Name: Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-12T22:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprende a corregir la deriva tridimensional en microscopía time-lapse 4D utilizando el software de código abierto Fiji. Este método mejora el seguimiento preciso de movimientos celulares en estudios de desarrollo biológico.

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Nos gustaría dar las gracias a Gaby Martins y los organizadores del taller EMBO2010 3D Developmental Imaging donde comenzó este trabajo y todos los colaboradores de los proyectos de Fiyi y ImageJ.

1. 4D Time-lapse experimentos de imagen La configuración utilizada para la adquisición de la imagen serán diferentes dependiendo del equipo utilizado. La capacidad de la microscopía confocal para la sección ópticamente una muestra depende de un número de factores: la longitud de onda de excitación, el tamaño del agujero de alfiler, la apertura numérica del objetivo, el índice de refracción de la muestra y el medio en el que se incrusta la muestra. El tamaño del agujero de alfiler de la confocal seleccionado determinará el espesor de la sección óptica recogido. Un agujero de alfiler más pequeño producirá una sección óptica más delgada aumento de la resolución del eje z, pero reduciendo la cantidad de luz capturada. Un agujero de alfiler grande aumentará el espesor de la sección óptica, la reducción de la resolución del eje z, pero el aumento de la cantidad de luz capturada. Otros factores a tener en cuenta durante la recolección de datos 4D anteriores a la corrección incluyen: <ol><li> Optimizar la velocidad de exploración para eliminar o limitar la deriva durante la captura de un solo punto de tiempo. Por lo tanto el tiempo necesario para la colección de la imagen debe ser una pequeña fracción del intervalo entre los puntos de tiempo. </li><li> Perfectamente estructuras de repetición, o rejillas, no son adecuados como estructuras para el registro, ya que no es posible determinar la corrección requerida. Perlas distribuidas aleatoriamente o estructuras desiguales permitirán registro inequívoco. </li><li> Si se espera que la deriva, aumentar el área de escaneado y los límites superior e inferior de enfoque con el fin de asegurar que el área de interés se mantiene dentro de la pila de imágenes. </li><li> Además de asegurar que hay una resolución espacial adecuada para resolver las estructuras de interés, establecer la frecuencia de muestreo para proporcionar resolución temporal de los eventos dinámicos que se están estudiando. Nota: Por consiguiente, el tiempo entre la imagen los puntos de tiempo debe ser por lo menos la mitad del intervalo de tiempo entre los eventos que se repiten regularmente y reducir los eventos irregulares. </li></ol> 2. Abrir la Confocal Dataset El paquete de código abierto Fiji es una distribución del programa ImageJ, que contiene los plug-ins instalados previamente para realizar numerosos procesos en los datos obtenidos a partir de experimentos de microscopía. El software proporciona fácil actualización arquitectura plug-in e incluye una copia del plug-in de deriva 3D correcta utilizado para este protocolo. El software es compatible con la importación de una amplia gama de formatos de imágenes de microscopía de propiedad a través del uso del Open Microscopía Medio Ambiente Bio-Formatos de importación plug-in. <ol><li> Instale el programa de Fiji (http://fiji.sc/Downloads). </li><li> Cargue el conjunto de datos adquiridos mediante el Importador Plugin LOCI Bio-Formats. </li><li> Si el conjunto de datos es mayor que la memoria asignada al programa, seleccione la opción &quot;Usar la opción de pila virtual&quot; dentro de la sección de gestión de memoria. </li></ol> 3. Corrección de la deriva de un objeto 3D en el procesamiento posterior Durante el transcurso de un lapso de tiempo prolongadoexperimentar una muestra puede moverse incluso cuando incrustado. Para corregir cualquier movimiento y permitir que los eventos de migración fotografiados a analizar, el procesamiento posterior de las imágenes se puede realizar. Todo el procesamiento posterior de las imágenes debe estar claramente descrito en la metodología de cualquier análisis derivado de este trabajo. <ol><li> Una vez que el conjunto de datos se ha cargado, ejecute la correcta plugin de deriva 3D. </li><li> Si hay varios canales de imagen, seleccione el canal que se utilizará para registrar las imágenes. Esto debería representar idealmente una estructura estática dentro de la muestra en lugar de los elementos migratorias o móviles. Sin embargo, si esto no es posible el canal con el menor movimiento debe ser elegido. </li><li> Si la memoria RAM disponible en el sistema utilizado para este análisis es inferior a dos veces el tamaño del conjunto de datos original, seleccione la opción pila virtual uso. Esto almacenará la HyperStack registrada como una secuencia de imágenes, en lugar de guardar el archivo en la memoria RAM. <ol><li> Seleccione una carpeta para el plug-in a individuo salida corregida imaarchivos Ges. Un archivo de imagen independiente se creará para cada canal en cada posición de z. </li></ol></li><li> El plugin luego realizar un análisis de correlación de fase por pares entre cada punto de tiempo para determinar la corrección requerida, que se aplica a la base de datos. </li></ol>

