, 1:400 a 1:50, dependiendo de anticuerpo) en el tejido dentro del círculo. Si se ha realizado el bloqueo, diluir anticuerpo primario en PBS-T más 1% de BSA. El anticuerpo anti-gamma-tubulina (para la tinción de los centrosomas en la Figura 4) se diluyó 1:100. Incubar en una cámara oscura húmeda (por ejemplo. Caja de plástico cerradacon toallas húmedas de papel) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 min a temperatura de habitación 3x. Si se realizó el bloqueo, lavar dos veces en PBS-T y una vez en PBS (5 min a temperatura ambiente, cada una). </li><li> Añadir 30-40 ml de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (diluido 1:400 en PBS) a los tejidos y se incuba en la oscuridad durante 1-2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x. </li><li> Añadir 30-40 ml de solución de DAPI (0,2 mg / ml en PBS) para el tejido dentro del círculo. </li><li> Con suavidad, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Si deben aparecer burbujas de aire, mueva con cuidado alrededor de la hoja de la cubierta sin destruir la calabaza hasta que las burbujas se escapan de los lados de la hoja de la cubierta. </li><li> Utilice una toallita de limpieza para borrar el exceso de DAPI de los bordes de la diapositiva. </li><li> Sellar el cubreobjetos a la diapositiva utilizando el esmalte de uñas transparente. </li><li> Utilice esta preparacióndentro de los próximos 3 a 4 horas para ver las células immunostained por microscopía fluorescente. Para el almacenamiento a largo plazo de las diapositivas (hasta por lo menos varias semanas), utilice un medio difícil montar a base de glicerol con DAPI, y almacenar a -20 ˚ diapositivas C. </li><li> Alternativamente, fijar muestras en metanol en lugar de formaldehído (dependiendo del antígeno). Después de completar todo el protocolo hasta el paso 3.2, sumerja las diapositivas de los testículos aplastados en metanol durante 10 minutos a -20 º C y continúe con el paso 3.5 en adelante. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aunque los testículos de los de tipo salvaje moscas pueden ser fácilmente identificados por su color amarillo (a diferencia de los tejidos blancos vecinos), los testículos de las moscas mutantes blancos son de color blanco y por lo tanto a veces se puede confundir con el intestino. Mayoría de las cepas transgénicas, que son típicamente en un fondo blanco, también tienen testículos blancos porque el gen de mini-blanco que se encuentra en P-elementos no promueve la acumulación de pigmen...

