Name: Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende a medir la actividad citotóxica de células T CD8+ específicas de antígeno mediante un ensayo de citometría de flujo basado en células primarias autólogas. Este método cuantifica unidades líticas con relevancia fisiológica superior a líneas celulares inmortalizadas.

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Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Turismo, Comercio y Desarrollo Económico de Florida.

1. Preparación de linfocitos T efectores CD8+
<ol>
	<li>Descongele las PBMC criopreservadas autólogas (2-3 viales de 50 x 106 células) transfiriendo el criovial de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Lave las células llenando el tubo hasta 50 ml con RPMI completo (4 mM de L-glutamina y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina, suplementadas con 10% de FBS). Cuente las PBMC y vuelva a suspender las células a una concentración de 5 x 106/ml en RPMI completo.</li>
	<li>Añadir péptido específico (5 μg/ml) e IL-2 (10 ng/ml) a las PBMC.</li>
	<li>Establecimiento del cultivo en una placa de 96 pocillos profundos; siembre 1 ml de suspensión celular en cada pocillo.</li>
	<li>Después de 3 días de cultivo, reemplace la mitad del medio de cultivo celular con RPMI completo y fresco.</li>
	<li>Después de 6 días de cultivo, recoja todas las PBMC con pipeta multicanal y transfiera las células en un depósito estéril.</li>
	<li>Cuente, lave y vuelva a suspender las PBMC a 5 x 107/ml en el tampón de separación recomendado en tubos de fondo redondo de 14 ml. Añadir cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ humanos a 50 μl/ml de células. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir partículas magnéticas a 150 μl/ml e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Lleve la suspensión celular hasta 7 ml agregando el tampón de separación. Proceda al aislamiento inmunomagnético de las células T CD8+ intactas colocando el tubo en el imán. Después de 5 minutos, con el tubo aún en el imán, vierta las células de interés en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Tome una pequeña alícuota y tiña las células con anticuerpos contra CD3 y CD8 en 1X PBS-2% FBS durante 30 min a 4 °C. La pureza de las células T CD8+ se puede medir mediante citometría de flujo con una pureza esperada del 95% o superior.</li>
	<li>Resuspenda las células T CD8+ en 450 μl con RPMI completo.</li>
	<li>Agregue 225 μl de RPMI completo en 5 tubos con tapón de rosca.</li>
	<li>Prepare diluciones seriadas (de 1:2 a 1:32) transfiriendo 225 μl de CD8+ al siguiente tubo (ver Figura 1 panel superior).</li>
</ol>
2. Preparación de linfocitos T CD4+ diana
<ol>
	<li>Descongele las PBMC criopreservadas autólogas (1 vial de 50 x 106 células) transfiriendo el criovial de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de RPMI.</li>
	<li>Lave las células y vuelva a suspender las PBMC a 5 x 107/ml con tampón de separación en tubos de fondo redondo de 14 ml. Añadir cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos a 50 μl/ml de células. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir partículas magnéticas a 100 μl/ml e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lleve la suspensión celular hasta 7 ml agregando tampón de separación. Proceda al aislamiento de las células T CD4+ colocando el tubo en el imán. Después de 5 minutos, con el tubo aún dentro del imán, vierta las células deseadas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Tome una pequeña alícuota y tiña las células con anticuerpos contra CD3 y CD4 en 1x PBS-2% FBS durante 30 min a 4 °C. La pureza de las células T CD4+ se puede medir mediante citometría de flujo con una pureza esperada del 95% o superior.</li>
	<li>Cuente las células T CD4+, divídalas en dos tubos cónicos de 15 ml y lávelas con 1x PBS tibio.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de 0,4 μM de alto CFSE en PBS caliente.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de 0,04 μM con bajo contenido de CFSE diluyendo una porción de la solución de trabajo con alto contenido de CFSE 10x en PBS tibio.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células a 20 x 106/ml de PBS (si el número de células T CD4+ es inferior a 10 x 106/ml, resuspenda las células en 0,5 ml de PBS) y tiña la mitad de las células T CD4+ añadiendo un volumen igual de 0,4 μM de solución de trabajo con alto contenido de CFSE (concentración final de 0,2 μM). Por ejemplo, para 1 ml de células, agregue 1 ml de la solución de trabajo CFSE. Teñir la mitad restante del CD4+ añadiendo un volumen igual de 0,04 μM de solución de trabajo baja en CFSE (concentración final de 0,02 μM). Tiñir las células durante 15 min a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.</li>
	<li>Después de la incubación, las células de pellets a 1.500 rpm durante 5 min y resuspender en 1 ml de RPMI completo caliente para apagar la reacción de etiquetado.</li>
	<li>Pulsar las células T CD4+ con CFSE bajo añadiendo el péptido de interés a una concentración final de 5 μg/ml en el RPMI completo e incubar durante 45 min en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C.</li>
	<li>Lave las células T CD4+ con CFSE alto y CFSE bajo en RPMI completo. Repita para un total de dos lavados. Vuelva a suspender a una concentración de 2 x 105 células/ml cada una en RPMI completo.</li>
	<li>Mezcle las dos poblaciones objetivo en una proporción de 1:1 (CFSE-Alto:CFSE-Bajo) (consulte el panel inferior de la Figura 1).</li>
</ol>
3. Cocultura
<ol>
	<li>De cada dilución de linfocitos T CD8+, siembre 100 μl por duplicado en una placa de 96 pocillos de fondo redondo.</li>
	<li>Añadir los linfocitos T CD4+ diana mezclados (100 μl) a cada dilución de células efectoras hasta obtener un volumen final de 200 μl.</li>
	<li>Para medir la apoptosis basal, siembre 3 pocillos solo con células objetivo.</li>
	<li>Incubar el cocultivo durante 6 horas en una atmósfera con 5% de CO2 a 37 °C.</li>
</ol>
4. Tinción y adquisición de citometría de flujo
<ol>
	<li>Transfiera las células a una placa de 96 pocillos con fondo en V y tiña con tetrámeros pMHC conjugados con PE durante 15 min en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C.</li>
	<li>Lavar en 1x PBS-2% FBS y teñir las celdas con celda muerta fijable Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 durante 30 min a 4 °C, protegido de la luz.</li>
	<li>Lave las células una vez con 1x PBS-2% FBS y vuelva a suspender en 100 μl con formaldehído al 2% en 1x PBS.</li>
	<li>Adquiera células en el citómetro de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El ensayo descrito aquí permite cuantificar la función principal de las células T CD8+: la actividad citolítica. La medición precisa de esta función es de suma importancia cuando se caracterizan las funciones efectoras de las células T CD8+, ya que estudios previos informaron discordancia entre esta función y la secreción de citoquinas de células T CD8+ específicas de antígeno10,11. Debido al corto tiempo de incubación del cocultivo (6 horas) y al uso de células diana autólogas, existe una baja tasa de muerte ...

