Name: Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos Parhyale hawaiensis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende a ablar células germinales precursoras en embriones de ocho células de Parhyale hawaiensis. Este método manual permite estudiar el desarrollo embrionario y la evolución de crustáceos en el laboratorio.

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Agradecemos Rayhan Arif y Hassaan Shahawy para el trabajo de cámara, Tripti Gupta y Frederike Alwes asistencia refinar la técnica de ablación celular, y los miembros del laboratorio Extavour para la retroalimentación de los datos, video y manuscrito. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el Instituto de Células Madre de Harvard (Seed Grant número SG-0057-10-00) la Ellison Medical Foundation (Nueva Académico Premio número AG-NS-07010-10) a la CGE, y premios del programa de la universidad de Harvard para la Investigación ARN.

Los comentarios que pueden ser de ayuda en la ejecución de ciertas medidas se indican en cursiva. 1. Día 1: Preparación de Materiales <ol><li> Prepare los siguientes materiales (véase la Tabla de Materiales y Equipos): <ul><li> 15 cm y 22 cm pipetas Pasteur </li><li> Escribano Diamond </li><li> filtrada agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 a 0,0020) que contiene 1 mg / ml de anfotericina B (1:100 de una solución madre 100 mg / ml), 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (01:50 de una solución madre que contiene 5.000 unidades / ml de penicilina y 5.000 mg / ml de estreptomicina) </li><li> filtra el agua de mar artificial (salinidad entre 0,0018 hasta 0,0020), sin aditivos </li><li> un gran recipiente de plástico para las parejas de vivienda (al menos 15 cm x 15 cm x 5 cm) </li><li> pequeñas (3 cm o 5 cm) placas de Petri revestidas con Sylgard </li><li> pequeñas (3 cm o 5 cm) placas de Petri </li><li> un vidrio de reloj o de vidrio placa de múltiples pocillos </li><li> fórceps (que usamos fórceps romos derivan from edad Dumont # 5 pinzas que fueron dañados accidentalmente en otros procedimientos de laboratorio, lo que hemos reutilizados mediante el uso de unas pinzas de afilar piedra para asegurar que los extremos de la pinza son suaves, que tanto los dientes tienen la misma longitud, y que ya no tienen puntas afiladas. Pinzas extremadamente finas, como las nuevas Dumont # 5 pinzas, no son deseables, ya que pueden dañar a los embriones y / o mujeres). </li><li> una pipeta Pasteur con el extremo ensanchado (véase el paso 1.2 más abajo) </li><li> una herramienta de recuperación de embriones que consiste de un alambre de tungsteno delgada, curvada encajada en el extremo fino de una pipeta Pasteur (podría ser sustituido por una alternativa implementar; ver 1.3 más abajo) </li><li> una pipeta de boca con una pequeña abertura (véase el paso 1.4 más abajo) </li><li> una aguja de cristal hecha a partir de un capilar de vidrio tirado (véase el paso 1.5) </li></ul> No hay materiales tóxicos para los seres humanos se utilizan en este protocolo. Sin embargo, los investigadores deben asegurarse de que usen guantes o el otro traje de protección como lo requiere la guidel gestión de riesgosines de su institución. </li><li> Para hacer la pipeta Pasteur ampliado, primera puntuación de alrededor de una pipeta Pasteur de 15 cm en el punto donde la pipeta comienza a reducir con una punta trazadora de diamante, envuelva la región de marcado de la pipeta en una toalla de papel Kimwipe o para proteger los dedos, y luego, con cuidado rompa la punta en la línea marcada. Sostenga el extremo roto de la pipeta de una llama de un mechero Bunsen durante varios segundos para suavizar los bordes. La abertura debe ser ligeramente más estrecho que la anchura máxima de la pipeta. </li><li> Para hacer que la herramienta de disección alambre de tungsteno, insertar un alambre de tungsteno en el extremo de un 15 cm pipeta Pasteur de vidrio y mantenga presionado brevemente sobre una llama de mechero Bunsen para fundir el vidrio, la fijación del cable en su lugar. El uso de fórceps a la curva suavemente el extremo del alambre en forma de gancho. Vea la Figura 3 para un ejemplo de una forma apropiada para esta herramienta. </li><li> Para hacer una pequeña abertura para la pipeta de boca, tire del extremo delgado de una pipeta Pasteur 22 cm en dos partes over una llama, y ​​rompa la punta del extremo pequeño. Insertar en el extremo del soporte de pipeta boca. </li><li> Hacer la aguja de vidrio que se utiliza para perforar los blastómeros de interés durante el procedimiento de ablación con un extractor de aguja. Una aguja de forma adecuada se muestra en la Figura 4. Esta aguja se puso una aguja extractora P97 Sutter utilizando un programa con parámetros 2x (calor = 566, tire = 100, velocidad = 20, tiempo = 250) + 1X (calor = 566, tire = 100, velocidad = 100, tiempo = 250). El programa y el instrumento específico usado para hacer que la aguja pueden variar, pero la aguja deben tener una punta fina, sin embargo, también ser lo suficientemente resistente para no romper cuando se empuja contra el corion del embrión. </li></ol> 2. Día 1: Encuentro Parejas Parhyale acoplamiento <ol><li> Use la pipeta Pasteur ampliado (paso 1.2) para recoger el apareamiento P. parejas hawaiensis del recipiente de cultivo grande, y transferirlos a un recipiente que contiene separada cinclinarse agua marina artificial. No es necesario que se va a filtrar esta agua de mar. Es mejor recolectar pares de apareamiento en la tarde por la tarde y salir a las parejas a temperatura ambiente (20-23 º C) durante la noche, para que a la mañana siguiente, la mayoría de los embriones se habrá recientemente fertilizado y depositado, por lo que el escote primeras etapas adecuado para la ablación. Reunir al menos 20 parejas de apareamiento para asegurar que algunas hembras se llevan embriones estadio de división temprana por la mañana siguiente. </li></ol> 3. Día 2: Reunión Parhyale embriones <ul><li> A la mañana siguiente, se filtró infundir agua de mar artificial (FASW) con CO 2. Algunas de las mujeres habrán nadado libres de sus hombres durante la noche; recoger estas mujeres separadas y anestesiar en FASW / CO 2. Los machos no apareados restantes se pueden sacar del contenedor de par de acoplamiento y se devuelven al cultivo grande. Apareamiento de pares restantes se pueden guardar para su posterior recogida de embrionesen el día o el día siguiente. </li><li> Transferir una sola hembra anestesiada llevar los embriones a un vidrio de reloj en FASW / CO 2. Todas las hembras separadas es probable que hayan depositado los huevos, que serán visibles por el ojo como de color rosa pálido o esferoides de color púrpura a través de las placas coxales transparentes de las hembras (Figura 1A). Para determinar si los embriones se encuentran en etapas tempranas de división y por lo tanto adecuado para la ablación de blastómeros, el investigador tendrá que eliminar los embriones de la bolsa de la cría y examinarlas bajo un microscopio. </li><li> Viendo el procedimiento bajo un microscopio de disección, sujete las placas coxales a lo largo de un lado del cuerpo con pinzas. Los embriones serán visibles en la bolsa ventral ventral entre estas placas coxales (fig. 1B). </li><li> Inserte la herramienta de alambre curvado delgado (Figura 3; paso 1.3 anterior) en el extremo posterior de la bolsa de la cría y levante suavemente el cable hacia el extremo anterior de la bolsa de la cría de separar a las críasrevestimientos de bolsa (éstos se modifican los apéndices ventrales llamados oostegites 30), la apertura de la bolsa y el aflojamiento de los embriones. Los embriones que se encuentran dentro de la primera hora o así de ser despedidos están todos encerrados dentro de una membrana muy delgada y transparente que fácilmente se pueden romper mediante la herramienta de alambre; esta membrana desaparece en aproximadamente 2-3 horas después de la puesta de huevos y embriones no están obligados entre sí o con la mujer de cualquier forma desde este punto en adelante toda la embriogénesis. Si los investigadores encuentran incómodo o difícil de maniobrar la herramienta de alambre curvado para eliminar los embriones de la bolsa de la cría, una alternativa implementar se puede utilizar, siempre y cuando los movimientos son suaves y sin presión dura se aplica a los embriones o la bolsa de la cría. Otras herramientas adecuadas para la eliminación de los embriones de la bolsa de la cría incluyen pinzas romas o un capilar de vidrio con un extremo sellado y alisado. </li><li> Utilice una pipeta de 15 cm inalterada Pasteur para eliminar el agua a través de la bolsa de la cría abierta, empujando hacia fuera tque los embriones, que debe depositarse en el fondo del vidrio de reloj. Traslado a la hembra para limpiar FASW (sin CO 2) para permitir la recuperación antes de su reintroducción a la cultura principal. Varias mujeres se pueden colocar en el mismo plato de recuperación, pero permiten que las mujeres se recuperen completamente antes de volver a la cultura principal, ya que pueden ser comidos por otros animales si están todavía parcialmente anestesiados. </li><li> Utilice una pipeta de 15 cm inalterada Pasteur transferir los embriones a una placa de Petri con FASW limpio, y ver bajo el microscopio para determinar su estado embrionario. Embriones separados que están en la tercera división (etapa 4 5), que son adecuados para este procedimiento. También debe ser posible aplicar este protocolo a cualquier estadio de división antes de la formación del disco germinal (etapas 7 a 8 mayo). </li></ul> 4. Día 2: La ablación de células individuales <ol><li> Rellene forradas en Sylgard placa de Petri con una capa superficial de FASW. Utilice un inalterada 15 cm pi Pasteurpipeta para transferir un único embrión a la placa. </li><li> Con unas pinzas romas, ruede suavemente el embrión para identificar la célula para extirpar (Figuras 2A y 2B). La línea germinal precursor g puede ser identificado como el micromere más pequeño, que se encuentra en la parte superior de los más pequeños Mav macrómero. Además, g no entra en contacto directamente la célula es, que es el micromere directamente a través de ella, como los micrómeros precursores mesodermo ml y cuota de mr un borde de la celda en el medio del embrión. Mr es el de blastómeros a la derecha de g, y ml es la micromere a la izquierda de g. Los macrómeros hermanas