<ol><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for Microscopy.</a> BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the+IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Kuglin, C. D., Hines, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+correlation+image+alignment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE%2C+International+Conference+on+Cybernetics+and+Society%22%5BJournal%5D)">The phase correlation image alignment method.</a> Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+VIs.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.</a> J VIs. Exp. (36), (2010).</li>
<li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+extrusion+from+the+epidermis+of+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).</li>
<li>Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Nguyen-Chi, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Cell+Fate+Determination+within+the+Adaxial+Cell+Equivalence+Group+of+the+Zebrafish+Myotome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome.</a> PLoS Genetics. 8 (10), (2012).</li>
<li>Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Myoblast+city+homologues+Dock1+and+Dock5+and+the+adaptor+proteins+Crk+and+Crk-like+in+zebrafish+myoblast+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion.</a> Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).</li>
<li>Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+generation+of+transgenic+zebrafish+which+reliably+express+GFP+in+whole+muscles+or+the+whole+body+by+using+promoters+of+zebrafish+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin.</a> Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Nuestra capacidad de utilizar el software de post-procesamiento para corregir la deriva de la muestra de los conjuntos de datos derivados de experimentos de microscopía de lapso de tiempo prolongados está restringida por una serie de factores. La capacidad de discernir la deriva frente a movimiento migratorio de una muestra depende de los marcadores celulares utilizados. Marcadores celulares que se expresan ampliamente, ya sea dentro de una muestra o no participan en eventos migratorias durante la adquisición de imágene...

De formación de imágenes confocal es ampliamente utilizado en biología celular y del desarrollo de seguir los movimientos celulares y cambios en la morfología. La captura de una serie de secciones ópticas en diferentes planos focales permite la generación de un modelo tridimensional (3D) de una muestra, que luego se puede extender en cuatro-dimensiones (4D) mediante la creación de una serie de lapso de tiempo de conjuntos de datos 3D. La generación de bases de datos 4D permite la medición detallada de los movimientos celulares y comportamientos. En experimentos con lapso de tiempo a largo plazo, es común observar el movimiento de la muestra. Esto puede ser causado por ligeras imprecisiones en el control de la etapa de hardware y posiciones focales. Mientras que en otros casos, la deriva es un resultado de los movimientos inducidos por el crecimiento de la muestra o la flexibilidad dentro de los medios de montaje de la muestra. Existen métodos para compensar o limitar estos movimientos incluyendo mejoras en sistemas de enfoque de hardware y aumento de la rigidez del medio de montaje. Sin embargo, estos enfoques no pueden aplicarse en muchos casos debido a la s de formación de imágenesuesta obligada a proporcionar las condiciones adecuadas para el mantenimiento y crecimiento de las muestras. Soluciones de software de código abierto no existir para la corrección de movimiento en 2D con el tiempo, a través del uso de las StackReg y TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins en ImageJ o Fiji, pero éstos no pueden ser aplicado a conjuntos de datos 4D. Para corregir la deriva de la muestra se ha desarrollado un plug-in (deriva 3D correcta) para utilizar la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto, Fiji 1. Nuestro plug-in es capaz de realizar el registro de correlación de fase para corregir el movimiento que se produce como resultado de la deriva de la muestra en los experimentos de lapso de tiempo de tres dimensiones. Fase 6 de correlación es un método eficiente de cálculo para determinar la traducción entre imágenes. El plug-in se describe aquí utiliza la biblioteca fase de correlación desarrollada por Preibisch et al. 7. En experimentos de varios canales, el plug-in utiliza un canal a determine la corrección requerida. Esta corrección se aplica entonces a los canales adicionales resultantes en el registro de la base de datos 4D. En el sistema modelo de pez cebra es posible llevar a cabo de imagen de lapso de tiempo durante un período de muchas horas, o incluso varios días 8. Un método común para el montaje del pez cebra es la de insertar el embrión vivo anestesiado en agarosa de bajo punto de fusión (0,8-1,5%), lo que restringe su movimiento 9-11. Mientras que el movimiento se restringe el crecimiento de la muestra aún se produce, lo que resulta en las células dentro del campo de visión posición de cambio. Con el fin de seguir el movimiento de las células en el embrión es necesario para corregir primera para el movimiento de toda la muestra. Este protocolo fue desarrollado con especímenes de pez cebra, y se ha utilizado para el desarrollo de la imagen somite 12, pero puede ser aplicada a cualquier conjunto de datos confocal 4D.

