Name: La separación automatizada de C. elegans Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprende a separar C. elegans colonizados por Pseudomonas aeruginosa GFP usando el wormsorter para estudiar respuestas inmunes innatas. Este método permite analizar la relación entre colonización y expresión génica.

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Los autores agradecen a la Fundación Médica Ellison por su apoyo. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio Abby Dernburg por su ayuda en el uso de la clasificadora de gusanos.

1. La obtención de una Cultura Synchronized animales adultos jóvenes <ol><li> Crecer gusanos en varias NGM placas sembradas con OP50-1 E. bacterias coli (10x concentrado de un cultivo saturado) hasta muchos gusanos alcanzaron la etapa grávido. </li><li> Tratar a los animales grávidos con solución huevo-prep para obtener un cultivo sincronizado (huevos). </li><li> Huevos Placa en varios de 60 mm NGM placas sembradas con 10x OP50-1 concentrado a una densidad de aproximadamente 150 a 200 huevos / placa. </li><li> Incubar las placas a 25 ° C durante 2 días (hasta que los gusanos han llegado a la L4 - etapa Adulto joven). </li></ol> 2. Preparación de las placas de Pseudomonas aeruginosa y la infección de Worms <ol><li> En el día de la huevo-PREP (paso 1.1) inocular un cultivo PA14 :: GFP en 2 ml de medio que contenía rifampicina B de King a una concentración final de 100 mg / ml. Incubar el cultivo a 37 ° C con agitación O / N. </li><li> Placa del PA14 :: GFP cultura en el mayor número de placas Killing Lento (SKP), según sea necesario para el ensayo. En cada 150 mm SKP placa Petri pipeta 75-100 l de cultivo saturado y extender uniformemente usando un esparcidor de vidrio estéril. Incubar las placas a 37 ° C durante 20-24 h. </li><li> Retire las placas de la incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente (~ 20 min). Uso de tampón M9, lavar los gusanos de la etapa 1.4 en PA14 :: placas de GFP en un volumen mínimo de líquido. Al utilizar placas de 150 mm, varios cientos de gusanos se pueden colocar en una sola placa. </li><li> Incubar las placas a 25 ° C durante 18-21 horas. Para P. gusanos adultos jóvenes expuestos aeruginosa, esta es la ventana de tiempo que muestra la distribución óptima de los colonizados contra los animales no colonizados. </li></ol> 3. Configuración del Wormsorter Antes de realizar la muestra tipo, asegúrese de que la máquina está funcionando correctamente. Los detalles se pueden obtener en http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, y thcorreos pasos esenciales se describen a continuación. <ol><li> Ajustar la presión de la válvula de la vaina de aproximadamente 5 psi (4.5 a 5.5 rango). </li><li> Para comprobar que la velocidad de flujo de fluido de funda es apropiado, coloque un tubo cónico de 15 ml debajo del dispensador, gire la válvula de la vaina, y cierre la válvula del clasificador. Sostenga el tubo debajo del dispensador durante 60 segundos. El volumen en el tubo debe ser de 9-10 ml. Si es fuera de este rango, ajuste la presión de la válvula vaina consecuencia. </li><li> Para garantizar que el caudal de fluido de funda (establecido como en el paso 3.2) permitirá la clasificación exacta, probar la velocidad de clasificación usando 40 partículas micras de control: </li><li> Cierre la válvula de la vaina. Añadir aproximadamente 25 ml de solución de partículas de control al depósito. </li><li> Abra la válvula de la vaina, y la válvula de muestra. </li><li> En el software de su ordenador, vaya a la &quot;partícula de modo de control&quot; y haga clic en Adquirir. </li><li> Asegúrese de que la velocidad de flujo de partículas es de ~ 5-8 partículas / seg, con un TOF (tiempo de vuelo) se aproxima a la anchurade la partícula, 40 micras. Tal TOF indica que sólo un único 40 micras objeto está pasando a través a la vez. Si los valores se encuentran fuera de este rango, ajuste la configuración (siguiendo las instrucciones anteriores) en consecuencia. </li></ol> 4. Ordenando Colonizada vs noncolonized Worms <ol><li> Uso de M9, lavar gusanos en tubos cónicos de 15 ml. Permitir gusanos adultos se hundan hasta el fondo del tubo por gravedad y eliminar el sobrenadante. Llene el tubo con frescos M9. Repita este proceso 3-4x. Esto elimina una gran proporción de larvas, así como el exceso de bacterias y tarda unos 10 min. </li><li> Añadir gusanos al depósito wormsorter con una pequeña barra de agitación suavemente-mezclado. </li><li> Ajuste la ganancia de la señal inicial estableciendo el PMT verde a 600 y el rojo y el amarillo PMT 200. </li><li> Comience la adquisición de datos para ajustar la configuración. </li><li> Trate de mantener un tipo de clase de 25 a 30 eventos (gusanos) por segundo. Si la tasa de número es demasiado alto, diluir los gusanos en el depósito con M9 en consecuencia. Si la tasa eso bajo, añada más gusanos en un pequeño volumen de M9. </li><li> Si el experimento requiere una separación muy estricta de colonizado vs gusanos no colonizados, establezca el &quot;control de coincidencia&quot; a &quot;puro&quot;. Esto asegura que en el caso de que dos objetos se producen demasiado cerca unos de otros o en la misma gota, la máquina rechaza la gota en lugar de recogerla. </li><li> Para clasificar la población de interés, dibujar puertas alrededor de los ejes que indican el tamaño (para obtener gusanos adultos) y la intensidad de fluorescencia (es decir, alto para colonizada, baja para no colonizada). Los valores de fluorescencia para inyección deben ser determinadas empíricamente. </li><li> Coloque una placa de múltiples pocillos o una placa de Petri debajo del dispensador para recoger gusanos a continuación, abra la válvula de tipo para comenzar a ordenar los gusanos. </li><li> Se recoge una pequeña población de animales para verificar al microscopio que la población ordenados es la población de interés. Si no es así, ajuste los parámetros de compuerta de acuerdo y continuar con la recogida de muestras. </li></ol>

