Shock Wave aplicación a los cultivos celulares

El objetivo general de este procedimiento es evitar efectos físicos distractores durante el tratamiento in vitro con ondas de choque, con el fin de obtener resultados reproducibles. Esto se logra primero llenando completamente un frasco de cultivo celular con medio de cultivo, y luego colocando el frasco en un baño de agua calentado. El segundo paso consiste en utilizar una cantidad generosa de gel de ultrasonido al acoplar el aplicador al baño de agua.

A continuación, el aplicador se coloca de forma horizontal contra la membrana del baño de agua. El paso final consiste en asegurar que la fuente de ondas de choque esté alineada con el centro del frasco de cultivo celular, para que las células queden posicionadas dentro del foco de la onda. Finalmente, se puede realizar el análisis de sus células, como por ejemplo mediante PCR en tiempo real y una matriz de citoquinas, para mostrar una alteración en los genes y citoquinas de interés.

Tuvimos por primera vez la idea de este modelo cuando observamos que los métodos existentes de aplicación de ondas cortas directamente a cultivos celulares no consideran el efecto de la reflexión de ondas en la transición entre el medio de cultivo y el aire ambiente. El procedimiento será demostrado por la Dra. Chante, estudiante de doctorado de mi grupo de investigación. Para comenzar, caliente 3,5 litros de agua del grifo hasta 37 grados Celsius.

Luego, transfiera el agua caliente al baño de agua. El nivel de agua debe estar tres centímetros por debajo del borde superior del baño de agua y debe cubrir completamente la membrana. A continuación, conecte el sensor de temperatura a una fuente de alimentación y coloque el sensor de temperatura en el orificio situado en la pared trasera del baño de agua.

Luego, mientras se agita el agua, conecte continuamente el calentador a una fuente de alimentación y caliente el agua hasta alcanzar una temperatura estable de 37 grados Celsius. En condiciones estériles, siembre las células en frascos de cultivo T 25.

Por lo tanto, alcanzarán 90 % de confluencia tras la incubación nocturna. Luego coloque los frascos verticalmente y llénelos con medio de cultivo hasta la base del cuello del frasco para evitar contaminación. No permita que el medio entre en contacto con el cuello del frasco ni con la tapa de cierre.

A continuación, cierre los matraces con una tapa sólida sin filtro para evitar la contaminación por el agua del baño. Luego, selle las tapas con paraformaldehído. Una vez que los matraces estén sellados, sujételos a un soporte con pinzas.

Luego, inserte los frascos fijos en el baño de agua y alinee el centro del frasco de cultivo celular con el centro de la membrana del aplicador de ondas de choque. Aplique una cantidad generosa de gel de transmisión de ultrasonido sobre el aplicador de ondas de choque y la membrana del baño de agua. A continuación, conecte el aplicador a la membrana y asegúrese de que no haya burbujas de aire entre ellos.

A continuación, sostenga el aplicador de ondas de choque en el centro de la membrana y asegúrese de que esté alineado horizontal y verticalmente con el frasco de cultivo celular para garantizar el tratamiento de toda el área de crecimiento celular. Luego, realice un experimento piloto para determinar la distancia ideal entre el aplicador de ondas de choque y el frasco de cultivo, así como para definir los parámetros correctos de tratamiento. Asegúrese de mantener el frasco de cultivo y el aplicador en una posición estable durante la activación del dispositivo de ondas de choque.

Una vez determinada la distancia ideal, realice el experimento bajo los parámetros deseados de tratamiento con ondas de choque. Tras completar el tratamiento con ondas de choque, retire el frasco de cultivo celular del baño de agua, séquelo con toallas de papel y desinfecte la superficie externa del frasco. A continuación, transfiera el medio del frasco a un tubo de centrífuga.

Centrifugar las células bajo parámetros normales de centrifugación. Suspender el sedimento celular en dos mililitros de medio de cultivo celular, luego transferir la suspensión celular de vuelta al frasco que contiene cinco mililitros de medio de cultivo celular, y cultivar las células hasta alcanzar la confluencia requerida para los experimentos de análisis celular. El análisis de PCR en tiempo real de células endoteliales de vena umbilical humana reveló una regulación positiva en los niveles de ARNm de tie dos tras el tratamiento con ondas de choque.

Esto sugiere que el tratamiento con ondas de choque aumenta la proliferación de células endoteliales y la angiogénesis. Los niveles de citocinas en la vena umbilical se cuantificaron mediante un arreglo de citocinas.

Se encontró también que las dos citoquinas inflamatorias IL-6 e IL-8 aumentaron significativamente, ambas implicadas en la inflamación que acompaña al proceso angiogénico tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que numerosos investigadores en el campo de la ciencia básica de las ondas de choque exploraran sus efectos sobre un solo tipo celular en experimentos in vitro. Esperamos convencer a aún más investigadores de utilizar este modelo con el fin de obtener resultados reproducibles y comparables en la ciencia de las ondas de choque.