<table><tbody><tr><td>3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato (tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa a baja temperatura de gelificación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #4</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>0208-4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Desechable 3 ml graduada</td><td>Samco</td><td>212</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td> <td>de transferencia de polietileno</td></tr><tr><td>Placas de Petri de grado bacteriano de 9 cm</td><td>Greiner Bio One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de etileno propileno fluorado (FEP)</td><td>Bola</td><td>S1815-04</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM-710 Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objetivo</td><td>Zeiss</td><td>421452-9600-000</td><td></td></tr></tbody></table>

muestra de corrección de la sincronización tras 4d confocal time-lapse de imágenes

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

La generación de cuatro dimensiones (4D) de datos confocal; que consiste en secuencias de imágenes en 3D a través del tiempo; proporciona una excelente metodología para capturar comportamientos celulares implicados en los procesos de desarrollo. La capacidad de rastrear y seguir los movimientos de células está limitado por los movimientos de la muestra que se producen debido a la deriva de la muestra o, en algunos casos, el crecimiento durante la adquisición de la imagen. Células de seguimiento en los conjuntos de datos afectados por la deriva y / o el crecimiento incorporarán estos movimientos en cualquier análisis de la posición de la célula. Esto puede resultar en el movimiento aparente de las estructuras estáticas dentro de la muestra. Por lo tanto antes de la célula de seguimiento, la deriva de la muestra debe ser corregida. Usando el código abierto de distribución de Fiji 1 de ImageJ 2,3 y las herramientas incorporadas LOCI 4, hemos desarrollado el 3D correcta deriva plug-in para eliminar el movimiento de la muestra errónea en los conjuntos de datos confocal. Este protocolo compensa con eficacia para la traducción de la muestra o alteraciones en po focalción mediante la utilización de correlación de fase que registrarse en cada punto de una de cuatro dimensiones de datos confocal, manteniendo la capacidad de visualizar y medir los movimientos celulares sobre experimentos con lapso de tiempo prolongados.

En el pez cebra en desarrollo, las células musculares rápidas funden en fibras multinucleadas de 19 horas después de la fertilización (20 - somite etapa) 13. Con el fin de visualizar el movimiento de los núcleos y la fusión de las células musculares que llevamos a cabo 4D de lapso de tiempo de formación de imágenes confocal utilizando una cepa transgénica que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de α-actina de músculo esquelético para etiquetar todo el músculo las células ...

Time-lapse microscopía permite la visualización de los procesos de desarrollo. El crecimiento o la deriva de las muestras durante la adquisición de imágenes se reduce la capacidad de seguir y medir los movimientos de las células durante el desarrollo precisión. Se describe el uso de software de procesamiento de imagen de código abierto para corregir la deriva de tres dimensiones de la muestra con el tiempo.

Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

La microscopía de lapso de tiempo permite visualizar los procesos de desarrollo, crecimiento o desplazamiento de la muestra que ocurren a lo largo de esta imagen. La adquisición puede provocar la imposibilidad de seguir o rastrear los movimientos celulares; en el siguiente protocolo, utilizamos un software de procesamiento de imágenes de código abierto para corregir la deriva tridimensional a lo largo del tiempo.Capturar una serie de secciones ópticas en diferentes planos focales permite generar un modelo tridimensional de la muestra. Esto puede ampliarse a cuatro dimensiones mediante la creación de una serie cronológica de conjuntos de datos 3D. En experimentos cronológicos a largo plazo, es común observar el movimiento de la muestra.Esto puede deberse a imprecisiones en el deslizamiento del hardware que controla la platina y las posiciones focales, mientras que en otros casos deriva como resultado de movimientos inducidos por el crecimiento de la muestra o la flexibilidad dentro de los medios de montaje. Existen métodos para compensar y limitar estos movimientos, con numerosas mejoras en los sistemas de enfoque del hardware y el aumento de la rigidez del medio de montaje. Sin embargo, estos enfoques no pueden aplicarse en muchos casos debido al montaje de imagen requerido para proporcionar condiciones adecuadas para el mantenimiento y crecimiento de las muestras que se deben corregir. Para la deriva de la muestra, hemos desarrollado un complemento para utilizar la plataforma de procesamiento de imágenes de código abierto Fiji.Nuestro complemento de corrección de deriva 3D es capaz de realizar un registro de correlación de fases para corregir el movimiento que ocurre como una deriva de rollo o muestra en experimentos tridimensionales de lapsos de tiempo en experimentos multicanal. El complemento de corrección de deriva 3D utiliza un canal para determinar la corrección requerida. Esta corrección luego se aplica a cualquier canal adicional, lo que resulta en el registro del conjunto de datos en cuatro dimensiones.El paquete web gratuito de código abierto. Fiji es una bifurcación distribuida del programa ImageJ, que contiene complementos preinstalados para realizar numerosos procesos sobre datos recopilados en experimentos de microscopía. Fiji ofrece una arquitectura de complementos más sencilla e incluye instalación predeterminada.Una copia del conjunto correcto de tres complementos EG, que utilizaremos para este análisis cuando la instalación haya finalizado, abre Fiji. Fiji permite la importación de una amplia variedad de formatos de imagen microscópica propietarios. Esto puede lograrse mediante arrastrar y soltar o a través del entorno de microscopía abierta por parte de los usuarios.Complemento de importación de formatos Bio. Si el conjunto de datos supera el tamaño de la memoria instalada en su sistema, abra el archivo de imagen como una pila virtual y una opción de gestión de memoria. El conjunto de datos que utilizaremos en este análisis se generó a partir de un experimento de serie temporal tridimensional del pez cebra transgénico ACTA1, GFP, en el cual el GFP se expresa en el músculo esquelético.Para visualizar los núcleos, esta línea transgénica fue inyectada con la proteína M cherry con localización nuclear para representar mejor estos niveles de fluorescencia; podemos modificar las tablas de búsqueda para cada uno de estos canales mediante la herramienta de canales de color. A lo largo de la serie temporal registrada, parece que la muestra del pez cremallera se desplazó dentro del campo de visión. Para corregir este desplazamiento, abrió el plugin de corrección de deriva 3D en el submenú de registro de los plugins instalados en Fiji.Los marcadores de células que se expresan ampliamente dentro de una muestra o que no participan en los eventos de marcado durante la adquisición de imágenes proporcionan la mejor fuente para la corrección de deriva. En este ejemplo, ACTA uno, fluorescencia GFP en el canal uno. Si la memoria es limitada en su sistema, seleccione la opción de pila virtual y permita que el complemento Correct 3D drift se ejecute.El conjunto de datos corregido tendrá un tamaño de lienzo mayor en comparación con el original, acomodando el movimiento de la muestra. Generar imágenes de proyección máxima de las secciones ópticas permite comparar la deriva que ha sido eliminada de la muestra corregida.La proyección de intensidad máxima elimina la dimensión temporal del conjunto de datos, pero resulta un enfoque útil para examinar rápidamente los resultados de la corrección de deriva. Aquí observamos las imágenes de proyección máxima para cada punto temporal en sus conjuntos de datos corregidos y sin corregir. Cuando este experimento de lapsos de tiempo se proyecta como una sola imagen, la cantidad de deriva que puede ocurrir incluso en un experimento de lapsos de tiempo breve resulta evidente.Las correcciones realizadas al registrar la deriva de un canal de su muestra también se aplican a todos los demás canales contenidos en esta pila de imágenes. El procedimiento para la corrección de deriva si la memoria es limitada en su sistema se modifica ligeramente. Seleccione la opción de pila virtual utilizada tanto en el menú de formato de compra como en el menú de importación y en el menú emergente del complemento de corrección de deriva 3D.Cuando seleccione esta opción, se le pedirá que elija una ubicación en la que un complemento pueda exportar archivos de imagen individuales para cada corte de canal y punto temporal de su experimento de lapso de tiempo. La pila virtual generada contiene la misma corrección de desplazamiento que nuestro ejemplo anterior. Si abrimos la ubicación de guardado seleccionada, veremos los archivos de secuencia de imágenes individuales resultantes que se generaron.Para abrir esta colección de archivos, utilice la herramienta de importación de secuencias de imágenes. El archivo resultante no separará canales, secciones ópticas ni puntos temporales. Para visualizar estas características, convierta la pila en una hiperpila utilizando los datos del archivo de registro, ingresando el número de canales, cortes ópticos y los puntos temporales recopilados. Nuevamente, podemos modificar las tablas de búsqueda para ajustar el color mostrado en nuestro experimento de lapse de tiempo.Este protocolo corrige la deriva que ocurre entre puntos temporales; sin embargo, la deriva que ocurre dentro de la captura de un único punto temporal no puede corregirse mediante este protocolo. Recomendamos que los parámetros utilizados para la adquisición de imágenes reduzcan el tiempo necesario para capturar cada punto temporal. La capacidad de corregir la deriva mediante software de posprocesamiento permite analizar y medir movimientos celulares que, de otro modo, quedarían enmascarados por la deriva de la muestra.

