Name: Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Aprende a medir coeficientes de difusión de proteínas de membrana plasmática etiquetadas con EGFP en células vivas mediante espectroscopia de correlación de imagen en espacio-k. Este método permite estudiar la dinámica de proteínas de membrana en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de Lundbeck Jefe de Grupo Junior de LNN. PWW reconoce el apoyo financiero donación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC). También agradecemos a la Molecular Bioimaging Centro Danés de la Universidad del Sur de Dinamarca para el acceso a girar microscopía disco.

Adquisición de proteínas EGFP-etiquetados en la membrana de plasma para el análisis de CCI se puede hacer en un microscopio de epifluorescencia, una configuración de TIRF o en un microscopio de disco giratorio fijado para adquirir imágenes de la membrana de interés. El tamaño de los píxeles de la cámara, así como el tiempo entre cuadros de imagen es necesaria para el análisis. Las secuencias de imágenes de 100-1,200 fotogramas a una velocidad de 4-30 Hz se pueden utilizar para el análisis. Durante la adquisición, es importante para mantener la membrana en el foco a lo largo de la duración de la formación de imágenes y centrarse en una fracción de la membrana plana en la que la fluorescencia se distribuye de manera uniforme. Mover vesículas, que sobresale regiones de membrana y orgánulos celulares se pueden recortar más tarde en el proceso de análisis. El tiempo de adquisición debe ser elegido de modo que no hay deriva o el movimiento de la célula. Para obtener las secuencias de comandos de código de las CCI para MATLAB, póngase en contacto con Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). La primera vez que el código de las CCI se utiliza, MAT abiertaLAB y haga clic en archivo, la ruta a continuación, establecer, a continuación, haga clic en añadir a las subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código CCI. Haga clic en Aceptar, guardar y cerrar. Ahora hay que continuar con el análisis de los cultivos que se describen en los siguientes puntos. 1. Importe la secuencia de imágenes de interés en un programa de análisis de imagen como TIFF Stack Guarde el archivo con el nombre: stack1.tif. <ol><li> Seleccione una región rectangular de interés (ROI) en la parte plana de la membrana de exclusión de orgánulos celulares móviles y sobresaliendo regiones de membrana. El tamaño de la cosecha se seleccionará de forma que suficientes estadísticas se generan para el bien k 2 parcelas. </li><li> Recortar la región y salvar el cultivo como un archivo TIFF en una carpeta adecuada. Si hay varios cultivos de la misma película, use un incremento de número, por ejemplo, &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Coloque la carpeta que contiene los cultivos a nivel localen el equipo, no en el servidor, mientras que hace un análisis de las CCI. </li></ol> 2. Importe los Cultivos en el software de análisis de uno en uno para realizar el análisis de <ol><li> Abrir MATLAB y tipo &quot;icsgui&quot; en la ventana de comandos y presione ENTRAR. ICS GUI es el nombre del ejecutable para el programa de interfaz gráfica de usuario de la espectroscopia de correlación de imágenes. </li><li> En la interfaz gráfica de usuario de ICS, haga clic en la pestaña &quot;CCI&quot;. Una captura de pantalla de la ventana de análisis se muestra en la Figura 1. </li><li> Encuentre la carpeta con el nombre de la carpeta &quot;código MATLAB&quot; y desplácese hasta el archivo con el nombre de archivo &quot;Scripts&quot; y abra esta haciendo doble clic en él. Alternativamente, haga clic derecho en el archivo y seleccione &quot;abrir con MATLAB&quot; o ir a un archivo, se abre en MATLAB y abra el archivo scripts. Este archivo se llama Editor. </li><li> En el libro del editor de «CCI Cargar conjuntos de datos&quot; y, a continuación, copie o nombre de archivo tipo y ubicación de la carpeta en la línea de comandos que comienzacon img = por ejemplo, &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. En la línea de comandos debajo de la ubicación de la carpeta ajustar el número de fotogramas que se van a analizar - por ejemplo, [1:500]. Utilice los mismos ajustes para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Si hay desviación foco en cuadros posteriores, éstos deben ser excluidos del análisis. </li><li> En el editor, haga clic en &quot;Guardar&quot; y luego haga clic en &quot;evaluar la celda&quot;. El conjunto de datos ya está cargado en en el software de análisis. </li><li> En la ventana de Análisis de las CCI en los GUI, introduzca los valores para el análisis: <ol><li> Desmarca