Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

La microscopía TimeLapse permite una visualización de los procesos de desarrollo, crecimiento o deriva de la muestra que se produce sobre esta imagen. La adquisición puede resultar en una incapacidad para seguir o rastrear los movimientos de la célula, el siguiente protocolo. Utilizamos software de procesamiento de imágenes de código abierto para corregir la deriva tridimensional a lo largo del tiempo.

La captura de una serie de secciones ópticas en diferentes planos focales permite la generación de un modelo tridimensional de la muestra. Esto se puede extender a cuatro dimensiones mediante la creación de una serie de intervalos de tiempo de conjuntos de datos 3D. En los experimentos de lapso de tiempo a largo plazo, es común observar el movimiento de la muestra.

Esto puede ser causado por precisiones de deslizamiento en la etapa de control del hardware y las posiciones focales, mientras que en otros casos derivan como resultado de los movimientos inducidos por el crecimiento de la muestra o la flexibilidad dentro del medio de montaje, existen métodos para compensar y limitar estos movimientos con muchas mejoras en los sistemas de enfoque del hardware y la mayor rigidez del medio de montaje. Sin embargo, estos enfoques no se pueden aplicar en muchos casos debido a la configuración de imágenes necesaria para proporcionar las condiciones adecuadas para el mantenimiento y el crecimiento de las muestras para corregir. Para la deriva de muestras, hemos desarrollado un complemento para utilizar la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto de Fiji.

Nuestro plugin de deriva 3D correcto es capaz de formar un registro de correlación de fase para corregir el movimiento que se produce como una función o deriva de muestra en experimentos tridimensionales de lapso de tiempo en experimentos multicanal. El plugin de deriva 3D correcto utiliza un canal para determinar la corrección requerida. A continuación, esta corrección se aplica a cualquier canal adicional que dé lugar al registro del conjunto de datos The four D.

El paquete web gratuito de código abierto. Fiji es una bifurcación de distribución, el programa Image J, que contiene complementos preinstalados para realizar numerosos procesos con datos recopilados de experimentos de microscopía. Fiji proporciona una arquitectura de complementos más sencilla e incluye la instalación predeterminada.

Una copia de los tres EG correctos plugin, que usaremos para este análisis cuando se complete la instalación Open Fiji. Fiji admite la importación de una amplia gama de formatos de imágenes de microscopía patentados. Esto se puede lograr a través de arrastrar y soltar o a través de los usuarios, el entorno de microscopía abierta.

Plugin de importación de formatos biográficos. Si el conjunto de datos supera el tamaño de la memoria instalada en el sistema, abra el archivo de imagen como una pila virtual y con una opción de gestión de memoria. El conjunto de datos que utilizaremos en este análisis se generó a partir de un experimento de series temporales tridimensionales del ACTA uno, el pez cebra transgénico GFP en el que la GFP se expresa en el músculo esquelético.

Para visualizar los núcleos, a esta línea transgénica se le inyectó el núcleo localizador M cereza para representar mejor estos pisos de Fluor, podemos alterar las tablas de búsqueda para cada uno de estos canales bajo la herramienta de canal de color. En el transcurso de la serie de tiempo recopilada, parece que la muestra de pez cremallera se desplazó en el campo de visión. Ella corrigió esta deriva abrió el complemento de deriva 3D correcto en el submenú de registro de los complementos instalados en Fiji.

Los marcadores de vendedor que se expresan ampliamente dentro de una muestra o que no están involucrados en los eventos de comercialización durante la adquisición de imágenes proporcionan la mejor fuente para la corrección de la deriva. En este ejemplo, el ACTA uno, fluorescencia GFP en el canal uno. Si la memoria es limitada en su sistema, seleccione la opción de pila virtual y permita que se ejecute el complemento Correct 3D drift.

El conjunto de datos corregido tendrá un tamaño de lienzo más grande en comparación con el original. Acomodar el movimiento de la muestra. La generación de imágenes de proyección máxima de las secciones ópticas permite realizar la comparación de la deriva que se ha eliminado de la muestra corregida.

La proyección de intensidad máxima elimina la dimensión del conjunto de datos, pero como un enfoque útil para examinar rápidamente los resultados de la corrección de deriva. Aquí vemos las imágenes de proyección máximas para cada punto de enlace en sus conjuntos de datos corregidos y no corregidos. Cuando este experimento de lapso de tiempo se proyecta como una sola imagen, la cantidad de deriva que puede ocurrir incluso en un experimento de lapso de tiempo corto es evidente.

Las correcciones realizadas mediante el registro de la deriva de un canal de la muestra también se aplican a todos los demás canales contenidos en esta pila de imágenes. El procedimiento para la corrección de la deriva si la memoria es limitada en su sistema se altera ligeramente. Seleccione la opción La pila virtual utilizada tanto en el formato de compra, el menú de importación como en el menú emergente del complemento de deriva 3D correcto.

Al seleccionar esta opción, se te pedirá que selecciones una ubicación en la que un plugin pueda exportar archivos de imagen individuales para cada segmento de canal y punto de tiempo de tu experimento de lapso de tiempo. La pila virtual generada contiene la misma corrección de desviación que nuestro ejemplo anterior. Si abrimos la ubicación de guardado seleccionada, veremos los archivos de secuencia de imágenes individuales resultantes Generados.

Para abrir esta colección de archivos, utilice la herramienta de importación de secuencias de imágenes. El archivo resultante no separará canales, secciones ópticas ni puntos de tiempo. Para visualizar estas características, convierta la pila en una hiperpila utilizando los datos del archivo de registro, ingrese el número de canales, los cortes ópticos y los puntos de enlace recopilados en el, Podemos nuevamente modificar las tablas de búsqueda para ajustar el color que se muestra de nuestro experimento de lapso de tiempo.

Este protocolo corrige la desviación que se produce entre puntos de tiempo, la desviación que se produce dentro de la captura de un solo punto de tiempo no puede ser corregida por este protocolo. Recomendamos que los parámetros utilizados para la adquisición de imágenes reduzcan el tiempo necesario para capturar cada punto de tiempo. La capacidad de corregir la deriva en el software de posprocesamiento permite analizar y medir los movimientos de las células que, de otro modo, serían habilidades por la deriva de la muestra.