La actividad citolítica es la función principal de las células T CD8+, pero aún se mide raramente, ya que los ensayos utilizados para este propósito son engorrosos y han sido difíciles de estandarizar. La medición precisa de esta función es de suma importancia cuando se caracterizan las funciones efectoras de las células T CD8+, ya que aún no se han descrito predictores fiables de citotoxicidad efectiva mediada por células1,2. Aquí, proponemos un nuevo ensayo funcional para medir la actividad citotóxica de las células T CD8+ específicas de antígeno en las células T CD4+ diana. Se han desarrollado varios enfoques para proporcionar alternativas al estándar de oro, el ensayo de liberación de cromo. Presentamos aquí un ensayo basado en células que revela todo el proceso de matanza a medida que mide la muerte de las células diana vivas. Este método se derivó de protocolos de ensayos citotóxicos basados en citometría de flujo in vivo en ratones4,5 e in vitro en humanos6. En este protocolo, los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno contenidos en la población total de linfocitos T CD8+ se utilizan como células efectoras y los linfocitos T CD4+ autólogos se utilizan como células diana. Los linfocitos T efectores CD8+ de interés se enumeran utilizando MHCI/tetrámeros peptídicos7. La muerte de las células diana se calcula mediante la relación entre las células T CD4+ cargadas y no cargadas de péptidos. Hemos demostrado previamente que este método era reproducible, sensible, específico y no dependía del número de células efectoras dentro de la población total de linfocitos T CD8+8. Al enumerar tanto el número de células efectoras como las células diana en el ensayo de cocultivo, se puede calcular la capacidad intrínseca de las células T CD8+ para matar a las células diana y expresarla en unidades líticas9.