de mr, ml, y en son los precursores ectodermo Er, El y Ep respectivamente. </li><li> Con unas pinzas en la left mano si el investigador es diestro (o en la mano derecha si el investigador es zurdo), oriente el embrión con la célula de interés hacia la derecha (o hacia la izquierda si el investigador es zurdo), y agarrar suavemente el embrión entre los fórceps para estabilizarlo. </li><li> Usando una aguja tirado de vidrio (paso 1.5 anterior; Figura 4), ​​perfore suavemente la célula de interés. No inserte la aguja demasiado lejos, para no empujar la aguja en las células vecinas o por debajo de la célula de interés. La aguja sólo tiene que perforar el corion y la membrana celular subyacente, y no es necesario para extender profundamente en la célula para ser sometida a ablación. </li><li> Cambie la aguja utilizada para perforar el embrión para el final de cristal de una pipeta de boca con una fina tira de puntas de pipeta Pasteur (paso 1.4). Mantenga la punta de la pipeta cerca del agujero creado en la célula de interés, y aplicar succión muy suave. </li><li> Muy apretar suavemente el embrión con las pinzas. Como el contenido de la Blastomera es empujado fuera del corion por el agujero creado en el paso 4.4, chupan en la pipeta de boca para permitir una vista sin obstáculos del embrión. Si el agujero es lo suficientemente grande, el núcleo de la célula perforado puede ser visto a surgir también. Esta es una buena comprobación para asegurarse de que todo el contenido de la celda se han eliminado y no puede ser regenerada. </li><li> Observe cuidadosamente el embrión como se quita el blastómero de interés. El borde de la celda perforado se retroceder hacia el agujero en el corion, por lo que las intersecciones de las células subyacentes visibles. Continuar aplicando presión hasta que todo el blastómero de interés se ha eliminado. El uso de fórceps para rodar el embrión de un lado a otro y confirmar visualmente que todos los blastómeros de interés se ha ido. </li><li> El uso de un inalterada 15 cm pipeta Pasteur, transferir el embrión para limpiar FASW + (FASW + 1 mg / ml de anfotericina B, 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Levante embriones blastómeros-ablación en pozos individualesde una placa de 48 pocillos limpia en FASW +, el cambio de 50% de FASW antibiótico-complementado + diaria. En nuestras manos embriones sobreviven y se desarrollan bien, incluso después de la ablación, en una gama de temperaturas de 18-28 º C. Los investigadores deben criar a sus embriones a una temperatura para los que tienen una superficie limpia (pero no necesariamente estéril) en el que criar a los embriones con el menor trastorno posible. Para poder comparar el calendario de eventos del desarrollo en embriones de blastómeros mediante ablación con controles, remitimos al lector a la información puesta en escena del desarrollo detallado que está disponible para los embriones planteadas a 18 º C 4, 25 º C 4, y 26 º C 5,6. </li></ol>

<ol><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual+Volume%22%5BJournal%5D)">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.</li>
<li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+insect+embryogenesis%3A+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li>
<li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li>
<li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li>
<li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li>
<li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods%3A+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+B.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li>
<li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%3A+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li>
<li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li>
<li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li>
<li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li>
<li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li>
<li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li>
<li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li>
<li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGARD%3A+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22Database%22%5BJournal%5D)">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li>
<li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cell+lineage%2C+movement%2C+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li>
<li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+germ+line+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li>
<li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li>
<li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li>
<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un protocolo para la ablación manual y eliminación física completa de blastómeros independientes de división etapas tempranas del anfípodo P. hawaiensis. Se demuestra el uso de este protocolo mediante la eliminación de la única línea germinal de células precursoras g de un embrión en su fase de ocho células, y demostrar que la ablación ha sido un éxito, al confirmar la ausencia de células hijas g &#39;s en la embriogénesis después. Este protocolo se puede utilizar p...

