Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

El objetivo general de este procedimiento es medir los coeficientes de difusión de proteínas de membrana en células vivas. Esto se logra primero cultivando células que expresan la proteína marcada con GFP, y luego adquiriendo una secuencia de imágenes con intervalos de tiempo en un microscopio de disco giratorio con el enfoque ajustado a la membrana plasmática. El segundo paso consiste en seleccionar un recorte en la serie de imágenes en el que la membrana esté plana y no haya orgánulos en movimiento.

A continuación, se analiza el recorte mediante software de espectroscopía de correlación de imágenes basado en casos. El paso final consiste en promediar las gráficas de difusión en Excel. En definitiva, se utiliza la microscopía de células vivas combinada con kicks para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biofísica de membranas, como determinar los coeficientes de difusión de las proteínas de membrana bajo diferentes condiciones. La primera vez que se utilice el código kicks, abra MATLAB y haga clic en archivo. Luego, establezca la ruta, haga clic en agregar con subcarpetas y busque la carpeta en la computadora en la que se encuentra el código kicks.

Haga clic en aceptar. Antes de guardar y cerrar MATLAB durante la adquisición, es importante mantener la membrana enfocada durante toda la duración de la imagen. Seleccione una región rectangular de interés o ROI en la parte plana de la membrana donde la fluorescencia esté distribuida de manera uniforme.

Excluya los orgánulos celulares en movimiento y las regiones de membrana protruyentes. El tamaño del recorte se elige de modo que se generen suficientes estadísticas para obtener buenas gráficas de K al cuadrado. Recorte la región y guarde el recorte como un archivo tiff.

Guarde el archivo en una carpeta adecuada. Si hay varios recortes del mismo video, utilice un incremento numérico, por ejemplo, pila un recorte, do tiff, pila uno, recorte dos, tif, etcétera. Para realizar el análisis, primero abra MatLab y escriba ICS gooey en la ventana de comandos y presione enter ICS.

GUI es el nombre ejecutable del programa de interfaz gráfica de usuario de espectroscopía de correlación de imágenes en ICS Gooey. Haga clic en la pestaña kicks. Busque la carpeta con el nombre de carpeta, código MATLAB.

Desplácese hasta el archivo con el nombre de archivo scripts y ábralo haciendo doble clic en él. Este archivo se llama editor. En.El editor.

Desplácese para cargar los conjuntos de datos de kicks. Luego copie o escriba el nombre del archivo y la ubicación de la carpeta en la línea de comandos. En la línea de comandos, a continuación de la ubicación de la carpeta.

Establezca el número de cuadros que se analizarán. Utilice la misma configuración para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Si hay desviación de enfoque en cuadros posteriores.

Estos deben excluirse del análisis en el editor. Haga clic en guardar y luego en evaluar. El conjunto de datos ahora está cargado en el software de análisis, en la ventana de análisis de kicks de la interfaz gráfica de usuario (gui).

Introduzca la configuración para el análisis desactivando primero las casillas de linfocitos T. Luego, introduzca el número de retraso temporal que se analizará. Introduzca el valor máximo de K al cuadrado.

Suele estar inicialmente entre 20 y 50. El análisis debe repetirse hasta que se determinen los mejores valores, y luego la configuración debe utilizarse para todas las películas consecutivas en la serie de datos. Verifique siempre que la configuración seleccionada proporcione un buen ajuste para los datos, evidenciado por gráficos de cuadrados de caso adecuados y un gráfico de difusión lineal.

A continuación, haga clic en configuración de almacenamiento y continúe. Luego haga clic en sí para mostrar todos los gráficos. Haga clic en cargar serie de imágenes y después en espacio de trabajo.

Seleccione el recorte de la serie de imágenes antes de hacer clic en importar desde el área de trabajo. Ahora ingrese en el cuadro de tamaño de píxel los parámetros de adquisición del sistema de imagen. Introduzca el tamaño de píxel proyectado para el sistema de imagen con el que se adquirieron las pilas de imágenes.

Haga clic para seleccionar las ROI e introduzca una. Luego haga clic en aceptar y utilice toda la imagen. Haga clic en realizar análisis de kicks y haga clic en sí para aplicar el filtrado de inmovilidad.

Los resultados se abrirán automáticamente como imágenes. Minimice la ventana de configuración, minimice la ventana de información celular y minimice la ventana de fotofísica en la ventana de dinámica. Verifique que el gráfico de dinámica muestre un ajuste lineal de los datos que se alinee con una pendiente negativa, lo que indica que los puntos de datos están correlacionados y se puede asumir una difusión libre.

