DOI: 10.3791/51062-v
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
El circuito de alimentación en larvas de Drosophila melanogaster sirve un modelo simple pero potente que permite a los cambios en la tasa de alimentación que se correlacionan con las alteraciones en los circuitos neurales stomatogastric. Este circuito se compone de las neuronas serotoninérgicas centrales que envían proyecciones a los ganchos de la boca así como el intestino anterior.
El objetivo general de este procedimiento es utilizar el sistema modelo de Drosophila para correlacionar los resultados del comportamiento con los cambios en la arquitectura neuronal. Esto se logra estableciendo primero jaulas de población de Drosophila adulta para recolectar larvas. El siguiente paso del procedimiento es evaluar la capacidad locomotora de las larvas de segundo a tercer estadio tardío.
El tercer paso es evaluar el comportamiento alimentario de las larvas mediante la observación de la extensión y retracción de sus ganchos bucales. El paso final es diseccionar y preparar muestras ventriculares comprobadas de larvas de tercer estadio tardío utilizando técnicas inmunohistoquímicas. En última instancia, los resultados pueden mostrar cómo las aberraciones en la arquitectura neuronal durante el desarrollo se relacionan con los cambios de comportamiento mediante el uso combinado de ensayos de comportamiento y microscopía de inmunofluorescencia.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una mejor comprensión del desarrollo de la arquitectura neuronal, lo que permite comprender mejor el progreso de las enfermedades neurológicas. La demostración del procedimiento será realizada por un estudiante de posgrado en mi laboratorio. Mantener las jaulas de población de Drosophila a 25 grados centígrados en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas.
Siempre que los grupos de control y experimental estén expuestos a las mismas condiciones de iluminación, esta técnica se puede realizar en un entorno de laboratorio estándar. El uso de poblaciones establecidas recolecta larvas permitiendo que las hembras pongan huevos durante la noche en jugo de manzana. Las placas de agar cambian el plato por la mañana y colocan una pequeña cucharada de levadura en el centro del plato recolectado.
La levadura atraerá a las larvas eclosionadas, permitirá que los huevos se desarrollen durante 24 horas a 25 grados centígrados y, al día siguiente, recogerá las primeras larvas del estadio de la pasta. Con una espátula de metal, transfiera las larvas a un plato de jugo de manzana fresco o jugo de uva. Se puede agregar pasta de levadura adicional para nutrir las larvas hasta que se realicen los ensayos para recolectar las larvas del segundo y tercer estadio temprano, lo que permite que el primer estadio envejezca durante 40 a 48 horas.
Durante este período de tiempo, las tasas de alimentación son constantes para recolectar. Las larvas del tercer estadio tardío crían las larvas en botellas. La cría de larvas de tercer estadio tardío en platos de jugo puede ser perjudicial debido a la acumulación de agricultura en el sistema gástrico somático.
La edad de las larvas puede confirmarse por la morfología del gancho bucal, ya que hay distintos cambios en esta estructura. Con cada moho larval, recoja las larvas del segundo y temprano del tercer estadio lavando suave y extensamente el plato de jugo con agua y vertiendo las larvas en un filtro de malla, luego proceda con el análisis del comportamiento. Coloque una sola larva de segundo a tercer estadio tardío en un sustrato de 2% acer en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros y permita que las larvas se aclimaten durante 30 segundos durante exactamente un minuto.
Usando un conteo de contador, cada movimiento posterior a anterior sobre el sustrato, marque cada contracción que ocurra en tres cuartas partes del cuerpo del animal. Cuando la larva se balancea de lado a lado, pero en realidad no cambia de posición, estos movimientos no se puntúan. Ocasionalmente, una contracción completa de anterior a posterior genera un movimiento hacia atrás como una locomoción hacia adelante.
También se puntúa la locomoción hacia atrás. Sustituya la placa de ensayo después de que se hayan realizado pruebas con un máximo de 10 animales en total. Realice al menos 20 grabaciones por condición experimental.
Puntúe cada larva utilizada en el ensayo locomotor en el ensayo de alimentación utilizando acero inoxidable romo. Número cinco, pinzas. Transfiera con cuidado una larva de la placa de agricultura locomotora al centro de una placa llena de agricultura cubierta con cinco mililitros de una solución de levadura homogénea.
En la solución de levadura, las larvas permanecerán en gran medida en su lugar y la alimentación se correlaciona directamente con la tasa de contracciones del gancho bucal, que se ven como la extensión y retracción del cefalón faríngeo scle derechos Permita que las larvas se aclimaten durante 30 segundos y luego, durante un minuto, registre el número de contracciones del gancho bucal usando un contador. Comience cargando formaldehído de grado 4%EM recién preparado en PBS en un vidrio puntual de tres pocillos. A continuación, transfiera una larva errante del tercer estadio a una placa de disección con PBS.