casillas &quot;células T&quot;. </li><li> Introduzca el número de retardos a analizar. El número de retardos de tiempo (τ) tendrá efecto en la trama de difusión y debe ser elegido de modo que la trama de difusión es lineal. Comience con la participación en el 25 y después disminuir hasta donde la trama de difusión es lineal. τ es el número de desfases el análisis compara las CCI y un lapso de tiempo es el tiempo de bntre una trama y la siguiente. El valor más pequeño que da una representación lineal debe ser seleccionado. El número máximo de retrasos de tiempo se elige de manera que se obtiene un ajuste lineal, la elección de un valor más alto producirá datos que no pueden ser línea ajustada. </li><li> Introduzca el valor máximo k 2 (ver Círculo 1 de la figura 1), por lo general es de 20-50. Un buen k 2 parcela es un trazado en el que hay muchos puntos de datos que se distribuyen a lo largo de una línea. Comience con la participación en el 70 y luego disminuir después de haber evaluado los k 2 y difusión parcelas y seleccione el valor más bajo en el que el grupo de puntos de datos en torno a una línea recta. El valor de k 2 es la magnitud al cuadrado de la k-vector espacial en el espacio de Fourier. Inicialmente, el análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores, a continuación, utilizar la misma configuración para todas las películas consecutivas en la serie de datos, pero siempre asegúrese de que los ajustes seleccionados dan un buen ajuste a los datos: bien k 2 parcelasy una trama de difusión lineal. </li><li> Haga clic en &quot;Configuración de las tiendas y proceder&quot;. </li><li> Haz clic en &quot;Sí&quot; para mostrar todos los gráficos. </li><li> Haga clic en &quot;imagen de la serie de carga&quot; (véase el círculo 2 de la Figura 1), a continuación, haga clic en &quot;espacio de trabajo&quot;. </li><li> Seleccione &quot;imgSerCrop&quot;, a continuación, haga clic en &quot;Importar de espacio de trabajo&quot;. </li><li> Introduzca los valores de recogida de sistema de imágenes. En el &quot;tamaño del píxel&quot; cuadro de introducir el tamaño del pixel proyectado para el sistema de imágenes en la que las pilas de imágenes son adquiridas. Para AQP3-EGFP, se utilizó 0.111. En el cuadro &quot;Especifique el tiempo (s) entre bastidores&quot;, 0.1150 se utilizó para AQP3-EGFP. </li><li> Haga clic en &quot;seleccionar ROI&quot;, introduzca &quot;1&quot;, haga clic en Aceptar y &quot;utilizar toda la imagen&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;análisis Do CCI&quot; y haga clic en Sí para hacer &quot;filtrado inmóvil&quot;. Resultados se abrirán automáticamente como imágenes. </li><li> Minimizar la ventana de ajustes, minimizar la información de célula window, y minimizar la ventana fotofísica. En la ventana de la dinámica, compruebe que la trama dinámica muestra un ajuste lineal de los datos a una línea con una pendiente negativa lo que significa que los puntos de datos se correlacionan y difusión libre se puede suponer. Registre el coeficiente de difusión para el lapso de tiempo específico y k 2 ajustes (no es necesario tener en cuenta la desviación estándar del ajuste). Los puntos de datos en los k 2 parcelas deben ser agrupados en torno a la línea para el momento dado se queda. </li><li> Marque la casilla &quot;Guardar figuras abiertas como imágenes&quot;, a continuación, haga clic en &quot;Guardar figuras abiertas como imágenes&quot; para guardar los archivos de resultado. Guarda en una nueva carpeta en C: Users Documentos AQP3diffusion. Haga clic en &quot;claro de datos actual&quot; y continuar con el análisis de la próxima cosecha. </li></ol></li></ol> 3. Promedio del Coeficiente de Difusión Calculado está calculado para obtener una visión general de los datos analizados <ol><li> Introduzca los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en un spreadsheet (asegúrese de tomar nota de la τ y k 2 valores), utilice los nombres de los cultivos establecidos anteriormente. </li><li> Calcule el promedio de coeficiente de difusión y la desviación estándar utilizando un programa de hoja de cálculo. </li><li> Realice una prueba de Kolmogorov-Smirnov o estudiantes t-test para evaluar diferencias estadísticas con un nivel de significación del 5%. Comparaciones Quantitave entre las células (por ejemplo, tratados vs no tratado) se pueden hacer. </li><li> Abra la versión de hoja de cálculo de las parcelas de difusión que se generan por el software de análisis para cada cultivo, y un promedio de los datos de cada estado para cada intervalo de tiempo. Generar una nueva trama de difusión promedio de presentación de documentos o las presentaciones. </li></ol>