Testículos de Drosophila son un sistema modelo ideal para el estudio de muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de células madre, la meiosis, y el desarrollo del esperma 13-18. Los espermatocitos y sus husos meióticos son grandes y por lo tanto, conveniente para el análisis citológico, y los puntos de control del ciclo celular relajado durante la espermatogénesis facilitar el estudio de mutaciones en los genes del ciclo celular. Diferentes tipos de células se pueden observar en la progresión ordenada a lo largo de la longitud de los testículos, y cualquier interrupción de la espermatogénesis pueden conducir a cambios en esta disposición general. Estas características, combinadas con herramientas genéticas Drosophila han facilitado el análisis mutacional de la espermatogénesis 21-23. Las etapas de la espermatogénesis de Drosophila han sido bien definido. Células de la línea germinal que se desarrollan de forma sincrónica dentro de quistes progresan secuencialmente a través de las etapas de la espermatogénesis a lo largo de la longitud de los testículos. Durante boª de la mitosis y divisiones meióticas de las células germinales masculinas, la citocinesis ocurre de forma incompleta de manera que las células hijas permanecen conectadas por puentes citoplásmicos conocidas como canales de anillo (Figura 1). La punta apical del testículo contiene una población de células madre de línea germinal que da lugar a células de espermatogonias, que se someten a cuatro divisiones mitóticas con la citocinesis incompleta para generar quistes 16 de células de espermatocitos primarios. Después de la fase S premeiotic, espermatocitos primarios entran G2, un período de crecimiento prolongado de ~ 90 horas durante el cual aumenta el volumen celular ~ 25 veces. La progresión a través de la meiosis I y la meiosis II resultados en la formación de quistes 32 de células de espermatocitos secundarios y quistes 64 de células de espermátides haploides, respectivamente. Las espermátidas redondas, inmaduros experimentan una amplia remodelación celular para formar espermatozoides maduros. Células post-meióticas, en particular, los haces de alargamiento y espermátidas maduras, ocupan gran parte del volumen de los testículos. Tque el transporte de los espermatozoides éxito funcional a las moscas hembras requiere la coordinación entre las diferentes partes del sistema reproductor masculino, que se compone de varias estructuras apareadas (los testículos, las vesículas seminales y glándulas accesorias) y un único conducto eyaculador (Figura 2). Los espermatozoides se producen en los testículos y se almacenan en las vesículas seminales hasta la cópula 24. Las glándulas accesorias contienen células secretoras que producen el líquido seminal. El esperma de la migración de las vesículas seminales se mezclan con el líquido seminal dentro del conducto eyaculador, que está conectado tanto a las vesículas seminales y las glándulas accesorias. Esta mezcla de espermatozoides y fluido seminal se bombea en última instancia fuera del macho en la vagina de la hembra volar a través de la bombilla de la eyaculación situado en el extremo posterior del macho abdomen 25. Las proteínas en el líquido seminal son esenciales para el almacenamiento prolongado de espermatozoides dentro de los órganos especializados conocidos como espermatecas en el representantetracto roductiva de las hembras de Drosophila 26. Excelente métodos para el aislamiento de los testículos de Drosophila y visualización de células en diversas etapas de la espermatogénesis están disponibles en la literatura científica 3-12. Estamos aquí añadimos a este conjunto de conocimientos mediante la presentación de ejemplos de estos protocolos con una demostración en video que lo acompaña. El protocolo para la preparación de los testículos en vivo muestras para microscopía de contraste de fase se basa en un método descrito previamente 27. El protocolo para la fijación de formaldehído y la inmunotinción de testículos también se basa en un método descrito previamente 28. Los enfoques descritos en el presente documento se han utilizado en muchos estudios de Drosophila espermatogénesis (por ejemplo, para evaluar las funciones de la dineína, un motor de microtúbulos menos de extremo-dirigido, durante la espermatogénesis de Drosophila). Además de los protocolos básicos, se proporcionan sugerencias para varying la disección con el fin de enriquecer las espermatogonias, espermatocitos, o espermatozoide maduro. Diferentes métodos para el procesamiento de los testículos de tal manera que los quistes o bien permanecen intactas o se interrumpen, se describen, según sea necesario. Una ventaja en el uso de testículos de Drosophila como sistema modelo es que, en comparación con los ovocitos y embriones de Drosophila, anticuerpos y colorantes pueden penetrar fácilmente en las células después de su dispersión de los testículos, y se requieren menos etapas de lavado, por lo tanto, los protocolos se pueden realizar en un tiempo relativamente tiempo corto.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Elastómero de silicona de dos partes para la fabricación de placas de disección recubiertas de silicona de la placa de Petri Kimax</td></tr><tr><td>Bolígrafo PAP</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Protector de uñas transparente</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Reactivo antidecoloración con DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-gamma-tubulina de ratón (clon GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Úselo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para siliconar los cubreobjetos</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg / ml en etanol al 75%; almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Productos de Investigación Internacional Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes limpiaparabrisas para tareas delicadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td> Frasco de tinción de vidrio Coplin <td>de grado de biología molecular</td></tr><tr><td>, tapón de rosca</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio esmerilados simples</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio recubiertos de poli-L-lisina</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Opcional (para reemplazar los portaobjetos de microscopio sin tratar)</td></tr> <tr><td>Cubierta de vidrio cuadrada</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015</td></tr><tr><td>Pinzas</td> EMD <td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Patrón 5</td></tr><tr><td>Estereoscopio INOX Stemi 2000-CS</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Objetivo Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objetivo</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis citológico de espermatogénesis: los preparativos en directo y fijas de<em&gt; drosophila</em&gt; testículos