El Parhyale hawaiensis crustáceo anfípodo ha surgido en la última década como un organismo modelo prometedor con un gran potencial para su uso en la investigación evolutiva biología del desarrollo 1. Entre los artrópodos, la mayoría de los sistemas de modelos son insectos, y las más estudiadas de ellas es la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. D. melanogaster es un miembro de la orden de insectos Diptera, y, como tal, muestra muchas características embriológicas que se derivan con respecto a los de los insectos basalmente ramificación 2. Por otra parte, los insectos se anidan dentro del suborden Pancrustacea 3, lo que significa que los insectos tienen sus parientes más cercanos en el grupo desde hace mucho tiempo &quot;natural&quot; llamados pancrustaceans, y que este grupo es parafilético. Esto sugiere que además de ramificaciones basales modelos de insectos, se requieren estudios de otros crustáceos de obtener una visión más amplia del historia de la evolución de los rasgos del desarrollo de unamecanismos moleculares nd que han sido tan bien estudiados en D. melanogaster. Sin embargo, son muy pocos los crustáceos han sido bien establecidos para el análisis de laboratorio experimental de desarrollo. El anfípodo P. hawaiensis es un sistema de modelo de laboratorio altamente manejable, susceptible de una serie de técnicas experimentales. Anfípodos muestran muchas características únicas dentro de su superorder padre Peracarida (tolvas de playa, scuds, y camarones así), y por lo tanto se cree que están relativamente derivada dentro de este grupo de crustáceos. Sin embargo, la relativa facilidad de la manipulación genética embriológico y funcional que ofrece Parhyale hacen de este anfípodo una valiosa adición al inventario actual de organismos modelo. Como un animal de laboratorio, P. hawaiensis ofrece muchas ventajas. Los animales son tolerantes a una amplia gama de temperaturas y salinidades, y sobreviven bien en grandes cultivos de agua de mar artificial 1. Es fácil distinguir entrmachos y hembras een basadas en las diferencias morfológicas claras, sobre todo, los grandes en forma de gancho, el tronco, los apéndices anteriores que los machos usan para agarrar a la hembra durante el apareamiento. Para el trabajo y de desarrollo embriológico, P. hawaiensis tiene varias características muy atractivas. La embriogénesis dura aproximadamente 10 días y el tiempo hasta la madurez sexual es de aproximadamente seis semanas a 28 º C (pero tenga en cuenta que Parhyale sobrevive bien a temperaturas que van desde aproximadamente 20 a 30 º C, y que la informacion de puesta en escena de desarrollo está disponible para los embriones planteadas a 18 º C 4 , 25 º C 4, y 26 º C 5,6). Los adultos se aparean durante todo el año en el laboratorio, por lo que los embriones están disponibles en cualquier momento del año. Las hembras ponen 2-20 (dependiendo de la edad de las mujeres) huevos fertilizados en una bolsa de la cría ventral situado entre los primeros pares de patas (Figuras 1A y 1B), y es posible reunir estos embrións muy temprano en el desarrollo sin matar a la hembra o dañar los embriones (Figura 1C). Los embriones sobreviven en agua de mar artificial se filtra a través de la eclosión, se pueden fijar para la expresión génica o posterior análisis histológico 7, y una tabla de ensayo detallado permite la identificación precisa de los avances a través del desarrollo 5. Protocolos robustos se han utilizado para realizar el análisis de la expresión génica mediante hibridación in situ 8-15 o inmunotinción 4,16,17, desmontables funcional mediante ARN de interferencia 13,15 o morfolinos 12, y la línea germinal estable transgénesis 18. Usando el sistema de la transgénesis, la expresión inducible 14 y potenciador trampa 19 métodos también pueden utilizarse para investigar la función de genes en P. hawaiensis. Mientras que una secuencia del genoma a disposición del público no está disponible actualmente, un transcriptoma contiene transcripciones producido durante la ovogénesis y embriogénesis tiene abejan de novo montado y anotado 20, y depositado en una base de datos 21, facilitando el descubrimiento de genes. En suma, P. hawaiensis es un organismo modelo muy manejable adecuada para múltiples enfoques experimentales y genéticos para entender el desarrollo. A diferencia de las primeras divisiones sincitiales de D. melanogaster, P. embriones hawaiensis escinden holoblastically después de la fertilización (Figura 2A). Linaje análisis de rastreo ha demostrado que por tercera división, cada uno de los tercero blastómeros de escisión está destinado específicamente para dar lugar a una de las tres capas germinales o la línea germinal 6 (Figura 2B). Estos datos, junto con los datos de microarrays 22, linaje de células análisis 6,23, y los experimentos de aislamiento blastómeras 4 han sugerido que los potenciales de desarrollo son segregados por lo menos a algunos terceros blastómeras la escisión por la herencia asimétrica de cell determinantes destino. En consecuencia, en los experimentos de ablación de blastómeros en el que se eliminó el precursor de línea germinal (denominado &quot;g&quot; en la Parhyale linaje de células nomenclatura 6) en la etapa de ocho células, embriones carecían de células germinales en las etapas de desarrollo