<table><tbody><tr><td>Kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas</td><td>EasySep Células madre</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células T CD8+ humanas EasySep</td><td>Células madre</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Kit de proliferación de células CFSE - para citometría de flujo</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD célula muerta fijable</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Ratón Anti-Humano CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anticuerpo CD4 Antihumano</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anticuerpo CD8 antihumano</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x Solución</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino - Oro, PAA Inactivado por Calor</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos; Tratado; Parte inferior en U; con tapa</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml de poliestireno estéril, envueltos individualmente</td><td>Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Placas de pocillos de 2 ml de fondo en U estériles de 96 pocillos, estériles de 2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), grado de investigación</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, tampón de separación</td><td>Célula madre</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo de fondo redondo de 14 ml, polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep</td><td>Célula madre</td> magnética <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-pocillo; Placa inferior en V con tapa</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído, reactivo ACS, 37 % en peso en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo con tapón de rosca de 1,5 ml, cónico</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

La actividad citolítica de las células T CD8+ rara vez se evalúa. Describimos aquí un nuevo ensayo basado en células para medir la capacidad de las células T CD8+ específicas de antígeno para matar las células T CD4+ cargadas con su péptido afín. Las células T CD4+ diana se dividen en dos poblaciones, marcadas con dos concentraciones diferentes de CFSE. Una población es pulsada con el péptido de interés (CFSE-bajo) mientras que la otra permanece sin pulso (CFSE-alto). Los linfocitos T CD4+ pulsados y no pulsados se mezclan en una proporción igual y se incuban con un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ purificados. La destrucción específica de los linfocitos T CD4+ diana autólogos se analiza mediante citometría de flujo después del cocultivo con linfocitos T CD8+ que contienen los linfocitos T CD8+ efector específico del antígeno detectados mediante tinción de péptido/tetrámero MHCI. La lisis específica de los linfocitos T CD4+ diana, medida en diferentes proporciones efectoras frente a dianas, permite el cálculo de unidades líticas, LU30/106 células. Este ensayo simple y directo permite la medición precisa de la capacidad intrínseca de las células T CD8+ para matar las células T CD4+ objetivo.

El esquema de la Figura 1 resume el ensayo. Los linfocitos T CD8+ purificados (células efectoras) se reconstituyeron en 450 µl de RPMI completo y se realizaron diluciones seriadas añadiendo 225 µl de células T CD8+ al siguiente tubo que contenía 225 µl de medio (panel superior). Se contaron los linfocitos T CD4+ purificados, se dividieron en dos tubos y se marcaron con dos concentraciones diferentes de CFSE (alta y baja), tal como se describe en el protocolo. Las células T CD4+ con CFSE bajo se sensibili...

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad citotóxica de linfocitos T CD8 específicos para un antígeno mediante un ensayo de citometría de flujo basado en células. Esto se logra primero expandiendo los linfocitos T CD8 efector durante seis días en presencia del péptido de interés; en un segundo paso, los linfocitos T CD4 diana se sensibilizan con el péptido de interés y luego se mezclan con linfocitos T CD4 no expuestos. A continuación, los linfocitos T CD8 efector y los linfocitos T CD4 diana se cultivan conjuntamente durante seis horas en diferentes proporciones de efector a diana.En el paso final, la eliminación de las células T CD4 diana cargadas con péptidos y el número de células T CD8 efectoras se cuantifican mediante citometría de flujo. En última instancia, puede calcularse la capacidad intrínseca de eliminación de las células T CD8 específicas para el antígeno, expresada en unidades líticas. Las principales ventajas de esta técnica de ensayo de liberación de oxígeno tipo aro son que utiliza células diana primarias autólogas en lugar de líneas celulares inmortalizadas y la célula diana real.Y los números de células efectoras son cuantificables a nivel

cell-based-flow-cytometry-assay-to-measure-cytotoxic-activity

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas (CIK) contra las células cancerosas. Tras el cocultivo de células cancerosas diana con células CIK, las células cancerosas muertas se identifican utilizando un colorante fluorescente de viabilidad y se cuantifican mediante citometría de flujo, estimando el efecto citotóxico de las células CIK.

Ensayo in vitro para estudiar la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Este video muestra un ensayo de apoptosis en células cancerosas inducida por linfocitos T efectores preactivados. Al co-cultivar estas células con células cancerosas marcadas con núcleos fluorescentes, se agrega un sustrato fluorogénico escindible en caspasas. Las células cancerosas apoptóticas mostrarán un color diferente en sus núcleos, lo que dará lugar a una fluorescencia dual. Esta doble fluorescencia es indicativa de células cancerosas que experimentan apoptosis.

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