Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

El objetivo general de este procedimiento es identificar modificaciones postraduccionales de proteínas involucradas en complejos proteicos de plantas, primero expresando de forma transitoria o estable en plana la proteína de interés marcada con una etiqueta. Luego, extraer las proteínas totales del tejido vegetal e inmunoprecipitar la proteína de interés. A continuación, separar las proteínas inmunoprecipitadas en un gel de acrilamida y extraer y digerir las proteínas de la banda de gel de interés.

Ahora envíe las muestras de proteína para espectrometría de masas. En última instancia, los resultados de la espectrometría de masas pueden detectar cambios dinámicos en las modificaciones postraduccionales, como la fosforilación. A diferencia de métodos alternativos, como la incubación in vitro de quinasa con sustrato, este método expresa proteínas en planter.

Por lo tanto, no es necesario saber qué quinasa es responsable de la fosforilación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vegetal, como cómo se transducen las señales en respuesta al estrés, a cambios ambientales o al reconocimiento de patógenos. Además de la identificación de sitios de fosforilación en complejos de proteínas de resistencia activados, este método puede aplicarse ampliamente a cualquier modificación postraduccional de cualquier complejo proteico vegetal.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están acostumbradas a trabajar con grandes cantidades de extracto ni a realizar más pasos del protocolo en un solo día. Para la expresión transitoria, cultive las cepas de agrobacterium hasta la fase estacionaria. Recoleccione las bacterias agro mediante centrifugación a 3000 Gs durante cinco minutos.

Resuspenda los pellet en tampón de infiltración. Realice ahora la infiltración en plantas de *N. benthamiana* de cuatro semanas de edad con bacterias agrobacterianas, manualmente utilizando una jeringa de un mililitro sin aguja o por vacío con 0,02% de surfactante, entre dos y cinco días posteriores a la infiltración.

Recolecte las hojas infiltradas, congélelas en nitrógeno líquido y almacénelas a menos 80 grados Celsius. A continuación, muela 20 gramos de tejido vegetal con nitrógeno líquido utilizando un mortero y un pistilo, y añada 80 mililitros de tampón frío C por cada 20 gramos. Mezcle bien y descongele en hielo.

Ahora, homogenice con tres pulsos de 10 segundos cada uno a velocidad máxima. Filtre el homogenato y centrifugue a 30.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Mientras tanto, añada 100 microlitros de una matriz de afinidad adecuada a 500 microlitros de tampón de bloqueo frío D durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y lave tres veces con un mililitro de tampón frío D. A continuación, retire el sobrenadante del extracto foliar y páselo a través de una jeringa de 0,45 micrómetros.

Filtre en un nuevo tubo sobre hielo. Aliquote el extracto crudo. Para un inmunoblot.

Agregue cinco volúmenes de tampón de carga XSDS, vortexee y hierva las muestras para desnaturalizar. Añada 50 microlitros de la matriz de afinidad, suspendida en tampón D, a cada tubo. Incube con rotación suave durante dos horas a cuatro grados Celsius, luego centrifugue para sedimentar la matriz de afinidad.

Luego, tome una alícuota del extracto no unido para una inmunodetección. Deseche el resto de la muestra, dejando aproximadamente 500 microlitros en el fondo del tubo. Re_suspenda la suspensión con una punta de gran apertura.

Reúna la solución de suspensión mixta de ambos tubos en un solo tubo de 1,5 mililitros. Centrifugue tres veces durante cinco segundos utilizando una centrífuga de banco para precipitar la matriz de afinidad y elimine el sobrenadante tras tres a cinco lavados con un mililitro de tampón frío D. Retire el exceso de tampón D con una aguja de jeringa y eluya con 200 microlitros del tampón de elución adecuado bajo agitación constante. Recoja los tres EIT en un solo tubo.

Luego concentre las proteínas utilizando 30 microlitros de vórtex con resina de absorción. Deje reposar durante cinco minutos y precipite la resina; deseche el sobrenadante. Añada 50 microlitros de tampón de carga para electroforesis SDS al 1X a la matriz de afinidad precipitada o al vórtex con resina de absorción y hiérvalo durante 10 minutos a 80-100 grados Celsius en una centrífuga con bloque térmico.