<ol><li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-Space+image+correlation+spectroscopy%3A+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+Applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li>
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<li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li>
<li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li>
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<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En este trabajo se presenta una descripción detallada paso a paso de cómo aplicar el método de análisis de las CCI para determinar los coeficientes de difusión de imágenes de microscopía de proteínas marcadas con proteínas fluorescentes. El análisis es independiente de la elección de la sonda con un muy amplio rango dinámico en la densidad de etiquetado y puede por lo tanto también se puede aplicar a proteínas marcadas con puntos cuánticos, así como colorantes y proteínas fluorescentes tales como EGFP. <p class="jov...

La organización espacio-temporal de cuatro dimensiones y la movilidad lateral de proteínas de membrana de plasma están fuertemente regulados y pueden desempeñar un papel en la función de la proteína, la actividad y de las interacciones proteína-proteína. Difusión lateral de las proteínas de la membrana plasmática, que tradicionalmente se ha estudiado mediante el cálculo de los coeficientes de difusión de las partículas individuales de time-lapse de punto cuántico o teñir las proteínas de membrana plasmática etiquetados 2-4. Este enfoque requiere la inserción de una etiqueta extracelular en la proteína de la membrana de plasma de punto cuántico o tinte de etiquetado, lo que puede comprometer plegado y función de las proteínas y, por tanto, no pueden ser alcanzados para algunas proteínas. El volumen estérico de un punto cuántico se ha demostrado que reducir la velocidad de difusión de la proteína 5 y por otra parte, sólo una pequeña fracción de las proteínas de la población está marcada con puntos cuánticos, y no se sabe si esta fracción es representativa para el total grupo de proteínas de la membrana de plasma. Tra de partículas individualescking (SPT) mediciones de los coeficientes de difusión de imagen de serie de proteínas marcadas puntos cuánticos implica el mapeo de las posiciones de los picos fotografiados de las partículas con dos gaussiana bidimensional encaja seguido de algoritmos de análisis extensos. El análisis es computacionalmente muy intensivo, que requiere extensa de curva no lineal apropiado en cada cuadro de imagen de una secuencia de lapso de tiempo a las aproximaciones de la función de dispersión de punto microscopio (típicamente de dos dimensiones gaussianas espacial) y la posterior unión de las posiciones de partículas en trayectorias de las partículas que describe el movimiento de las moléculas individuales 6,7. Una técnica de correlación de imágenes recientemente desarrollada, k-espacio Correlación Imagen Espectroscopía (CCI) permite mediciones sencillas relativas de los coeficientes de difusión de los etiquetados con fluorescencia proteínas de la membrana de plasma. La posibilidad de calcular de forma rutinaria coeficientes de difusión de las proteínas de membrana marcadas con proteínas fluorescentes por las CCI es una herramienta única que mantienevarias ventajas sobre cuántica tradicional salpican análisis SPT: No se requiere la inserción de etiquetas y tiempo extracelulares que consumen etiquetado extracelular (líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes se pueden utilizar); los coeficientes de difusión se extraen de la piscina total de proteínas fluorescentes en comparación con un subconjunto marcado con puntos cuánticos; análisis es simple sin la necesidad de realizar un seguimiento de las proteínas individuales y el análisis se puede realizar utilizando un código existente con ningún requisito para la programación de usuario adicional. El método es rápido, ya que es una técnica de promedio que permite el cálculo rápido y cálculo de los coeficientes de difusión. Estas mediciones de difusión rápida para la población de proteínas se complementan la información de transporte molecular más detallada obtenida de un subconjunto de la población por los métodos SPT esmerados. tiempo CCI correlaciona secuencias de imágenes de microscopía de fluorescencia que primero han sido transformadas para el espacio de Fourier, y por lo tanto separa flfluctuaciones uorescencia debido a fotofísica de las debidas al transporte molecular 1. Como resultado, las CCI pueden determinar la densidad del número, la velocidad de flujo, y la difusión de moléculas, mientras que la etiqueta fluorescente ser imparcial por fotoblanqueo complejo o parpadeo de los fluoróforos. Esto hace que las CCI una herramienta útil para determinar rápidamente la dinámica de difusión de proteínas de membrana de células con fluorescencia marcado con y sin la necesidad de algoritmos de escritura personalizados. Además de las proteínas marcadas fluorescentemente, CCI también se pueden aplicar a proteínas de membrana de punto marcado cuánticos 8. Este documento ofrece una introducción paso a paso de cómo utilizar las CCI para extraer los coeficientes de difusión de las proteínas de la membrana plasmática de etiquetado EGFP mediante la demostración de cómo colocar la cosecha, cómo utilizar el código y cómo evaluar las parcelas generadas, de las cuales la difusión coeficientes se extraen. A modo de ejemplo, los datos obtenidos por hilado conjunto de discos-microscopía en semi-reflexión interna total fluorescenciaModo nce (TIRF), de un canal de agua renal de proteínas acuaporina-3 (AQP3) etiquetados con EGFP se presenta.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp; region=DK">13752</a></td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Medio libre de rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp; region=DK">D8418 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Aparato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disco giratorio</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Cámara</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