Registre el coeficiente de difusión para el intervalo de tiempo específico y los ajustes de K al cuadrado. Los puntos de datos en las gráficas de K al cuadrado deben agruparse alrededor de la línea correspondiente al tiempo dado. Active la casilla de verificación de intervalos de tiempo, guarde las figuras abiertas como imágenes y luego haga clic en guardar figuras abiertas como imágenes para almacenar los archivos de resultados.

Guarde en una nueva carpeta y luego haga clic en borrar los datos actuales y continúe con el análisis del siguiente cultivo. Utilizando los nombres de los cultivos establecidos previamente, ingrese los coeficientes de difusión individuales de cada ROI en una hoja de cálculo y asegúrese de anotar el número de retrasos temporales y los valores de K al cuadrado. Calcule el coeficiente de difusión promedio y la desviación estándar utilizando un programa de hojas de cálculo.

Realice una prueba MOV Smirnoff o una prueba t de Student para evaluar las diferencias estadísticas. Utilizando un nivel de significancia del 5 %, se pueden realizar comparaciones cuantitativas entre células. La versión de hoja de cálculo de las gráficas de difusión, que fue generada por el software de análisis para cada cultivo, y promedie los datos para cada condición y cada intervalo de tiempo.

Genere un nuevo gráfico promedio de difusión para presentarlo en artículos o conferencias. Los resultados presentados aquí son una secuencia de imágenes lapse de tiempo de la acuaporina tres marcada con EGFP. En células MDCK vivas, que son células epiteliales renales, capturadas en un microscopio de disco giratorio con el enfoque ajustado a la membrana plasmática.

Se muestra aquí una imagen de la célula con ejemplos de recortes de ROI resaltados en rectángulos para la selección de los recortes. Es importante realizar el recorte en la periferia de la célula, donde la membrana es uniforme y plana, para que solo se visualice una difusión bidimensional. Deben evitarse orgánulos celulares, vesículas y proyecciones de la membrana, y es fundamental para el análisis que no haya deriva durante el lapso de tiempo.

Este cultivo representativo fue excluido del análisis y de kicks, ya que hay vesículas en movimiento, que pueden contribuir al coeficiente de difusión. Aquí se muestra otro ejemplo de un cultivo excluido en el que hay un orificio en la membrana. Se presenta aquí la gráfica de difusión de un cultivo generada con kicks.

Este método puede utilizarse para hallar el coeficiente de difusión de una proteína marcada con una proteína fluorescente, un colorante o puntos cuánticos. La pendiente de la curva en el gráfico de difusión es simplemente la negativa del coeficiente de difusión; aquí se muestra el gráfico de difusión calculado para la acuaporina tres marcada con EGFP, que presenta demasiados intervalos de tiempo. En este caso, se repitió el análisis, pero con menos intervalos de tiempo, de modo que el gráfico de difusión resulte lineal.

A continuación se presenta un gráfico cuadrado de caso típico. Esta es la curva de correlación promediada radialmente y transformada logarítmicamente para un intervalo de tiempo seleccionado a partir de estos gráficos K cuadrado. La pendiente se representa en función de los intervalos de tiempo, y el resultado es el gráfico de difusión mostrado previamente.

Al inspeccionar las gráficas de K cuadrado, es importante que el ajuste se evalúe a partir de esta gráfica de K cuadrado. Se puede concluir que el tamaño de la muestra es demasiado pequeño y no pudo analizarse adecuadamente, ya que debería tener una pendiente negativa y decaer linealmente hasta un nivel de ruido de fondo. Esta gráfica de K cuadrado necesita volverse a analizar con un valor máximo de K cuadrado reducido, dado que el ajuste ya no es adecuado, según lo indica el aumento de los residuos a valores más altos de K cuadrado.

En este caso, el análisis debe repetirse ingresando un valor máximo más bajo de K al cuadrado. Aquí se muestra un gráfico de difusión promediado sobre 10 recortes. El gráfico de difusión se encontró en el archivo de Excel proveniente del análisis y a partir de él.

El coeficiente de difusión de AQUAPORIN tres EGFP se calcula siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como medir el coeficiente de difusión de proteínas de membrana tras la adición de diferentes fármacos, con el fin de responder preguntas adicionales, como los cambios en el coeficiente de difusión tras el tratamiento con fármacos, y si es probable que existan cambios en los entornos lipídicos y/o en las interacciones proteína-proteína en la membrana.