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster es un sistema modelo de gran alcance que ha sido ampliamente utilizado para dilucidar una variedad de procesos biológicos. Por ejemplo, los estudios tanto de la mujer y las líneas germinales masculinas de Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la meiosis, así como la biología de células madre. Excelente protocolos están disponibles en la literatura para el aislamiento y formación de imágenes de los ovarios y los testículos 3-12 de Drosophila. En la presente memoria, los métodos para la disección y preparación de testículos de Drosophila para el análisis microscópico se describen con una demostración de vídeo adjunto. Un protocolo para el aislamiento de los testículos del abdomen de los hombres adultos y preparar diapositivas de tejido vivo para el análisis por microscopía de contraste de fase, así como un protocolo para la fijación y la inmunotinción testículos para el análisis por microscopía de fluorescencia se presentan. Estas técnicas se pueden aplicar en la caracterización de mutantes de Drosophila que exhiben defects en la espermatogénesis, así como en la visualización de localizaciones subcelulares de las proteínas.

Un ejemplo de un par adecuadamente diseccionado de los órganos reproductores masculinos de Drosophila se muestra en la Figura 2A. Testículos retirados desde el abdomen de la mosca macho adulto están típicamente unidos al conducto eyaculador (marrón, Figura 2A &#39;) y un par de glándulas accesorias (verde, Figura 2A&#39;) a través de un par de vesículas seminales (azul, Figura 2A &#39;) . Para separar los testículos de la mayor parte del tejido...