fácil medición de difusión coeficientes de etiquetado-egfp plasma proteínas de la membrana usando k-espacio correlación imagen spectroscopy

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Difusión lateral y la compartimentación de proteínas de la membrana de plasma están fuertemente regulados en las células y, por tanto, el estudio de estos procesos se revelan nuevas perspectivas al plasma la función de proteínas de membrana y la regulación. Recientemente, k-espacio de correlación de imágenes de espectroscopia (CCI) 1 fue desarrollado para permitir mediciones de rutina de los coeficientes de difusión directa a partir de imágenes de proteínas de la membrana plasmática marcados con fluorescencia, que evitaron sesgos sistemáticos introducidos por fotofísica sonda. Aunque la base teórica para el análisis es complejo, el método puede ser implementado por los no expertos utilizando un código libremente disponibles para medir los coeficientes de difusión de las proteínas. CCI calcula una función de correlación de tiempo a partir de una imagen Pila microscopía de fluorescencia después de la transformación de Fourier de cada imagen para recíproca (k-) el espacio. Posteriormente, promediado circular, logaritmo natural transformada lineal y se ajusta a la función de correlación se obtiene el coeficiente de difusión. Estedocumento proporciona una guía paso a paso para el análisis de imágenes y la medición de los coeficientes de difusión a través de las CCI. En primer lugar, una secuencia de imágenes de alta velocidad de fotogramas de una proteína de membrana plasmática marcada con fluorescencia se adquiere mediante un microscopio de fluorescencia. Entonces, se selecciona una región de interés (ROI) evitando orgánulos intracelulares, vesículas en movimiento o que sobresale regiones de membrana. La pila de retorno de la inversión se importa en un código de libre acceso y varios parámetros definidos (véase la sección Método) se establecen para el análisis de las CCI. Entonces, el programa genera una &quot;pendiente de las laderas&quot; complot de las funciones de correlación de tiempo k-espacio, y el coeficiente de difusión se calcula a partir de la pendiente de la parcela. A continuación se muestra un procedimiento paso a paso las CCI para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana utilizando el renal canal de agua acuaporina-3 etiquetados con EGFP como un ejemplo canónico.

Para adquirir pilas de imágenes adecuadas para ser analizadas con las CCI, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopio. Es posible analizar secuencias de imágenes de un microscopio de epi-fluorescencia, así como una configuración de disco TIRF o girando. La membrana debe ser plana sin grandes orgánulos celulares móviles o en movimiento vesículas / objetos. En este trabajo se presenta una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de AQP3 etiquetados con EGFP en células MDCK en vivo fotografiados en un microscopi...

Este documento proporciona una guía paso a paso a la técnica de análisis de fluctuación de imagen k-espacio espectroscopia de correlación (CCI) para la medición de los coeficientes de difusión de la etiqueta fluorescente proteínas de la membrana plasmática en células de mamíferos vivos.

Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los coeficientes de difusión de proteínas de membrana en células vivas. Esto se logra primero cultivando células que expresan la proteína marcada con GFP, y luego adquiriendo una secuencia de imágenes con intervalos de tiempo en un microscopio de disco giratorio con el enfoque ajustado a la membrana plasmática. El segundo paso consiste en seleccionar un recorte en la serie de imágenes en el que la membrana esté plana y no haya orgánulos en movimiento.A continuación, se analiza el recorte mediante software de espectroscopía de correlación de imágenes basado en casos. El paso final consiste en promediar las gráficas de difusión en Excel. En definitiva, se utiliza la microscopía de células vivas combinada con kicks para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica de membranas, como determinar los coeficientes de difusión de las proteínas de membrana bajo diferentes condiciones. La primera vez que se utilice el código kicks, abra MATLAB y haga clic en archivo. Luego, establezca la ruta, haga clic en agregar con subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código kicks.Haga clic en aceptar. Antes de guardar y cerrar MATLAB durante la adquisición, es importante mantener la membrana enfocada durante toda la duración de la imagen. Seleccione una región rectangular de interés o ROI en la parte plana de la membrana donde la fluorescencia esté distribuida de manera uniforme.Excluya los orgánulos celulares en movimiento y las regiones de membrana protruyentes. El tamaño del recorte se elige de modo que se generen suficientes estadísticas para obtener buenas gráficas de K al cuadrado. Recorte la región y guarde el recorte como un archivo tiff.Guarde el archivo en una carpeta adecuada. Si hay varios recortes del mismo video, utilice un incremento numérico, por ejemplo, pila un recorte, do tiff, pila uno, recorte dos, tif, etcétera. Para realizar el análisis, primero abra MatLab y escriba ICS gooey en la ventana de comandos y presione enter ICS.GUI es el nombre ejecutable del programa de interfaz gráfica de usuario de espectroscopía de correlación de imágenes en ICS Gooey. Haga clic en la pestaña kicks. Busque la carpeta con el nombre de carpeta, código MATLAB.Desplácese hasta el archivo con el nombre de archivo scripts y ábralo haciendo doble clic en él. Este archivo se llama editor. En.El editor.Desplácese para cargar los conjuntos de datos de kicks. Luego copie o escriba el nombre del archivo y la ubicación de la carpeta en la línea de comandos. En la línea de comandos, a continuación de la ubicación de la carpeta.Establezca el número de cuadros que se analizarán. Utilice la misma configuración para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Si hay desviación de enfoque en cuadros posteriores.Estos deben excluirse del análisis en el editor. Haga clic en guardar y luego en evaluar. El conjunto de datos ahora está cargado en el software de análisis, en la ventana de análisis de kicks de la interfaz gráfica de usuario (gui).Introduzca la configuración para el análisis desactivando primero las casillas de linfocitos T. Luego, introduzca el número de retraso temporal que se analizará. Introduzca el valor máximo de K al cuadrado.Suele estar inicialmente entre 20 y 50. El análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores, y luego la configuración debe utilizarse para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Verifique siempre que la configuración seleccionada proporcione un buen ajuste para los datos, evidenciado por gráficos de cuadrados de caso adecuados y un gráfico de difusión lineal.A continuación, haga clic en configuración de almacenamiento y continúe. Luego haga clic en sí para mostrar todos los gráficos. Haga clic en cargar serie de imágenes y después en espacio de trabajo.Seleccione el recorte de la serie de imágenes antes de hacer clic en importar desde el área de trabajo. Ahora ingrese en el cuadro de tamaño de píxel los parámetros de adquisición del sistema de imagen. Introduzca el tamaño de píxel proyectado para el sistema de imagen con el que se adquirieron las pilas de imágenes.Haga clic para seleccionar las ROI e introduzca una. Luego haga clic en aceptar y utilice toda la imagen. Haga clic en realizar análisis de kicks y haga clic en sí para aplicar el filtrado de inmovilidad.Los resultados se abrirán automáticamente como imágenes. Minimice la ventana de configuración, minimice la ventana de información celular y minimice la ventana de fotofísica en la ventana de dinámica. Verifique que el gráfico de dinámica muestre un ajuste lineal de los datos que se alinee con una pendiente negativa, lo que indica que los puntos de datos están correlacionados y se puede asumir una difusión libre.Registre el coeficiente de difusión para el intervalo de tiempo