La matriz de afinidad hervida se encuentra en resina durante dos minutos a 10.000. Tomar una alícuota GS de cinco microlitros del sobrenadante para bloqueo inmunológico y correrla junto con otras fracciones en una placa SDS de 10 centímetros de longitud. La gelatina permite la separación y la identificación de proteínas fosforiladas mediante espectrometría de masas.

Cargue los 45 microlitros restantes en un gel de SDS-PAGE y tiña el gel. El gel de SDS-PAGE con azul brillante de Coomassie coloidal. Luego, detenga el gel mediante lavados abundantes con agua, preferiblemente durante toda la noche.

Ahora, con un escalpelo limpio, excise la banda de interés del gel, corte el trozo de gel en cubos de dos a cuatro milímetros y transfiera la muestra a un tubo. Lave los trozos de gel con acetonitrilo al 50 % y bicarbonato de amonio 50 milimolar hasta que se desvanezca la tinción. Luego, aspire la solución con una pipeta.

Teniendo cuidado de no retirar los trozos de gel. Deshidrate la muestra con acetonitrilo al 100 % durante cinco minutos y elimine el líquido libre. Luego, para reducir los enlaces disulfuro de las proteínas, agregue DTT a una concentración de 10 milimolares e incube entre 30 y 45 minutos a 56 grados Celsius con agitación. Ahora elimine el líquido libre para alquilar los residuos de cisteína.

Añada cloroacetamida 55 milimolar durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire el líquido libre y luego lave los trozos del gel dos veces con acetonitrilo al 50 % durante 10 minutos. Elimine el líquido libre.

Ahora deshidrate los trozos de gel con acetonitrilo al 100 % durante cinco minutos y elimine el líquido libre para la digestión con tripsina. Con 40 microlitros de solución de trabajo de tripsina, permita que los trozos de gel se rehidraten durante 10 minutos con suficiente tampón de digestión para cubrir los trozos de gel. Incube a 37 grados Celsius durante la noche para detener la digestión y extraiga los péptidos de los trozos de gel con ácido fórmico al 5 % mediante sonicación durante cinco a 10 minutos.

Luego, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, seque los péptidos mediante liofilización o un concentrador al vacío y almacene las muestras a menos 20 grados Celsius. Este experimento purifica el complejo cinasa P-R-F-P-T-O de nacoa hamana, un NACOA hamana transgénico que expresa 35 SPTO fue transformado temporalmente con 35 SPRF flag, y el complejo fue inmunoprecipitado con Anti-Flag M dos aros. Los inmunotransferidos ilustran una inmunoprecipitación eficiente de la proteína PRF diana, tanto PTO como la proteína efectora interactiva se copurificaron con PRF, como se indica mediante detección con anticuerpos y análisis de espectrometría de masas.

Aquí, la estrategia consistía en dirigirse a la proteína PTO con Anti-Flag. La estrategia fue modificada. Con el fin de identificar los sitios de fosforilación de PTO.

La cantidad total de la proteína PTO, que comprende tanto el complejo PRF como la forma libre, fue inmunoprecipitada con Anti-Flag M2 agarosa y sometida a fraccionamiento por electroforesis SDS-PAGE, digestión en gel con tripsina y análisis espectrométrico de masas, lo que resultó en péptidos de PTO que abarcan aproximadamente el 80 % de su secuencia. Curiosamente, se identificó un conjunto de sitios de fosforilación sencilla en los péptidos de PTO. Obsérvese que los sitios de fosforilación doble solo se identificaron en presencia de alguna de las proteínas efectoras.

Es importante obtener cantidades suficientes de proteína vegetal para poder identificar los componentes de un complejo proteico y también detectar modificaciones postraduccionales en una proteína de interés. Recuerde que la identificación de modificaciones como la fosforilación requiere una cantidad razonable de proteína para la espectrometría de masas, por lo que al menos debe observarse una banda tenue en su gel tras seguir este procedimiento. Otros métodos, como la identificación del complejo, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como cómo la activación del complejo inmunitario conduce a la inmunidad funcional.

No olvide que trabajar con tampones orgánicos, bacterias y cuchillas BBL puede ser extremadamente peligroso, por lo que debe tomar precauciones como usar guantes y batas de laboratorio.