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y preparar los testículos de Drosophila para microscopía. Esto se logra primero mediante la disección de pares de testículos del abdomen de moscas macho. El segundo paso consiste en romper los testículos en el nivel adecuado de desarrollo y aplastarlos para liberar las células en su interior.A continuación, los testículos aplastados se fijan y luego se incuban con anticuerpos primarios y secundarios. El paso final consiste en montar el tejido sobre un portaobjetos para su observación mediante imágenes. En última instancia, se utiliza microscopía de contraste de fases o inmunofluorescencia para observar células en diversas etapas de la espermatogénesis, detectar defectos y analizar la morfología, así como para observar las localizaciones subcelulares de diversas proteínas.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la identificación de funciones críticas de proteínas durante la progresión de la espermatogénesis. La demostración visual del disección de los testículos de RA es fundamental porque un principiante en este procedimiento inicialmente podría tener dificultades para localizar los testículos dentro del abdomen de la mosca. Además, es más fácil demostrar que describir con palabras la forma más eficaz de realizar el aplastamiento del tejido.Para comenzar la disección, anestesie las moscas en un frasco o vial utilizando una corriente de dióxido de carbono. Luego transfiera las moscas anestesiadas a una almohadilla para moscas. Separe las moscas bajo un microscopio estereoscópico utilizando un pincel pequeño para recolectar aproximadamente de seis a ocho machos oph del genotipo deseado.A continuación, retire las alas de cada mosca con pinzas. Esto evitará que las moscas floten en el líquido. Durante la disección, añada 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS en una sola gota sobre una placa de disección recubierta de silicona sobre un fondo negro.Luego, dirija la punta de la pinza hacia el extremo anterior de una de las moscas sin alas. Sujétela por el tórax y sumérjala en la gota de PBS. Identifique la estructura marrón oscuro ubicada en el extremo posterior del abdomen ventral y utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de las gónadas externas hacia posterior hasta que se separen del abdomen.En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y la glándula accesoria se extraerán del abdomen junto con las glándulas genitales externas. Sin embargo, si no es así, inserte un par de pinzas en el abdomen y extraiga cuidadosamente los testículos. Separe los testículos de las glándulas accesorias y de las glándulas genitales externas utilizando dos pares de pinzas.Distinga los testículos de tipo silvestre de los tejidos blancos adyacentes por su color amarillo. Para preparar la muestra para imágenes en vivo, use un par de pinzas para colocar suavemente dos o tres pares de testículos en una gota de cuatro a cinco microlitros de PBS sobre un cubreobjetos cuadrado de vidrio. A continuación, desgarre.Abrir cada testículo con un par de pinzas en una posición de nivel adecuada para maximizar la presencia de los tipos celulares de la línea germinal deseados en la preparación. El contenido de los testículos saldrá por la zona rasgada hacia la lámina. Durante el paso de aplastamiento para enriquecer espermátogonos y espermatocitos, abrir los testículos adyacentes a su extremo apical para enriquecer.Para espermatocitos y espermátidas, abra ligeramente los testículos en una posición ligeramente basal al nivel uno para enriquecer con células germinales más maduras. Abra los testículos más cerca del punto donde comienza la curvatura. El siguiente paso consiste en aplastar los testículos colocando suavemente una laminilla sobre la cubreobjetos.No aplique presión manualmente y evite atrapar burbujas de aire. Utilice la muestra dentro de los 15 minutos posteriores a su preparación para observar células vivas. Mediante microscopía de contraste de fase, retire suavemente con una toallita de limpieza el exceso de líquido debajo del cubreobjetos, para aplanar la preparación hasta que las células germinales estén claramente enfocadas.Congele rápidamente las laminillas preparadas que contienen testículos aplastados, sumergiéndolas con unas pinzas metálicas en nitrógeno líquido hasta que deje de burbujear. Retire inmediatamente la cubreobjetos con una cuchilla de afeitar. Luego transfiera las laminillas con las pinzas metálicas a una bandeja para laminillas de vidrio previamente enfriada, llena con etanol al 95 % helado, y almacene la muestra a menos 20 grados Celsius durante 10 minutos.Transfiera los portaobjetos equilibrados a una rejilla para portaobjetos de vidrio llena con formaldehído al 4 % en PBS más Triton X-100 al 0,1 % o PBST y almacénelos a temperatura ambiente durante siete minutos. Luego transfiera los portaobjetos a una rejilla llena con PBS. Lave los portaobjetos en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente descartando la solución en la rejilla y reemplazándola con solución fresca de PBS.Repita el lavado una vez. Deseche el PBS e introduzca los portaobjetos en PBST durante 30 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares. A continuación, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez a temperatura ambiente. Dibuje un círculo alrededor del tejido aplastado sobre el portaobjeto utilizando un rotulador de barrera hidrofóbica, con el fin de confinar las soluciones de anticuerpos y mantener el tejido húmedo en todo momento durante la inmunotinción.Luego, agregue de 30 a 40 microlitros de anticuerpo primario diluido en PBST al tejido dentro del círculo. Incube el portaobjetos en una cámara húmeda y oscura durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius tras la incubación con el anticuerpo primario. Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, agregue de 30 a 40 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo, diluido en PBS, al tejido e incube a oscuras durante una a dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue de 30 a 40 microlitros de solución DAPI al tejido dentro del círculo.Coloque suavemente una cubreobjetos de vidrio sobre el tejido, teniendo especial cuidado en evitar atrapar burbujas de aire. Si aparecen burbujas de aire, mueva cuidadosamente la cubreobjetos sin dañar la muestra hasta que las burbujas salgan por los bordes de la cubierta. Absorba el exceso de líquido en los bordes del portaobjetos con una toallita de limpieza.Luego, selle el cubreobjetos utilizando esmalte de uñas y observe las células inmunomarcadas mediante un microscopio fluorescente dentro de las tres a cuatro horas. Este esquema representa la ubicación de diversos niveles de maduración celular dentro de los testículos de Drosophila. El nivel uno contiene células más jóvenes que se encuentran en las primeras etapas de la espermatogénesis, y el nivel tres contiene células espermáticas más maduras.El nivel dos contiene una población mixta de células germinales mitóticas y posmitóticas. Una imagen correspondiente de contraste de fase muestra la liberación de espermatogonias y espermatocitos primarios tempranos y tardíos cuando los testículos se rompen en el nivel uno. La flecha amarilla también señala la fusión de dos o más células interconectadas debido a una citocinesis incompleta.Un artefacto del procedimiento de aplastamiento mostrado aquí es una imagen de contraste de fase correspondiente que muestra la liberación de espermatocitos primarios tardíos y células posmeióticas, incluyendo espermátidas redondas, espermátidas alargándose y espermatozoides maduros, cuando los testículos se rompieron en el nivel dos. La imagen de contraste de fase de testículos aplastados también puede utilizarse para identificar fácilmente defectos en las abundantes espermátidas redondas. Aquí se muestran espermátidas redondas de tipo silvestre con un núcleo claro en fase, unidas a un agregado mitocondrial único oscuro en fase de tamaño aproximadamente igual.En contraste, los espermátidos de testículos Aun contienen múltiples núcleos pequeños y un gran agregado mitocondrial como resultado de una citocinesis fallida y errores en la segregación cromosómica. Las imágenes en escala de grises mostradas aquí provienen de una preparación de testículos aplastados teñidos con reactivos que identifican los microtúbulos, el ADN y los centrosomas en color. Las imágenes combinadas muestran un espermatozoide en división, un amplio campo de espermátidos redondos y un haz de espermatozoides maduros. Una vez dominada la preparación de muestras para microscopía de contraste de fase, esta puede realizarse en 20 a 30 minutos.La preparación de muestras para microscopía de inmunofluorescencia puede realizarse en seis horas si se lleva a cabo adecuadamente. Además del procesamiento de testículos de oph para microscopía, los testículos diseccionados también pueden utilizarse alternativamente para el análisis bioquímico de proteínas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Obtención de imágenes de las proteínas de Drosophila centrosomales durante la espermatogénesis es un método poderoso para identificar nuevas proteínas críticas para la biología del centrosoma, así como para dilucidar la función particular de los jugadores conocidos en este proceso.