sample-drift-correction-following-4d-confocal-time-lapse-imaging

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Investigación

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Bioingeniería

Se describe la preparación de tres muestras, y cómo pueden ser utilizados para optimizar y evaluar el desempeño de los microscopios TORMENTA. El uso de estos ejemplos nos muestran la forma de adquirir los datos en bruto y luego procesarla para obtener imágenes de super-resolución en las células de aproximadamente 30 a 50 nm de resolución.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

Demostramos el uso de la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) para obtener imágenes simultáneas de múltiples tipos de moléculas marcadas con fluorescencia dentro de las células. Las técnicas descritas producen la localización de miles a cientos de miles de proteínas individuales marcadas con fluorescentes, con una precisión de decenas de nanómetros dentro de células individuales.

Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada...

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células...

Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

Aquí, presentamos un protocolo para la localización de varios color de proteínas de membrana único en organelos de células vivas. Para colocar fluoróforos, se usan proteínas auto etiquetadas. Proteínas, situadas en compartimientos diferentes membranas de la mismo orgánulo, se pueden localizar con una precisión de ~ 18 nm.

Microscopía de localización de varios colores solo de proteínas de membrana en organelos de células mamíferas vivas

Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Este protocolo describe un enfoque para el etiquetado in toto y la imagen multidimensional del desarrollo temprano del ojo del pez cebra. Describimos el etiquetado, la incrustación y las imágenes de cuatro dimensiones (4D) utilizando microscopía confocal de barrido láser, y las consideraciones para optimizar la adquisición de conjuntos de datos para diseccionar los mecanismos de la morfogénesis de la copa óptica.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Este trabajo presenta un flujo de trabajo para el seguimiento de la posición atómica en imágenes de microscopía electrónica de transmisión de resolución atómica. Este flujo de trabajo se realiza utilizando una aplicación matlab de código abierto (EASY-STEM).

Seguimiento de posición atómica de precisión picométrica a través de microscopía electrónica

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

La litografía UV cercana y la microscopía de fuerza de tracción se combinan para medir las fuerzas celulares en hidrogeles con micropatrones. La liberación dirigida inducida por la luz de células individuales permite un alto número de mediciones en la misma muestra.

Control de la adhesión celular mediante técnicas de patrón de hidrogel para aplicaciones en microscopía de fuerza de tracción

Aprende a corregir la deriva tridimensional en microscopía time-lapse 4D utilizando el software de código abierto Fiji. Este método mejora el seguimiento preciso de movimientos celulares en estudios de desarrollo biológico.

Muestra de Corrección de la sincronización Tras 4D Confocal Time-lapse de imágenes

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