La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un In Vitro Ensayo de adherencia

El objetivo general de este procedimiento es examinar la capacidad de un levario de células estreptocócicas probióticas para inhibir la adherencia neumocócica a una línea celular epitelial. Esto se logra preparando primero las monocapas de células epiteliales CCL 23. En una placa de 24 pocillos, el siguiente slovar y neumococos se añaden a la monocapa en secuencia y las células se incuban.

En el paso final, los pocillos se lavan para eliminar las bacterias no adherentes. Las células epiteliales CCL 23 se lisan y se recolecta el contenido del pocillo. En última instancia, el impacto de salivarius en la adherencia neumocócica puede evaluarse cuantificando el número de neumococos asociados a células.

Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas, como si los probióticos pueden inhibir la adherencia de patógenos bacterianos como el neumococo. Tuvimos la idea de este método cuando comenzamos a investigar el uso potencial de la hipnosis de lactobacilos, GG y otros probióticos en el tracto respiratorio. El día antes del experimento se dividirán para cultivar de confluencia, CCL 23 células epiteliales, y luego diluirlas en medios precalentados a una concentración de 150.000 células por mililitro en un tubo estéril de 50 mililitros.

A continuación, siembra, un mililitro de las células por pocillo en una placa de cultivo de tejido tratada de 24 pocillos e incubar las células durante la noche. Luego, usando un asa de 10 microlitros, inoculen de 10 a 12 colonias bien separadas de cada cultivo bacteriano en una alícuota de 10 mililitros de caldo Todd Hewitt más un 0,5% de extracto de levadura. Realice un vórtice breve e incube los cultivos durante 14 a 16 horas el día del experimento.

Agite cada uno de los cultivos bacterianos durante tres a cinco segundos, luego agregue 100 microlitros de neumococos y 100 microlitros de salivarius en tubos precalentados etiquetados, que contienen 10 mililitros de caldo. Agite los tubos inoculados durante tres a cinco segundos e incube a 37 grados centígrados para que los cultivos crezcan hasta la fase logarítmica media. Después de confirmar al menos el 80% de la fluidez del cultivo celular CCL 23, utilice la pipeta de transferencia para eliminar los medios de cada pocillo de la placa de 24 pocillos, inclinando ligeramente la placa para evitar perturbar la monocapa celular, luego lave los pocillos dos veces agregando aproximadamente 500 microlitros de PBS precalentado previamente y retirando suavemente el líquido con una pipeta de transferencia.

Incline la placa durante los lavados para ayudar a preservar la monocapa después del segundo lavado. Agregue 500 microlitros de medio precalentado a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora mientras prepara los cultivos bacterianos. En primer lugar, se mide la densidad óptica de un mililitro del cultivo de levarius en el absorbente 600.

A continuación, transfiera cinco mililitros del cultivo de Sal Levarius a un tubo de 10 mililitros y centrifugue en tubo durante cuatro minutos a 1.870 Gs a temperatura ambiente. Después de desechar el snat Resus, suspenda el pellet en 200 a 1000 microlitros de cloruro de sodio puntual al 85% dependiendo de la lectura de OD hasta una concentración final de aproximadamente 1,5 veces 10 a la novena colonia formando unidades por mililitro. Agregar el número correcto de bacterias es la parte más complicada del experimento, ya que el número real de bacterias agregadas no se determina hasta que se realiza el recuento de colonias al día siguiente.

Ahora transfiera el inóculo salival resuspendido a un tubo de micro fuga etiquetado como alto. Divida la alta concentración de uno a 10 y de uno a 100 en más punto de cloruro de sodio al 85% para hacer concentraciones medias y bajas de alvar para los tubos de vórtice de ensayo entre diluciones para crear los pozos de control de heparina. Retire 40 microlitros de medio de cada pocillo de control y agregue 50 microlitros de heparina hasta una concentración final de 100 unidades por mililitro por pocillo.