posteriores 4, como se indica por la ausencia de células que expresa la proteína Vasa, que es un marcador de la línea germinal en la mayoría de los metazoos 24. En contraste, los experimentos de ablación de blastómeros somáticas mostraron que P. embriones hawaiensis también poseen capacidades reguladoras importantes, que los destinos de mesodermo o ectodermo blastómeras precursoras ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes de 25. ¿Cómo puede ocurrir la sustitución del destino celular regulativo, y el grado de autonomía de adopción por el destino de las células somáticas blastómeras, sigue siendo desconocido. Técnicas embriológicas experimentales tales como la ablación de blastómeros pueden ser útiles en understanding la autonomía relativa y nonautonomy de las decisiones del destino celular 26,27 y por lo tanto son de interés en el estudio de P. embriogénesis hawaiensis. En los experimentos que demostraron reemplazo regulativa de ectodermo y mesodermo linajes, la ablación de blastómeros se realizó mediante inyección 28 y la posterior excitación de tintes fototóxicas 25. Si bien esta técnica es eficaz en matar el blastómero (s) se inyecta, no elimina completamente el cuerpo de células muertas del embrión. Además, se han observado diferencias entre los datos recogidos a través del linaje de células de las etapas de la embriogénesis gastrulación inyectando blastómeras con trazadores fluorescentes linaje 28,29, y los datos recogidos siguiendo blastómeras no perturbadas por medio del desarrollo de las mismas etapas embrionarias 23. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones. Hemos publicado anteriormente los resultados de los análisis de linaje de células de embriones en los que las células individuales se ablated manualmente 23. Sin embargo, las operaciones delicadas requeridas para eliminar blastómeros individuales a partir de embriones de etapa de escisión primeros aún no se han descrito completamente. Aquí se presenta un protocolo para la recolección de P. embriones hawaiensis y ablación manual de una sola blastómeros de un embrión en su fase de ocho células. El objetivo de este método es para lograr la eliminación completa del cuerpo de la célula del embrión, lo que permite la observación de los comportamientos celulares y competencias destino celular de las células restantes durante la embriogénesis y el desarrollo de post-embrionario. Nuestro protocolo muestra la eliminación del precursor g línea germinal (Figura 2C), pero se puede aplicar a cualquier célula en la fase de ocho células, o para blastómeros de etapas de escisión anteriores. En principio, este protocolo se podría aplicar para eliminar las células individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Other escindir holoblastically invertebrados marinos.

<table><tbody><tr><td>Pipeta Pasteur de 15 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-630 VWR</td><td>Para transferir embriones intactos y blablacionados con blastómeros de una placa a otra.</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de 22 cm</td><td>Wheaton</td><td>53499-632 VWR</td><td>Para la fabricación de puntas de pipeta bucal.</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 3 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>Utilice algunas sin alterar para recolectar y almacenar embriones; cubra algunas con una capa de Sylgard (ver más abajo) para crear una superficie de trabajo para las ablaciones de blastómeros.</td></tr><tr><td>Placas de 48 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>Para el cultivo de embriones después de la ablación.</td></tr><tr><td>Filtros de tapa de botella 0.2 y micro; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>Para la creación de FASW (Ver más abajo).</td></tr><tr><td>Quemador Bunsen</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>Para la creación de herramientas de alambre de tungsteno y pipeta de punta fina de boca.</td></tr><tr><td>Diamond scribe</td><td>Musco Sports Lighting</td><td>52865-005 VWR</td><td>Para crear pipetas Pasteur de boca ancha para parejas de colección.</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10 Fine Science Tools</td><td>Para sujetar a las hembras anestesiadas durante la extracción de embriones de la bolsa de cría. No es necesario que sean pinzas Dumont de punta fina: las puntas pueden ser al menos tan romas como las de las pinzas para las que se indica aquí el número de catálogo.</td></tr><tr><td>Fungizone-Anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich Añadir</td><td>a FASW hasta una concentración final de 1 mg/ml, y utilizar esta solución para cultivar embriones blablacionados con blastómeros.</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de 4 pulgadas de largo, 1/0.58 OD/ID (mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4 World Precision Instruments</td><td>Para hacer agujas para perforar el blastómero que se va a ablacionar.</td></tr><tr><td>Vidrio de vidrio de 300 mm de diámetro</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>70543-30 Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>Para su uso en la extracción de embriones de la bolsa de cría de hembras anestesiadas.</td></tr><tr><td>Instant Ocean Agua de mar artificial (ASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems Produce</td><td>ASW disolviendo sal en agua desionizada a una salinidad de 1.022-1.024.