La separación automatizada de C. elegans Variablemente colonizada por un patógeno bacteriano

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar las contribuciones de la colonización y su daño asociado al inicio de respuestas inmunes innatas en la elegancia marina. Esto se logra exponiendo una población sincronizada de adultos jóvenes a pseudomonas arosa que expresan proteína verde fluorescente o GFP, lo que produce una población de gusanos colonizados de manera variable por el patógeno. Después de lavar las diferencias, las poblaciones colonizadas de gusanos se separan en poblaciones puras, centrándose en los dos extremos de gusanos completamente colonizados y no colonizados.

A continuación, se extrae ARN de estas poblaciones y se evalúa la expresión génica inmunitaria en comparación con los gusanos cultivados en E. coli no patógena. Con el fin de examinar la relación entre la respuesta inmune y la colonización, se obtienen resultados que muestran que la respuesta inmune innata de la elegancia marina a la p arosa puede desacoplarse de la colonización patógena. La principal ventaja de esta técnica sobre otros enfoques para estudiar el inicio de la respuesta inmune en el mar es que aborda la variabilidad de la infección en poblaciones cálidas, lo que nos permite desentrañar diferentes aspectos del proceso de infección.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la elegancia del mar, la inmunidad innata, como cuál es la base para el inicio de las respuestas inmunitarias innatas y de una manera de alto rendimiento. ¿Cuál es el impacto de diferentes manipulaciones genéticas o ambientales en la capacidad de resistir la colonización de patógenos? Para comenzar, cultive lombrices en varios nematodos, medio de crecimiento o placas NGM sembradas con bacterias E. coli hasta que muchos gusanos hayan alcanzado la etapa de tumba.

A continuación, trate a los animales de tumba con una solución de preparación de huevos para obtener un cultivo sincronizado. Siguiente plato. Los huevos en varias placas de NGM de 60 milímetros sembrados con bacterias a una densidad de aproximadamente 150 a 200 huevos por placa.

Se necesitará un mínimo de 15 a 20 placas para obtener varios miles de gusanos. Para el experimento de clasificación, los usuarios deben aumentar la escala utilizando placas de mayor diámetro con más huevos por placa si se necesita un mayor número de lombrices. Incubar las placas a 20 grados centígrados durante dos días hasta que los gusanos hayan alcanzado la etapa L cuatro o adulto joven.

Al día siguiente de la preparación del huevo, inocule A GFP que exprese el cultivo POSA, PA 14 GFP, en dos mililitros de medio reyes B que contenga antibiótico. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación durante la noche. Al día siguiente, coloque el cultivo de PA 14 GFP en tantas placas de muerte lenta como sea necesario para el ensayo en cada placa de Petri de 150 milímetros.

Pipetear de 75 a 100 microlitros de cultivo saturado y distribuir uniformemente. Con un esparcidor de vidrio estéril, incube las placas a 37 grados centígrados durante 20 a 24 horas. Retire las placas con PA 14 GFP de la incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente.

Mientras tanto, para recolectar los gusanos cultivados en placas NGM, agregue una pequeña cantidad de tampón M nine suficiente para cubrir la placa. Agite suavemente la placa y transfiera el líquido a un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los gusanos se asienten en el fondo y elimine el exceso de líquido antes de transferir los gusanos a las placas PA 14 GFP En un volumen mínimo de líquido, cuando se utilizan placas de 150 milímetros, se pueden colocar varios cientos de gusanos en una sola placa.

Incubar las placas a 25 grados centígrados durante 18 a 21 horas para detectar gusanos adultos jóvenes expuestos a la parárosa. Esta es la ventana de tiempo que muestra la distribución óptima de los animales colonizados frente a los no colonizados antes de realizar la clasificación de la muestra para garantizar que la máquina funcione correctamente. Los pasos esenciales se describen aquí y los detalles se pueden obtener en línea.

Ajuste la presión de la válvula de la vaina a aproximadamente cinco PSI para verificar que el caudal de fluido de la vaina sea el adecuado. Coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo del dispensador. Abra la válvula de la vaina y cierre la válvula clasificadora.

Sostenga el tubo debajo del dispensador durante 60 segundos. El volumen en el tubo debe ser de nueve a 10 mililitros. Si está fuera de este rango.

Ajuste la presión de la válvula de la vaina en consecuencia para asegurarse de que el caudal de fluido de la vaina permita una clasificación precisa. Pruebe la tasa de clasificación cerrando primero la válvula de cubierta. A continuación, añada unos 25 mililitros de solución de partículas de control al depósito.