específico y los ajustes de K al cuadrado. Los puntos de datos en las gráficas de K al cuadrado deben agruparse alrededor de la línea correspondiente al tiempo dado. Active la casilla de verificación de intervalos de tiempo, guarde las figuras abiertas como imágenes y luego haga clic en guardar figuras abiertas como imágenes para almacenar los archivos de resultados.Guarde en una nueva carpeta y luego haga clic en borrar los datos actuales y continúe con el análisis del siguiente cultivo. Utilizando los nombres de los cultivos establecidos previamente, ingrese los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en una hoja de cálculo y asegúrese de anotar el número de retrasos temporales y los valores de K al cuadrado. Calcule el coeficiente de difusión promedio y la desviación estándar utilizando un programa de hojas de cálculo.Realice una prueba MOV Smirnoff o una prueba t de Student para evaluar las diferencias estadísticas. Utilizando un nivel de significancia del 5 %, se pueden realizar comparaciones cuantitativas entre células. La versión de hoja de cálculo de las gráficas de difusión, que fue generada por el software de análisis para cada cultivo, y promedie los datos para cada condición y cada intervalo de tiempo.Genere un nuevo gráfico promedio de difusión para presentarlo en artículos o conferencias. Los resultados presentados aquí son una secuencia de imágenes lapse de tiempo de la acuaporina tres marcada con EGFP. En células MDCK vivas, que son células epiteliales renales, capturadas en un microscopio de disco giratorio con el enfoque ajustado a la membrana plasmática.Se muestra aquí una imagen de la célula con ejemplos de recortes de ROI resaltados en rectángulos para la selección de los recortes. Es importante realizar el recorte en la periferia de la célula, donde la membrana es uniforme y plana, para que solo se visualice una difusión bidimensional. Deben evitarse orgánulos celulares, vesículas y proyecciones de la membrana, y es fundamental para el análisis que no haya deriva durante el lapso de tiempo.Este cultivo representativo fue excluido del análisis y de kicks, ya que hay vesículas en movimiento, que pueden contribuir al coeficiente de difusión. Aquí se muestra otro ejemplo de un cultivo excluido en el que hay un orificio en la membrana. Se presenta aquí la gráfica de difusión de un cultivo generada con kicks.Este método puede utilizarse para hallar el coeficiente de difusión de una proteína marcada con una proteína fluorescente, un colorante o puntos cuánticos. La pendiente de la curva en el gráfico de difusión es simplemente la negativa del coeficiente de difusión; aquí se muestra el gráfico de difusión calculado para la acuaporina tres marcada con EGFP, que presenta demasiados intervalos de tiempo. En este caso, se repitió el análisis, pero con menos intervalos de tiempo, de modo que el gráfico de difusión resulte lineal.A continuación se presenta un gráfico cuadrado de caso típico. Esta es la curva de correlación promediada radialmente y transformada logarítmicamente para un intervalo de tiempo seleccionado a partir de estos gráficos K cuadrado. La pendiente se representa en función de los intervalos de tiempo, y el resultado es el gráfico de difusión mostrado previamente.Al inspeccionar las gráficas de K cuadrado, es importante que el ajuste se evalúe a partir de esta gráfica de K cuadrado. Se puede concluir que el tamaño de la muestra es demasiado pequeño y no pudo analizarse adecuadamente, ya que debería tener una pendiente negativa y decaer linealmente hasta un nivel de ruido de fondo. Esta gráfica de K cuadrado necesita volverse a analizar con un valor máximo de K cuadrado reducido, dado que el ajuste ya no es adecuado, según lo indica el aumento de los residuos a valores más altos de K cuadrado.En este caso, el análisis debe repetirse ingresando un valor máximo más bajo de K al cuadrado. Aquí se muestra un gráfico de difusión promediado sobre 10 recortes. El gráfico de difusión se encontró en el archivo de Excel proveniente del análisis y a partir de él.El coeficiente de difusión de AQUAPORIN tres EGFP se calcula siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como medir el coeficiente de difusión de proteínas de membrana tras la adición de diferentes fármacos, con el fin de responder preguntas adicionales, como los cambios en el coeficiente de difusión tras el tratamiento con fármacos, y si es probable que existan cambios en los entornos lipídicos y/o en las interacciones proteína-proteína en la membrana.

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Investigación

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Biología

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Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy (Video) | JoVE Journal

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