</td></tr><tr><td>Agua de mar artificial filtrada por el océano instantánea (FASW)</td><td>Instant Ocean</td><td>IS160 Aquatic EcoSystems</td><td>Uso 0.2 &micro; m filtros para esterilizar ASW. Encomponer en pequeñas cantidades (< 250 ml) según sea necesario.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>Para romper de forma segura el extremo fino de las pipetas Pasteur modificadas para la recolección de parejas.</td></tr><tr><td>Adaptador de pipeta bucal</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>Inserte la punta de la pipeta Pasteur de extracción fina en este extremo, que se utilizará para eliminar el contenido de las células extruidas durante el procedimiento de ablación.</td></tr><tr><td>Tubo de pipeta bucal</td><td>Aldrich Z280356</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Córtelo para que sea lo suficientemente largo como para colgarlo cómodamente alrededor de su cuello durante el procedimiento de ablación.</td></tr><tr><td>Extractor de agujas</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P97 Sutter Instrument Company</td><td>Para fabricar agujas a partir de capilares de vidrio para perforar el blastómero que se va a ablacionar.</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>Añadir a FASW hasta una concentración final de 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina, y utilizar esta solución para cultivar embriones ablacionados con blastómeros.</td></tr><tr><td>Bombilla de goma</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>100488-418 VWR</td><td>Para el uso de pipetas Pasteur para transferir embriones de una placa a otra.</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>K. R. Anderson, Inc.</td><td>NC9659604 Fisher Scientific Make</td><td>, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Vierta una capa de 2-5 mm de espesor en una placa de Petri de 3 cm para crear una superficie de trabajo para las ablaciones de blastómeros.</td></tr><tr><td>Alambre de tungsteno de 0,004 pulgadas de diámetro</td><td>A-M Systems</td><td>719000 A-M Systems</td><td>Utilícelo para hacer una herramienta para extraer embriones de la bolsa de cría de las hembras anestesiadas.</td></tr></tbody></table>

ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un pequeño crustáceo que se encuentra en los hábitats marinos intermareales de todo el mundo. Durante la última década, Parhyale ha convertido en un organismo modelo prometedor para los estudios de laboratorio de desarrollo, proporcionando una comparación exogrupo útil al organismo bien estudiado modelo artrópodo Drosophila melanogaster. En contraste con las divisiones sincitiales de Drosophila, las primeras divisiones de Parhyale son holoblástica. Suerte de cartografía utilizando colorantes trazadores inyectados en primeros blastómeros han demostrado que las tres capas germinales y la línea germinal se establecen por la etapa de ocho células. En esta etapa, tres blastómeras están destinados a dar lugar a el ectodermo, tres están destinados a dar lugar al mesodermo, y los dos restantes blastómeros son los precursores de la línea de endodermo y el germen respectivamente. Sin embargo, los experimentos de ablación de blastómeros han demostrado que los embriones Parhyale también poseen capabiliti reglamentaria significativaes, de tal manera que el destino de los blastómeros ablación en la fase de ocho células pueden ser asumidas por los descendientes de algunos de los blastómeros restantes. La ablación de blastómeros ha sido previamente descrito por uno de dos métodos: la inyección y la posterior activación de colorantes fototóxicas o ablación manual. Sin embargo, fotoablación mata blastómeros, pero no elimina el cuerpo de células muertas del embrión. Eliminación física completa de blastómeros específicos puede por lo tanto ser un método preferido de la ablación para algunas aplicaciones. Aquí se presenta un protocolo para la extracción manual de blastómeros independientes, desde la fase de ocho células de embriones Parhyale, ilustrando los instrumentos y procedimientos manuales necesarias para la eliminación completa del cuerpo de la célula, manteniendo las restantes blastómeros vivo e intacto. Este protocolo se puede aplicar a cualquier célula Parhyale en la fase de ocho células, o para blastómeros de otras etapas de escisión temprana. Además, en principio, este protocolo podría ser aplicable a CLEA tempranaVåge embriones de otros invertebrados marinos holoblastically escisión.

Después de la ablación con éxito del single tercera hendidura P. micrómeros hawaiensis como se describe en este protocolo, los micrómeros restantes cambian gradualmente sus posiciones ligeramente con el fin de ocupar parcialmente el espacio anteriormente ocupado por la ablación de blastómeros. Por ejemplo, cuando se elimina g, la vecina blastómeras MR y ML cambiar ligeramente y llegar a compartir los bordes de las celdas laterales que antes estaban en contacto directo ...

El hawaiensis anfípodo Parhyale es un organismo modelo prometedor para los estudios de embriología y desarrollo de artrópodos crustáceos comparativa y evolución. Este protocolo describe un método para la extracción manual de blastómeros individuales a partir de embriones en estadio de división primeros de Parhyale.