Encienda la válvula de cubierta y la válvula de muestra en el software de la computadora. Vaya al modo de partícula de control y haga clic en adquirir. Asegúrese de que el caudal de partículas sea de aproximadamente cinco a ocho partículas por segundo y que el tiempo de vuelo se aproxime al ancho de la partícula de 40 micrómetros.

Esto asegurará que solo pase un solo objeto de 40 micras a la vez. Si los valores están fuera de este rango, ajústelo a la configuración según corresponda. Usando un tampón M nine, lave los gusanos en tubos cónicos de 15 mililitros, permita que los gusanos adultos se hundan hasta el fondo del tubo por gravedad y elimine el sobrenadante.

Llene el tubo con tampón M nine fresco. Repite este proceso tres o cuatro veces. Esto elimina una gran proporción de larvas, así como el exceso de bacterias, y tarda unos 10 minutos.

Agregue las lombrices al depósito del clasificador de lombrices que contiene una pequeña barra para mezclar suavemente. Ajuste la ganancia de señal inicial configurando el tubo fotomultiplicador verde a 600 y el tubo fotomultiplicador rojo y amarillo a 200. Comience a adquirir datos para ajustar la configuración.

Apunte a una tasa de clasificación de 25 a 30 eventos o gusanos por segundo. Si la tasa numérica es demasiado alta, diluya los gusanos en el depósito con M nueve. Búfer en consecuencia.

Si la tasa es demasiado baja, agregue más gusanos en un pequeño volumen de M nueve. Si el experimento requiere una separación muy estricta de gusanos colonizados y no colonizados, establezca la verificación de coincidencia en pura. Esto asegura que si dos objetos ocurren demasiado cerca uno del otro o en la misma caída, la máquina rechaza la caída.

En lugar de recopilarlo para ordenar la población de interés, dibuje puertas alrededor del eje que indiquen el tamaño y la intensidad de la fluorescencia. Los valores de las compuertas fluorescentes deben determinarse empíricamente. A continuación, coloque una placa de pocillos múltiples o una placa de Petri debajo del dispensador para recoger los gusanos.

A continuación, abra la válvula de clasificación para comenzar a clasificar los gusanos. Recoja una pequeña población de animales para verificar bajo el microscopio que la población ordenada es la población de interés. De lo contrario, ajuste los parámetros de la compuerta en consecuencia y continúe con la recolección de muestras.

Cuando la edad coincidía con la elegancia marina genéticamente idéntica que están expuestas a las posas que expresan GFP, da como resultado una amplia distribución en los niveles de colonización, se logró una separación eficiente de los gusanos no colonizados de los colonizados utilizando un clasificador de gusanos. A diferencia de los gusanos no colonizados, los gusanos colonizados muestran signos evidentes de lentitud y reducen la defecación. Esto último puede ser una razón por la cual los gusanos colonizados por P. arosa tienen dificultades para eliminar la infección.

Cuatro genes fueron inducidos de manera similar a la exposición a P. arosa, independientemente del estado de colonización de los gusanos, y se utilizó R-T-P-C-R cuantitativo para medir la expresión de los genes. Se sabe que los cuatro genes forman parte de la respuesta inmunitaria del CL egan. Lys dos codifica una lisozima dos genes no caracterizados que responden específicamente a la infección, de los cuales uno también contribuye a la resistencia a la infección, y PGP cinco responde a la infección así como al estrés por metales pesados.

Los resultados corroboran los resultados publicados anteriormente que indican que la colonización y su daño asociado no son necesarios para una respuesta inmunitaria. En su lugar, señala los patrones moleculares asociados a los patógenos como los datos de señal que muestran que PGP cinco se induce en animales no colonizados, que no se espera que estén experimentando. El daño extenso sugiere una superposición en los programas reguladores, controlando las respuestas inmunes y las respuestas generales al estrés en la elegancia marina.

Este método puede proporcionar nuevos conocimientos sobre el inicio de las respuestas inmunitarias en el mar, pero también podría aplicarse a otras cuestiones como los efectos de las condiciones ambientales o la manipulación genética en la colonización o la competencia entre diferentes patógenos además de los procesos de infección. Este método también podría aplicarse para seguir otras interacciones de los gusanos con su entorno, como la ingestión o el secuestro de metabolitos o productos químicos. Siguiendo este procedimiento, las poblaciones de interés clasificadas se pueden utilizar para una variedad de propósitos más allá de la expresión génica.

Estos incluyen la recolección de animales vivos para pruebas de infección o supervivencia posteriores o experimentos de comportamiento. Esta técnica proporciona un medio útil para estudiar los efectos de la exposición y colonización de patógenos sobre la inmunidad innata y la elegancia marina.