Los centrosomas de imagen en Fly Testículos

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo describe la disección y el cultivo de testículos intactos y quistes de la línea germinal de las pupas de Drosophila melanogaster. Este método permite la observación microscópica de la espermatogénesis ex vivo. Además, describimos un ensayo farmacológico del efecto de los inhibidores en etapas específicas del desarrollo de las células germinales en los testículos de pupa.

Ex vivo Cultura de Drosophila Pupal Testis y individuales masculinos quistes línea germinal: Disección, Imaging y Tratamiento farmacológico

Presentamos protocolos para la recolección, preparación e imagen de ovocitos maduros de Drosophila. Estos métodos permiten la visualización del comportamiento de los cromosomas y el ensamblaje y la función del huso durante la meiosis.

Técnicas de Imagen y Prometafase metafase de la meiosis I en fijo<em&gt; Drosophila</emLos ovocitos&gt;

El objetivo de esta técnica de squash del túbulo es rápidamente evaluar características citológicas de desarrollo espermatocitos de ratón mientras que preserva la integridad celular. Este método permite el estudio de todas las etapas de la espermatogénesis y puede implementarse fácilmente junto a otros enfoques biológicos bioquímicos y moleculares para el estudio de la meiosis de ratón.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

El objetivo de este protocolo es analizar la división celular en tejido intacto mediante microscopía celular viva y fija utilizando esperamorcitos meióticos Drosophila. El protocolo demuestra cómo aislar testículos enteros e intactos de larvas de Drosophila y pusias tempranas, y cómo procesarlos y montarlos para microscopía.

Preparación de pruebas de larvas y pupales de Drosophila para el análisis de la división celular en vivo, tejido intacto

Presentamos aquí un protocolo mejorado para la preparación de montaje completo y la inmunotensión de los testículos de Drosophila, adecuado para la microscopía confocal y también permitiendo el etiquetado reproducible y confiable. Ilustramos este protocolo por la representación y la cuantificación 3D de los experimentos del colocalization en los spermatocytes grandes S4-S5.

Inmunostaining De Todo El Monte Drosophila Testículos Para El Análisis Confocal 3D De Los Espermatocitos Grandes

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Este artículo informa una inhibición in vivo de CENP-E a través de cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295, un modelo valioso para la división meiótica masculina. Usando los ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, mostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica e inestabilidad del genoma en espermatocitos de ratón.

Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

Aprende a preparar testículos de Drosophila para microscopía mediante disección, fijación e inmunofluorescencia. Este método permite observar etapas de espermatogénesis y localización de proteínas en células germinales.

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