Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de

El objetivo general de este procedimiento es diseccionar y preparar los testículos de Drosophila para microscopía. Esto se logra primero mediante la disección de pares de testículos del abdomen de moscas macho. El segundo paso consiste en romper los testículos en el nivel adecuado de desarrollo y aplastarlos para liberar las células en su interior.

A continuación, los testículos aplastados se fijan y luego se incuban con anticuerpos primarios y secundarios. El paso final consiste en montar el tejido sobre un portaobjetos para su observación mediante imágenes. En última instancia, se utiliza microscopía de contraste de fases o inmunofluorescencia para observar células en diversas etapas de la espermatogénesis, detectar defectos y analizar la morfología, así como para observar las localizaciones subcelulares de diversas proteínas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como la identificación de funciones críticas de proteínas durante la progresión de la espermatogénesis. La demostración visual del disección de los testículos de RA es fundamental porque un principiante en este procedimiento inicialmente podría tener dificultades para localizar los testículos dentro del abdomen de la mosca. Además, es más fácil demostrar que describir con palabras la forma más eficaz de realizar el aplastamiento del tejido.

Para comenzar la disección, anestesie las moscas en un frasco o vial utilizando una corriente de dióxido de carbono. Luego transfiera las moscas anestesiadas a una almohadilla para moscas. Separe las moscas bajo un microscopio estereoscópico utilizando un pincel pequeño para recolectar aproximadamente de seis a ocho machos oph del genotipo deseado.

A continuación, retire las alas de cada mosca con pinzas. Esto evitará que las moscas floten en el líquido. Durante la disección, añada 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato o PBS en una sola gota sobre una placa de disección recubierta de silicona sobre un fondo negro.

Luego, dirija la punta de la pinza hacia el extremo anterior de una de las moscas sin alas. Sujétela por el tórax y sumérjala en la gota de PBS. Identifique la estructura marrón oscuro ubicada en el extremo posterior del abdomen ventral y utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de las gónadas externas hacia posterior hasta que se separen del abdomen.

En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y la glándula accesoria se extraerán del abdomen junto con las glándulas genitales externas. Sin embargo, si no es así, inserte un par de pinzas en el abdomen y extraiga cuidadosamente los testículos. Separe los testículos de las glándulas accesorias y de las glándulas genitales externas utilizando dos pares de pinzas.

Distinga los testículos de tipo silvestre de los tejidos blancos adyacentes por su color amarillo. Para preparar la muestra para imágenes en vivo, use un par de pinzas para colocar suavemente dos o tres pares de testículos en una gota de cuatro a cinco microlitros de PBS sobre un cubreobjetos cuadrado de vidrio. A continuación, desgarre.

Abrir cada testículo con un par de pinzas en una posición de nivel adecuada para maximizar la presencia de los tipos celulares de la línea germinal deseados en la preparación. El contenido de los testículos saldrá por la zona rasgada hacia la lámina. Durante el paso de aplastamiento para enriquecer espermátogonos y espermatocitos, abrir los testículos adyacentes a su extremo apical para enriquecer.

Para espermatocitos y espermátidas, abra ligeramente los testículos en una posición ligeramente basal al nivel uno para enriquecer con células germinales más maduras. Abra los testículos más cerca del punto donde comienza la curvatura. El siguiente paso consiste en aplastar los testículos colocando suavemente una laminilla sobre la cubreobjetos.

No aplique presión manualmente y evite atrapar burbujas de aire. Utilice la muestra dentro de los 15 minutos posteriores a su preparación para observar células vivas. Mediante microscopía de contraste de fase, retire suavemente con una toallita de limpieza el exceso de líquido debajo del cubreobjetos, para aplanar la preparación hasta que las células germinales estén claramente enfocadas.

Congele rápidamente las laminillas preparadas que contienen testículos aplastados, sumergiéndolas con unas pinzas metálicas en nitrógeno líquido hasta que deje de burbujear. Retire inmediatamente la cubreobjetos con una cuchilla de afeitar. Luego transfiera las laminillas con las pinzas metálicas a una bandeja para laminillas de vidrio previamente enfriada, llena con etanol al 95 % helado, y almacene la muestra a menos 20 grados Celsius durante 10 minutos.