Ablación de una sola célula de ocho células de embriones de los crustáceos anfípodos<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Esta demostración muestra la técnica para eliminar la célula precursora de la línea germinal de embriones tempranos dentro de la vaina. Crustacean parli sys parli es un organismo modelo emergente con un amplio potencial para su uso en investigaciones evolutivas y del desarrollo. La mayoría de los artrópodos modelo son insectos, y el más estudiado entre ellos es la mosca de la fruta Glip Melanogaster. Los insectos están incluidos dentro del subfilo Panc cresta, y el estudio de otros crustáceos fuera del grupo de los insectos proporciona una visión más amplia de la historia evolutiva de los rasgos del desarrollo y de los mecanismos moleculares que han sido ampliamente estudiados en Drosophila.Sin embargo, muy pocos crustáceos se han establecido adecuadamente para el análisis experimental de desarrollo en el laboratorio. Parelli es un sistema modelo de laboratorio altamente manejable y, por lo tanto, representa un valioso añadido al inventario de organismos modelo. Como animal de laboratorio, parli es muy fácil de mantener y de manipular.Puede sobrevivir bien en cultivos grandes de agua de mar artificial, y es fácil distinguir entre machos y hembras basándose en claras diferencias morfológicas. Más notablemente, los grandes apéndices anteriores curvados que los machos utilizan para agarrar a las hembras durante el apareamiento para trabajos de desarrollo. Parelli tiene varias características muy atractivas, las parejas se aparean durante todo el año, por lo que es posible recolectar embriones en cualquier momento.Las hembras depositan embriones en la bolsa de cría ubicada entre los primeros pares de patas, y es posible recolectar los embriones muy temprano en su desarrollo sin matar a la hembra ni dañar los embriones. Los embriones sobreviven en agua de mar artificial filtrada hasta la eclosión, y existe una tabla detallada de estadios que permite identificar con precisión el progreso del desarrollo. Aquí se muestra una selección de estadios del desarrollo de parál hasta la eclosión, desde el estadio de ocho células del desarrollo.Cada una de las células en el embrión paral se asigna específicamente a una de las tres capas germinales o a las células germinales primordiales. Es la especificación de la población de células germinales lo que resulta de particular interés en esta demostración. Se sabe que la célula denominada G para línea germinal es el precursor único de la línea germinal en la linaje parli; experimentos de trazado de linaje muestran que los descendientes de G se convierten en todas las células germinales y que ninguno de sus descendientes forma parte de ninguna otra capa germinal.Además, se han realizado experimentos eliminando la célula G del embrión sin dañar el resto de las células. En estos experimentos, los embriones a los que se les eliminó la célula G carecieron de células germinales durante el resto de la embriogénesis, como lo indica la ausencia de células que expresan la proteína vasa, un marcador de la línea germinal en organismos modelo a lo largo de los metazoos. A continuación, demostraremos cómo obtener embriones parli y ablacionar manualmente la célula G de un embrión de ocho células.Este video demuestra la eliminación de G, pero puede aplicarse a cualquier célula en la etapa de ocho células. Para esta parte del procedimiento, necesitaremos una pipeta Pasteur con el extremo ensanchado, una segunda pipeta Pasteur sin modificar, agua de mar artificial filtrada, un recipiente grande para alojar parejas, placas de Petri pequeñas, una placa de pozo de vidrio, pinzas y una herramienta de disección compuesta por un alambre delgado y curvo en el extremo de una Pasteur. No se utilizan guantes para pipeta en esta demostración, pero recuerde agregar equipos de protección según las normas de gestión de riesgos de su institución. Para fabricar la pipeta Pasteur ensanchada, primero haga una muesca alrededor de la pipeta con un bolígrafo de diamante y luego rompa cuidadosamente la punta.Sostenga sobre una llama durante varios segundos para suavizar los bordes. La abertura debe ser ligeramente más estrecha que el ancho máximo de la pipeta. Para fabricar la herramienta de disección de alambre, inserte un alambre de tungsteno en el extremo de una pipeta de vidrio y sostenga sobre una llama para fundir el vidrio.Sujete el alambre en su lugar y use pinzas para curvar suavemente el extremo del alambre, facilitando así su manipulación con la herramienta. El extremo con gancho debe tener una longitud ligeramente superior a medio centímetro. Recolecte las parejas utilizando la pipeta de pasteur ensanchada y transfiéralas a un recipiente separado con agua de mar artificial.Deje las parejas a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, infunda agua de mar artificial filtrada con dióxido de carbono. Recolecte las hembras separadas y anestésielas en este agua.Transfiera una hembra individual a una placa de pozo de vidrio en agua de mar artificial filtrada con dióxido de carbono observando bajo un microscopio estereoscópico; sujete las placas coxales a un lado del cuerpo con pinzas. Los embriones son visibles en la bolsa de cría. Introduzca la herramienta de disección de alambre en el extremo posterior de la bolsa de cría y levante suavemente el