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<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
<li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection%2C+by+modulating+the+nematode%27s+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li>
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<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método que describimos aprovecha el etiquetado fluorescente de entidades fuera del gusano para seguir las interacciones entre el gusano y su entorno. En el caso que presentamos, la separación se basó en el etiquetado de un patógeno y se empleó para separar los gusanos con gran carga de patógenos de los que no tenían carga (o eran ligeros). El análisis posterior de la expresión génica no encontró diferencias en las respuestas inmunes entre los dos grupos, lo que sugiere que eran independientes de la carga de patógenos....

Clasificación automática gusano es muy similar a FACS, operando mediante la medición de una señal fluorescente en un tornillo sin fin (normalmente proporcionado por la expresión transgénica de las proteínas informadoras) a medida que pasa enderezó en un tubo, lo que permite la redirección ya sea a un tubo de recogida / o bien a un contenedor de residuos de acuerdo para conmutar parámetros establecidos por el investigador 1. El wormsorter puede facilitar la investigación de muchas maneras, un ejemplo de emplearlo como herramienta de análisis es un estudio que siguió los patrones espacio-temporales de la actividad promotora de casi 1.000 genes 2. Sin embargo, el uso principal de la wormsorter es en pantallas genéticos, siguiente objetivo los niveles de expresión de genes o localización de la proteína fluorescente a lo largo del eje del gusano 3-5. Aquí se describe una nueva aplicación para el wormsorter, en el seguimiento de la colonización del gusano por un patógeno marcado con fluorescencia. Con esto como una herramienta que se centró en la relación entre Pathogen la colonización / carga y la respuesta inmune, para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos responsables de la iniciación de la respuesta inmune en el gusano. En casi todos los organismos estudiados hasta la fecha, la iniciación de la respuesta inmune innata a patógenos microbianos depende del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), y / o peligro / daño-patrones moleculares asociados (amortigua) 6,7. Las estructuras microbianas primero se conservan que incluyen componentes de la pared celular microbiana, su flagelo, o su bicapa lipídica 6; el segundo, incluyen tanto moléculas liberadas (por ejemplo ATP 8), proteínas alteradas u otros marcadores de los procesos celulares alterados 9,10. Ambos tipos de señales son reconocidas por proteínas designadas como receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que tras la unión específica de una molécula patrón activar una cadena de eventos que conducen a una respuesta protectora. C. elegans ha sido extremadamente útil como tractamodelo ble para diseccionar los diversos aspectos de las interacciones huésped-patógeno, pero una cosa que no es bien entendido es cómo se inician la respuesta inmune en el gusano. Ninguno de los supuestos receptores que son ortólogos a los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) en otros organismos se ha demostrado que se unen PAMP, y muchos de los ortólogos de PRRS que son fundamentales para la respuesta inmune en otros organismos mostrar una contribución sorprendentemente limitado a las respuestas de patógenos gusano y la resistencia. Por ejemplo, el receptor Toll de Drosophila, que es esencial para resistir los patógenos Gram positivos, se representa en C. elegans por un único homólogo, Tol-1, lo que contribuye a la protección contra el patógeno Gram negativa Salmonella typhimurium 11, pero no de otros patógenos Gram-negativas, o-positivos 11,12 probados. Estas observaciones, junto con datos que indican que las respuestas inmunes podría ser inducido mediante la interrupción de la proteína celular traducción hcomo llevado a algunos a sugerir que C. elegans detecta principalmente DAMPS 9,13,14. Sin embargo, informes que describen la capacidad de los patógenos muertos para inducir respuestas inmunes sugerir que PAMP de unión puede ser tiene un papel importante en el reconocimiento de patógenos en C. elegans 15,16. El trabajo previo se centra en la respuesta inmune en sincronizada edad genéticamente idénticos C. elegans poblaciones, demostraron una gran variabilidad individual en la colonización intestinal por el Gram-negative bacteria patógena Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, los estudios de perfiles transcripcionales tratan estas poblaciones colonizadas de forma variable-como una entidad 17,18. Tomando ventaja de esta variabilidad, se desarrolló un protocolo de enfocar una wormsorter automatizado para separar las poblaciones colonizadas de forma diferencial Caenorhabditis elegans expuestos a GFP-expresando P. aeruginosa. El examen de la expresión de genes en las poblaciones colonizadas de forma diferente-Facilitated evaluación de la relación entre la carga de patógenos (y el daño asociado) y las respuestas inmunes y proporcionado nuevas perspectivas sobre el reconocimiento de patógenos en C. elegans 19. A continuación se describe el protocolo, que podría ser aplicado para ordenar los gusanos infectados por el patógeno cualquier etiqueta fluorescente. Para los usuarios potenciales cabe señalar que el número de gusanos requeridos para ser resuelto depende de la naturaleza de los análisis posteriores y protocolos en uso. Por ejemplo, en el caso de análisis de microarrays de expresión génica,&gt; se requerirán 1000 gusanos para obtener suficiente ARN, si se utilizan protocolos estándar, pero ~ 100 gusanos sería suficiente si se emplea la amplificación, permitiendo colección rápido de material y minimizando así el estrés a los gusanos.

