Name: La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un In Vitro Ensayo de adherencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a evaluar el efecto inhibidor de Streptococcus salivarius sobre la adherencia de S. pneumoniae en monocapas de células epiteliales CCL 23 mediante ensayos in vitro. Este método permite cuantificar la colonización bacteriana.

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Este trabajo fue apoyado por fondos del Programa de Apoyo a la Infraestructura Childrens Operativa del Gobierno de Victoria Instituto e Investigación Murdoch.

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<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una parte crítica de este ensayo es la adición de las concentraciones apropiadas de S. salivarius y neumococos en las secciones 3.1.7 y 3.1.12. Las concentraciones se estimaron utilizando lecturas de DO, pero los inóculos exacta no se determinan hasta que las placas se contaron el día siguiente. Por esta razón, se recomienda la realización de curvas de crecimiento para medir OD y los recuentos de viables (UFC / ml) en el tiempo para todas las cepas bacterianas usadas en el ensayo para identificar la fase semilo...

Streptococcus pneumoniae (neumococo) es una bacteria Gram positiva que puede causar infecciones como la neumonía, otitis media y meningitis. Es una causa importante de enfermedad en niños en los países de bajos ingresos y responsable de un estimado de 800.000 muertes de niños menores de cinco años anualmente 1. Los neumococos se realizan con frecuencia en la nasofaringe de los niños pequeños. Aunque esta colonización se considera generalmente asintomática, que precede a la infección neumocócica y sirve como un depósito para las bacterias en las poblaciones humanas 2. La vacunación antineumocócica conjugada reduce efectivamente el transporte de los serotipos contenidos en la vacuna. Sin embargo, existen más de 90 serotipos de neumococo, y la vacunación puede conducir a la sustitución de serotipos, por lo que la eliminación de los serotipos de la vacuna es seguida por un aumento en el transporte y la enfermedad causada por los serotipos no vacunales 3. También, en algunas poblaciones de alto riesgo, el neumococola colonización menudo se produce muy temprano en la vida, antes de la administración de la primera dosis de vacuna de 4,5. Recientemente, el uso de probióticos ha sido propuesto como una estrategia adicional para inhibir la colonización 6,7 neumocócica. In vitro ensayos de adherencia se han utilizado para examinar la adherencia neumocócica 8,9. Estos ensayos han sido adaptados para investigar el impacto del probiótico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) en la adherencia neumocócica 10. Además de LGG y otras bacterias del ácido láctico, Streptococcus salivarius, un residente común de la cavidad oral, se ha investigado como un probiótico potencial para las vías respiratorias debido a su potencial de colonización y la capacidad para inhibir los neumococos y otros patógenos respiratorios in vitro 11 - 13. El protocolo presentado aquí describe un ensayo de adherencia utilizado para investigar los efectos de S. salivarius K12 en la adherencia neumocócicaa la línea celular epitelial humana CCL-23. Antes de su uso en el ensayo, los aislamientos de neumococos se evaluaron para las capacidades de adherencia, ya que el crecimiento y las propiedades de adherencia pueden variar sustancialmente entre los aislados 10,14. Curvas de crecimiento de neumococos y S. salivarius se realizaron para determinar la fase semilogarítmica y la concentración de estimación (unidades formadoras de colonias o CFU / ml) por la densidad óptica (OD, Figura 1). Se recomienda examinar el crecimiento por recuento de viables y la OD para cada aislamiento antes de su uso en el ensayo. Este ensayo se puede realizar en cualquier laboratorio con instalaciones de cultivo de tejidos estándar y los equipos. En este protocolo, los efectos de tres dosis de S. salivarius administrada 1 hora antes de la adición de neumococos en la adherencia de S. pneumoniae PMP843, un serotipo 19F carro aislado derivado de un exudado nasofaríngeo, se examinan. Se presentan dos formas diferentes para cuantificar los neumococos adherente: placas en agar sangre para disuadirmina de recuentos viables, y la extracción de ADN y la detección del gen lytA neumocócica por qPCR 15. El protocolo básico de ensayo de adherencia se puede modificar fácilmente para probar diferentes dosis o tiempo de administración de probióticos y también se puede utilizar con otras cepas o especies bacterianas.