Con una pinza sujete el extremo posterior y con la otra sujete los ganchos bucales mientras mantiene el extremo posterior inmóvil. Tire suavemente de los ganchos bucales para acceder a las tripas. Elimine cualquier tejido asociado como las glándulas salivales, el cerebro, el cuerpo graso, etc.
Luego, transfiera cada tripa al plato de tres pocillos que contiene la solución de formaldehído. Incubar las tripas a cuatro grados centígrados durante la noche en una caja de cultivo de tejidos opacos. Al día siguiente, antes de retirar la solución de fijación, retire la seca gástrica y corte el intestino medio cerca de los ventriculares probados para que las proyecciones se puedan ver claramente sin impedimentos.
Ahora, reemplace el fijador con un XPBT y deje que los tejidos se incuben durante 10 minutos con un balanceo suave. Realice este lavado de PBT seis veces. A continuación, agregue serotonina, que mejorará la señalización de serotonina sin afectar la arquitectura neuronal.
A continuación, incubar las tripas durante una hora a cuatro grados centígrados sin mecer. Después de una hora, lave bien las tripas con PBT seis veces para eliminar el anticuerpo primario. A continuación, incubar las tripas durante la noche a cuatro grados centígrados con el anticuerpo primario antiserotonina.
Al día siguiente, repita los seis lavados PPT y siga con la incubación secundaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados durante 90 minutos. Use de uno a 400 Alexa piso 5 68 cabra anti-EE. UU., o de uno a 400 IgG anti conejo. Retire el anticuerpo secundario utilizando el régimen de lavado PBT y luego incube las tripas en carbonato de sodio de cuatro milimolares con un balanceo suave durante 10 minutos.
A continuación, las tripas pueden montarse en galato de propilo al 4% con carbonato de sodio de 20 milimolares como tampón y observarse bajo fluorescencia con un aumento de 400 x para su análisis. Evite tomar imágenes en el extremo posterior de los ventriculares comprobados porque estas fibras están muy agrupadas. Las fibras más posteriores en el intestino medio están más ramificadas porque se fasciculan una vez que ingresan al tejido.
Las fibras de neurita se pueden cuantificar mediante el uso de software comercial como neuro lucita y neuro Explorer, calculándolas manualmente o mediante el uso del software disponible gratuitamente. Las imágenes simples de trazador de nerita que no son claras dificultarán la distinción entre la fibra y las varices y no deben usarse si la arquitectura de la fibra se distingue claramente del fondo. Y si se pueden identificar várices individuales a lo largo de la longitud de nerita, la preparación es apropiada para el análisis.
Además, si las varices individuales se pueden identificar del resto de la fibra, este es otro indicador de una imagen de calidad para el análisis. Las fibras axonales que se proyectan desde el cerebro se agrupan en el nervio de recurrencia y son inapropiadas para el análisis hasta que llegan al ventrículo comprobado, donde se separan e inervan. El sistema gástrico esteomático analiza todas las fibras a excepción de las que están fuera del rango de enfoque.
En algunos casos, las fibras se curvarán entre múltiples planos de enfoque, trazarán las proyecciones de fibras individuales desde el cerebro hasta los ventriculares probados y contarán las várices y ramas, luego calcularán la frecuencia de grandes varices por unidad de longitud. El estudio del circuito de alimentación serotoninérgico es eficaz para analizar la influencia de factores particulares en el desarrollo del sistema nervioso. Al cuantificar la velocidad de alimentación, es posible vincular la arquitectura axonal del circuito de alimentación con su salida funcional.
El ensayo locomotor no muestra diferencias en las respuestas locomotoras entre los genotipos control y mutantes. Si las mutaciones solo afectan al circuito de alimentación, el cuerpo elipsoide mutante se abre. EBO tres tiene un defecto estructural en el cuerpo elipsoide del complejo central.
La cepa parental de tipo salvaje. El CSWU reveló que la EO tres da lugar a una alimentación deprimida, mientras que la locomoción no se ve afectada. Los defectos de desarrollo en los mutantes EO tres afectaron la arquitectura de urato del intestino.
Estas larvas mostraron más ramificación, así como más varices, tanto pequeñas como grandes, a lo largo de la longitud del urato. Observe los nudos de rama en las flechas, las varices en las puntas de flecha y las varices grandes en el asterisco. Estos cambios en la ramificación neuronal se cuantificaron para el análisis estadístico.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe dañar las larvas ni las muestras de tejido disecadas.
06:55
Related Videos
15.9K Views
09:22
Related Videos
19.4K Views
03:08
Related Videos
292 Views
07:42
Related Videos
19.4K Views
07:24
Related Videos
8.5K Views
06:13
Related Videos
6K Views
07:24
Related Videos
3.9K Views
07:13
Related Videos
6.7K Views
08:55
Related Videos
3.5K Views
06:02
Related Videos
2.7K Views