alambre hacia el extremo anterior para separar la cubierta de la bolsa, abriendo así la bolsa y exponiendo los embriones.Utilice una pipeta de Pasteur para hacer pasar agua a través de la bolsa marsupial abierta, expulsando así los embriones. Transfiera la hembra a agua de mar artificial filtrada sin dióxido de carbono para permitir su recuperación antes de reintroducirla al cultivo principal.Transfiera los embriones a una placa de Petri con agua de mar artificial filtrada y obsérvelos bajo el microscopio para determinar su estadio. Dado que a menudo es difícil determinar el estadio de los embriones antes de retirarlos de la hembra, normalmente es necesario recolectar embriones de muchas hembras para obtener suficientes embriones del estadio correcto. A menudo, la forma más sencilla de obtener embriones de ocho células es recolectar embriones de estadios anteriores y esperar a que maduren hasta el estadio adecuado.Además de los embriones que ya hemos recolectado para el procedimiento de ablación, necesitaremos una pipeta de pastoreo, pinzas, agua de mar artificial filtrada, una placa de Petri con una capa de cigarro, una aguja hecha de una capilar de vidrio estirado, una pipeta de boca con una abertura pequeña, placas de Petri limpias y agua de mar artificial filtrada con anfotericina y penicilina-estreptomicina para la punta de la pipeta de boca. Pase una pipeta de punta larga sobre una llama para estirarla y rompa la punta del extremo pequeño, que se insertará en el extremo de la pipeta de boca. Esta punta tiene el tamaño perfecto para el procedimiento.La aguja de vidrio, que se utilizará para perforar G durante el procedimiento de ablación, debe tener una punta fina, pero lo suficientemente resistente como para no romperse al presionarla contra el corion. Aquí se muestra una forma común utilizada en nuestro laboratorio. Para la ablación, primero debemos identificar cuál célula es G; el embrión de la izquierda muestra a G delineado en negro, y en la siguiente sección aprenderemos cómo distinguir a G de los otros microespejos.El embrión de la derecha muestra lo que debería esperarse como resultado de una ablación exitosa. En este embrión, G ha sido ablacionado, como indica el círculo negro, y solo quedan tres micrómeros utilizando pinzas. Gire suavemente el embrión para observar y comparar las células.G puede identificarse como el micrómero más pequeño situado encima del macrómero más pequeño; MAV puede identificarse como el macrómero más pequeño al rodar el embrión. Además, G no toca la célula EN, que es el micrómero opuesto al mismo. Dado que las células el y er comparten un límite entre G y EN en este embrión, podemos observar que el micrómero más pequeño se encuentra a la izquierda y que no está en contacto con el micrómero que tiene enfrente.Al girar el embrión, podemos confirmar que este microespejo está situado sobre el macroespejo más pequeño. Ahora ubicado en la parte inferior izquierda del embrión, podemos denominarlo con seguridad G y pasar a la ablación. En resumen.Para este procedimiento, estabilizaremos el embrión con pinzas mientras perforamos G con la aguja de vidrio estirada. Luego aplicaremos una ligera presión sobre el embrión con las pinzas, haciendo que el contenido de G salga del embrión a través del orificio que realizamos. Utilizamos la pipeta de boca para retirar el contenido de G después de que este haya salido del embrión, con el fin de poder observar cuándo G ha sido completamente eliminado.Ahora, para detallar este procedimiento, llene la placa protectora de seda con una capa superficial de agua de mar artificial filtrada. Transfiera un embrión de ocho células a la placa utilizando una pipeta Pasteur con pinzas. Con la mano izquierda, oriente el embrión con G hacia la derecha y sostenga suavemente el embrión para estabilizarlo usando una aguja de vidrio estirada, punzando suavemente G, sin insertar demasiado la aguja para evitar empujarla hacia los macromiradores situados debajo de G. Cambie la aguja en su mano derecha por una pipeta de succión bucal que tenga una punta de pipeta Pasteur estirada.Mantenga la punta de la pipeta cerca del orificio en G y aplique una succión muy suave. Presione suavemente el embrión con la pinza mientras el contenido de G es expulsado del corion. Aspire el contenido hacia la pipeta de boca para permitir una vista despejada del embrión.Observe cuidadosamente el embrión. A medida que se elimina G, el borde de G retrocederá hacia el orificio en la coriona, haciendo visible la intersección de las células subyacentes. Continúe aplicando presión hasta que todo G haya sido eliminado y use la pinza para girar el embrión y confirmar visualmente que todo G ha desaparecido.Utilizando una pipeta Pasteur, transfiera el embrión al agua de mar artificial filtrada más anfotericina y penicilina-estreptomicina. Cambie la mitad del agua del embrión diariamente para prevenir infecciones. Aquí se muestra un embrión antes y después de la ablación.Como puede observarse, hay un espacio vacío donde antes estaba G. Cuando se realiza con delicadeza y cuando los embriones reciben buenos cuidados después del procedimiento, un alto porcentaje sobrevive hasta la eclosión. En nuestro laboratorio, la tasa media de supervivencia es ligeramente superior al 50 %

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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