<table><tbody><tr><td>Medios esenciales mínimos (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 Frasco</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Células CCL-23</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologías de Vida de Tripsina</td><td></td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de agar sangre de caballo (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Placas de agar sangre de oveja también aceptables</td></tr><tr><td>Caldo Todd-Hewitt</td><td>Oxoid</td><td>CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubetas desechables</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>La heparina</td><td>de Pfizer</td><td>2112105</td><td>se presenta en ampollas estériles de 5.000 UI/5 m/&nbsp;</td></tr><tr><td>Esparcidor estéril</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternativamente, un esparcidor de vidrio se puede sumergir en etanol al 96% y esterilizar con llama antes de cada uso</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>mutanolisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 20% solución</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAamp DNA mini-kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>LytA F imprimación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Secuencia</td> personalizada <td>de 5' -> 3' ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>LytA R imprimación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Secuencia</td> personalizada <td>de 5' -> 3'&nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>Sonda LytA</td><td>Eurogentec</td><td>Hecho a medida</td> 5<td>' -> 3' secuencia Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, se pueden utilizar fluoróforos alternativos</td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de detección Thermo-Fast 96&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tiras de tapón qPCR ultraclaras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema QPCR Mx3005</td><td>Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>* Las fuentes alternativas están disponibles para la mayoría / todos los productos enumerados</td><td></td><td></td><td>.</td></tr></tbody></table>

la investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica colonización el uso de un<em&gt; in vitro</em&gt; ensayo de adherencia

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

La adherencia de Streptococcus pneumoniae (neumococo) para el revestimiento epitelial de la nasofaringe puede dar lugar a la colonización y se considera un requisito previo para las infecciones neumocócicas tales como la neumonía y la otitis media. In vitro ensayos de adherencia se pueden utilizar para estudiar la unión de los neumococos a células epiteliales monocapas y para investigar las posibles intervenciones, tales como el uso de los probióticos, para inhibir la colonización neumocócica. El protocolo descrito aquí se utiliza para investigar los efectos de la Streptococcus salivarius probiótico en la adherencia de los neumococos a la línea celular epitelial humana CCL-23 (a veces referido como células HEp-2). El ensayo implica tres pasos principales: 1) Preparación de células epiteliales y bacterianas, 2) adición de las bacterias a las monocapas de células epiteliales, y 3) detección de neumococos adherente por recuentos de viables (dilución en serie y chapado) o cuantitativa-PCR en tiempo real (qPCR ). Esta technique es relativamente sencillo y no requiere equipo especializado que no sea una configuración de cultivo de tejidos. El ensayo se puede usar para probar otras especies probióticas y / o inhibidores potenciales de la colonización neumocócica y se puede modificar fácilmente para hacer frente a otras cuestiones científicas con respecto a la adherencia neumocócica y la invasión.

Los resultados de un experimento representativo en el que los neumococos (S. pneumoniae PMP843, un aislado de colonizar 19F) se añadieron a las células CCL-23 1 h después de la adición de S. salivarius, y la adherencia neumocócica se cuantificó por tanto recuento viable y lytA qPCR se muestran en la Tabla 2. Los resultados fueron consistentes entre los dos métodos para tanto el número absoluto de bacterias (presentada como UFC / ml) y la adherencia%, normalizada para el número...

En ensayos in vitro de adherencia se pueden utilizar para estudiar la unión de Streptococcus pneumoniae a monocapas de células epiteliales y para investigar las posibles intervenciones, tales como el uso de los probióticos para la inhibición de la colonización neumocócica.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar la capacidad de una cepa probiótica de Streptococcus salivarius para inhibir la adherencia de neumococos a una línea celular epitelial. Esto se logra primero preparando monocapas de células epiteliales CCL 23. En una placa de 24 pocillos, se añaden sucesivamente S. salivarius y neumococos a la monocapa y luego se incuban las células.En el paso final, se lavan los pocillos para eliminar las bacterias no adherentes. Se lisan las células epiteliales CCL 23 y se recolectan los contenidos de los pocillos. Finalmente, el impacto de salivarius sobre la adherencia neumocócica puede evaluarse cuantificando el número de neumococos asociados a las células.Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas, como si los probióticos pueden inhibir la adherencia de patógenos bacterianos tales como el neumococo. Tuvimos la idea inicial de este método cuando comenzamos a investigar el posible uso de Lactobacillus hypnosis, GG y otros probióticos en el tracto respiratorio. Jane Manning y Zen demostrarán este procedimiento a estudiantes de doctorado de nuestro laboratorio. El día anterior al experimento, siem