<table><tbody><tr><td>Tampón M9</td><td>preparado en casa</td><td></td><td>Receta en wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Solución de preparación de huevos</td><td>preparada en casa</td><td></td><td>50 ml de agua; 40 ml de lejía; 10 ml de placas de hidróxido de sodio de 10 N</td></tr><tr><td></td><td>NGM preparadas en casa</td><td></td><td>Receta en wormbook.org</td></tr><tr><td>Placas SKP</td><td>preparadas en casa</td><td></td><td>Receta igual que NGM, solo 0.35% peptona en lugar de 0.25%Partículas de prueba de</td></tr> <tr><td>control</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

la separación automatizada de<em&gt; c. elegans</em&gt; variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

El wormsorter es un instrumento similar a una máquina de FACS que se utiliza en los estudios de Caenorhabditis elegans, típicamente para ordenar gusanos basados ​​en la expresión de un indicador fluorescente. Aquí, destacamos un uso alternativo de este instrumento, para la clasificación de los gusanos de acuerdo a su grado de colonización por parte de un agente patógeno que expresa GFP. Este nuevo uso nos permitió abordar la relación entre la colonización del intestino del gusano y la inducción de la respuesta inmune. Mientras C. las respuestas inmunes frente a diferentes patógenos elegans se han documentado, todavía no se sabe lo que los inicia. Las dos posibilidades principales (que no son mutuamente excluyentes) son el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, y la detección de los daños causados ​​por la infección. Para diferenciar entre las dos posibilidades, la exposición al patógeno debe disociarse del daño que causa. El wormsorter permitido la separación de los gusanos que fueron colonizados extensamente por el Gram-npatógeno egative Pseudomonas aeruginosa, con el probable daño causado por la carga de patógenos, de los gusanos que fueron expuestos de manera similar, pero no es así, o marginalmente, colonizado. Se utilizaron estas poblaciones distintas para evaluar la relación entre la carga de patógenos y la inducción de respuestas inmunes de la transcripción. Los resultados sugieren que los dos se disocian, el apoyo a la posibilidad de reconocimiento de patógenos.

Cuando se combina la edad, genéticamente idénticos C. elegans están expuestos a P. aeruginosa, una amplia distribución se observa en los niveles de colonización (Figura 1A). Con la ayuda del protocolo descrito aquí separación eficiente de no colonizada de gusanos colonizados se puede lograr (Figura 1B). A diferencia de los gusanos no colonizados, gusanos colonizados muestran signos de daño, tales como la lentitud y la reducción de la defecación al aire 19. E...