Agregue 10 microlitros de cloruro de sodio al 85% solo a las celdas CCL 23, y las celdas CCL 23 más neumococos solo vórtice completamente todas las concentraciones de áreas SIV. A continuación, añada 10 microlitros de uno a 10 sin diluir y uno a 100 en diversas concentraciones a los pocillos adecuados para favorecer el contacto bacteriano con la célula. Centrífuga monocapa de la placa durante tres minutos a 114 Gs a temperatura ambiente y luego incube la placa durante una hora mientras las células se incuban, diluya en serie el stock salival en cloruro de sodio al 85% y use un esparcidor estéril para dispersar 100 microlitros de las diluciones de 10 a menos cinco, 10 a menos seis y 10 a menos siete por duplicado en placas de agar sangre de caballo.

Cultive las placas en posición invertida durante la noche hacia el final de la monocapa como incubación de los bálsamos. Mida la densidad óptica del cultivo neumocócico y luego reduzca un mililitro de las células. Resus suspende el pellet en 300 a 2000 microlitros de cloruro de sodio puntual al 85% dependiendo de la lectura del OD hasta una concentración final de aproximadamente 150 millones de unidades formadoras de colonias por mililitro.

A continuación, añada 10 microlitros de neumococos sin diluir a todos los pocillos, excepto a los pocillos de control negativo, vuelva a centrifugar la placa de 24 pocillos y, a continuación, incube los cocultivos durante tres horas durante la etapa de incubación. Diluir y colocar en placas el caldo antineumocócico de manera similar al salivarius. Después de tres horas de incubación, revise las células bajo el microscopio para ver si hay algún efecto citopático.

Ahora retire los medios de cada pocillo y lave suavemente los cocultivos tres veces con un XPBS para eliminar las bacterias no adherentes, teniendo cuidado de no alterar las monocapas. A continuación, lisa las células con 200 microlitros de 0,1%Dig toin durante siete minutos a 37 grados centígrados y 5%dióxido de carbono. A continuación, añade 800 microlitros de THB a cada uno.

Pipetee hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces y recoja las suspensiones celulares de cada pocillo en tubos de microcentrífuga marcados. Por último, diluir en serie los neumococos adheridos y contar las colonias al día siguiente en las placas de dilución adecuadas. Para cuantificar los neumococos y alvar de esta tabla, se muestran los resultados de un experimento representativo en el que los neumococos se añadieron a las células CCL 23 una hora después de la adición de slovar.

La adherencia neumocócica se cuantificó tanto por conteo de viables como por lit. Los resultados de A-Q-P-C-R fueron consistentes entre los dos métodos tanto para el número absoluto de bacterias como para el porcentaje de adherencia. Normalizado al número de neumococos adheridos en los pocillos que contienen neumococos solos.

La heparina se utiliza como control, ya que se sabe que inhibe la adherencia neumocócica. Por lo tanto, la reducción de la adherencia en aproximadamente un 40% o más en las muestras de neumococo más heparina en comparación con el neumococo solo es indicativa de un ensayo exitoso. Como salival inhibe la adherencia neumocócica de una manera dependiente de la dosis, donde la alta concentración de salivarius de aproximadamente 10 salivarius por un neumococo resultó en la adherencia neumocócica más baja.

Estos injertos demuestran la adherencia de los neumococos a las células CCL 23 cuando se añade salivarius, una hora antes de los neumococos al mismo tiempo, o una hora después de los neumococos. Alvar es más eficaz para inhibir la adherencia neumocócica cuando se añade antes de los neumococos, ya que tanto las dosis altas como las medias de Alvar redujeron significativamente la adherencia neumocócica en el ensayo de preedición. Mientras que la edición de Coit y la post edición analizan solo las dosis altas de Slovar inhibieron la adherencia neumocócica.

Por lo tanto, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo in vitro para medir la inhibición de la adherencia neumocócica por las áreas de células de estreptococo probiótico.