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo es un ensayo simple adhesión bacteriana consiste en contar el número de unidades formadoras de colonias bacterianas que se adhieren a las células cultivadas. El ensayo es sólida, independiente de la adhesina estudiados, y numerosas variantes se utilizan en la mayoría de los laboratorios que trabajan en la patogénesis bacteriana.

Ensayo in vitro de la adhesión bacteriana a las células epiteliales de mamíferos

Fuente: Jagau, H. et al. Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la visualización en tiempo real de la unión neumocócica a las cadenas del factor de von Willebrand (VWF) en células endoteliales en condiciones de flujo de medios constantes. Describe los pasos para estimular la liberación de VWF, etiquetar las cuerdas y cuantificar la unión bacteriana.

Evaluación de la unión neumocócica a células endoteliales humanas primarias bajo flujo constante de medios

Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen...

Modelo intestinal in vitro para evaluar la adhesión bacteriana e internalización

El video muestra un ensayo de adherencia en fase sólida para evaluar la formación de biopelículas. En una placa de pocillos múltiples, las bacterias en medios suplementados con sales biliares se adhieren a las superficies sólidas, formando biopelículas, lo que se confirma mediante colorimetría a través de la tinción de violeta cristalino y el tratamiento con etanol.

Un ensayo de adherencia en fase sólida para evaluar la formación de biopelículas

La colonización del nasopharynx murine con pneumoniae del estreptococo y la extracción subsecuente de células adherentes o reclutadas se describe. Esta técnica consiste en enjuagar la nasofaringe y la recolección del líquido a través de las narinas y es adaptable para varias lecturas, incluyendo la cuantificación celular diferencial y el análisis de la expresión de ARNm in situ.

Caracterización De Las Respuestas Inflamatorias Durante La Colonización Intranasal Con Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

La competencia en Streptococcus pneumoniae está mediada por bacteriocinas, pequeños péptidos antimicrobianos con actividad inhibitoria hacia el neumococo y otras especies relacionadas. Aquí describimos un ensayo de superposición bacteriana optimizado que permite la caracterización de la actividad de la bacteriocina y el espectro inhibitorio, la inmunidad específica de la bacteriocina y la detección de péptidos de detección de quórum secretados.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Este estudio detalla el proceso de cantidades precisas de gavaging de probióticos a los ratones neonatales. El montaje experimental se optimizó para incluir pero no se limita a probiótico, la dosis, métodos de administración y cuantificación de bacterias en los intestinos.

Estudios de probióticos en ratones neonatales mediante sonda nasogástrica

La detección de interacciones entre el patógeno bacteriano huésped basada en la adherencia fenotípica utilizando imágenes de etiquetado de fluorescencia de alto rendimiento junto con métodos de análisis estadístico automatizados permite una evaluación rápida de las posibles interacciones bacterianas con las células huésped.

Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped

Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.

Un modelo de ratón para la transición de Streptococcus pneumoniae de colonizador a patógeno tras la coinfección viral recapitula la enfermedad exacerbada por la edad

Este protocolo describe los pasos necesarios para la colonización de ratones con pks+ Escherichia coli en condiciones no inflamatorias, así como métodos no invasivos para la validación de la colonización y evaluación de la expansión de pks+ E. coli en heces.

Colonización con pks+ Escherichia coli de Murina en condiciones no inflamatorias

Aprende a evaluar el efecto inhibidor de Streptococcus salivarius sobre la adherencia de S. pneumoniae en monocapas de células epiteliales CCL 23 mediante ensayos in vitro. Este método permite cuantificar la colonización bacteriana.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un

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