El wormsorter facilita pantallas genéticas en Caenorhabditis elegans clasificando gusanos de acuerdo a la expresión de los reporteros fluorescentes. Aquí se describe un nuevo uso: la clasificación de acuerdo a la colonización por un patógeno que expresa GFP, y lo empleamos para examinar el papel poco conocido de reconocimiento de patógenos en la iniciación de la respuesta inmune.

La separación automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en evaluar las contribuciones de la colonización y el daño asociado a esta en la iniciación de las respuestas inmunitarias innatas en *Caenorhabditis elegans*. Esto se logra exponiendo una población sincronizada de adultos jóvenes de *Caenorhabditis elegans* a *Pseudomonas aeruginosa* que expresa la proteína verde fluorescente o GFP, lo que genera una población de gusanos con distintos grados de colonización por el patógeno. Tras lavar las poblaciones de gusanos con colonización diferencial, se separan en poblaciones puras centrándose en los dos extremos: gusanos completamente colonizados y gusanos no colonizados.A continuación, se extrae el ARN de estas poblaciones y se evalúa la expresión de genes inmunitarios en comparación con gusanos cultivados en E. coli no patógena. Con el fin de examinar la relación entre la respuesta inmunitaria y la colonización, se obtienen resultados que demuestran que la respuesta inmunitaria innata de Caenorhabditis elegans frente a P. aeruginosa puede desacoplarse de la colonización por el patógeno. La principal ventaja de esta técnica frente a otros enfoques para estudiar el inicio de la respues

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Taylor, M. N., et.al. Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones entre Caenorhabditis elegans y bacterias. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra la exposición de gusanos Caenorhabditis elegans libres de gérmenes y de la misma edad a una cepa bacteriana para la colonización intestinal. Explica la eliminación selectiva de bacterias externas y no adheridas, dejando solo bacterias viables adheridas al epitelio intestinal para su cuantificación.

Evaluación de la colonización bacteriana intestinal en C. elegans libre de gérmenes

Fuente: Petersen, C. et al., Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demuestra el aislamiento y cultivo de especies bacterianas asociadas a Caenorhabditis elegans. Una lisis basada en perlas de C. elegans, seguida de un cultivo selectivo, permite aislar diversas cepas microbianas para su análisis posterior.

Aislamiento y cultivo de Caenorhabditis elegans - Bacterias asociadas

Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo muestra un ensayo de supervivencia utilizando C. elegans para modelar la patogénesis de Aeromonas , donde la ingestión oral de la bacteria provoca infección intestinal y mortalidad, permitiendo una evaluación cuantitativa de la virulencia bacteriana en un sistema huésped vivo.

Modelado de la patogénesis de Aeromonas en C. elegans mediante un ensayo de supervivencia

Fuente: Le, T. A. N. , et al., Medición de los efectos de bacterias y químicos sobre la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra un ensayo basado en fluorescencia para cuantificar la permeabilidad intestinal en C. elegans expuesto a Pseudomonas aeruginosa. En comparación con los controles alimentados con Escherichia coli, los gusanos tratados con patógenos muestran una mayor fuga de fluoróforos hacia la cavidad corporal, lo que indica daño en...

Evaluación de la permeabilidad intestinal en C. elegans tras la exposición bacteriana

Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.

El nematodo Caenorhabditis Elegans - un modelo versátil en Vivo para el estudio de las interacciones huésped-microbio

Aquí se describe un protocolo que es un host adaptable, todo, herramienta de detección de alto contenido que puede ser utilizada para estudiar las interacciones huésped-patógeno y se utiliza para el descubrimiento de medicamentos.

Un alto rendimiento, alto contenido líquido y basada en C. elegans patosistema

Los nematodos de Caenorhabditis silvestre están asociados con muchos microbios, a menudo en la luz intestinal o infectando el intestino. Este protocolo detalla un método para enriquecer microbios inculturables que colonizan el intestino, aprovechando la resistencia de la cutícula dauer.

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe una interrupción de 96 pocillos de Caenorhabditis elegans colonizada bacterianamente después de la parálisis por frío y el blanqueamiento de la superficie para eliminar las bacterias externas. La suspensión resultante está chapada en placas de agar para permitir una cuantificación precisa y de rendimiento medio de la carga bacteriana en un gran número de gusanos individuales.

Uso de datos de un solo gusano para cuantificar la heterogeneidad en las interacciones caenorhabditis elegans-bacterianas

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Aprende a separar C. elegans colonizados por Pseudomonas aeruginosa GFP usando el wormsorter para estudiar respuestas inmunes innatas. Este método permite analizar la relación entre colonización y expresión génica.

La separación automatizada de

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