Transfiera los portaobjetos equilibrados a una rejilla para portaobjetos de vidrio llena con formaldehído al 4 % en PBS más Triton X-100 al 0,1 % o PBST y almacénelos a temperatura ambiente durante siete minutos. Luego transfiera los portaobjetos a una rejilla llena con PBS. Lave los portaobjetos en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente descartando la solución en la rejilla y reemplazándola con solución fresca de PBS.

Repita el lavado una vez. Deseche el PBS e introduzca los portaobjetos en PBST durante 30 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares. A continuación, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez a temperatura ambiente. Dibuje un círculo alrededor del tejido aplastado sobre el portaobjeto utilizando un rotulador de barrera hidrofóbica, con el fin de confinar las soluciones de anticuerpos y mantener el tejido húmedo en todo momento durante la inmunotinción.

Luego, agregue de 30 a 40 microlitros de anticuerpo primario diluido en PBST al tejido dentro del círculo. Incube el portaobjetos en una cámara húmeda y oscura durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius tras la incubación con el anticuerpo primario. Lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Luego, agregue de 30 a 40 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo, diluido en PBS, al tejido e incube a oscuras durante una a dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue de 30 a 40 microlitros de solución DAPI al tejido dentro del círculo.

Coloque suavemente una cubreobjetos de vidrio sobre el tejido, teniendo especial cuidado en evitar atrapar burbujas de aire. Si aparecen burbujas de aire, mueva cuidadosamente la cubreobjetos sin dañar la muestra hasta que las burbujas salgan por los bordes de la cubierta. Absorba el exceso de líquido en los bordes del portaobjetos con una toallita de limpieza.

Luego, selle el cubreobjetos utilizando esmalte de uñas y observe las células inmunomarcadas mediante un microscopio fluorescente dentro de las tres a cuatro horas. Este esquema representa la ubicación de diversos niveles de maduración celular dentro de los testículos de Drosophila. El nivel uno contiene células más jóvenes que se encuentran en las primeras etapas de la espermatogénesis, y el nivel tres contiene células espermáticas más maduras.

El nivel dos contiene una población mixta de células germinales mitóticas y posmitóticas. Una imagen correspondiente de contraste de fase muestra la liberación de espermatogonias y espermatocitos primarios tempranos y tardíos cuando los testículos se rompen en el nivel uno. La flecha amarilla también señala la fusión de dos o más células interconectadas debido a una citocinesis incompleta.

Un artefacto del procedimiento de aplastamiento mostrado aquí es una imagen de contraste de fase correspondiente que muestra la liberación de espermatocitos primarios tardíos y células posmeióticas, incluyendo espermátidas redondas, espermátidas alargándose y espermatozoides maduros, cuando los testículos se rompieron en el nivel dos. La imagen de contraste de fase de testículos aplastados también puede utilizarse para identificar fácilmente defectos en las abundantes espermátidas redondas. Aquí se muestran espermátidas redondas de tipo silvestre con un núcleo claro en fase, unidas a un agregado mitocondrial único oscuro en fase de tamaño aproximadamente igual.

En contraste, los espermátidos de testículos Aun contienen múltiples núcleos pequeños y un gran agregado mitocondrial como resultado de una citocinesis fallida y errores en la segregación cromosómica. Las imágenes en escala de grises mostradas aquí provienen de una preparación de testículos aplastados teñidos con reactivos que identifican los microtúbulos, el ADN y los centrosomas en color. Las imágenes combinadas muestran un espermatozoide en división, un amplio campo de espermátidos redondos y un haz de espermatozoides maduros. Una vez dominada la preparación de muestras para microscopía de contraste de fase, esta puede realizarse en 20 a 30 minutos.

La preparación de muestras para microscopía de inmunofluorescencia puede realizarse en seis horas si se lleva a cabo adecuadamente. Además del procesamiento de testículos de oph para microscopía, los testículos diseccionados también pueden utilizarse alternativamente para el análisis bioquímico de proteínas.