Name: Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprende a medir la actividad citotóxica de células T CD8+ específicas de antígeno mediante un ensayo de citometría de flujo basado en células primarias autólogas. Este método cuantifica unidades líticas con relevancia fisiológica superior a líneas celulares inmortalizadas.

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Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Turismo, Comercio y Desarrollo Económico de Florida.

1. Preparación de linfocitos T efectores CD8+
<ol>
	<li>Descongele las PBMC criopreservadas autólogas (2-3 viales de 50 x 106 células) transfiriendo el criovial de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Lave las células llenando el tubo hasta 50 ml con RPMI completo (4 mM de L-glutamina y 100 U/ml de penicilina y estreptomicina, suplementadas con 10% de FBS). Cuente las PBMC y vuelva a suspender las células a una concentración de 5 x 106/ml en RPMI completo.</li>
	<li>Añadir péptido específico (5 μg/ml) e IL-2 (10 ng/ml) a las PBMC.</li>
	<li>Establecimiento del cultivo en una placa de 96 pocillos profundos; siembre 1 ml de suspensión celular en cada pocillo.</li>
	<li>Después de 3 días de cultivo, reemplace la mitad del medio de cultivo celular con RPMI completo y fresco.</li>
	<li>Después de 6 días de cultivo, recoja todas las PBMC con pipeta multicanal y transfiera las células en un depósito estéril.</li>
	<li>Cuente, lave y vuelva a suspender las PBMC a 5 x 107/ml en el tampón de separación recomendado en tubos de fondo redondo de 14 ml. Añadir cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD8+ humanos a 50 μl/ml de células. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir partículas magnéticas a 150 μl/ml e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Lleve la suspensión celular hasta 7 ml agregando el tampón de separación. Proceda al aislamiento inmunomagnético de las células T CD8+ intactas colocando el tubo en el imán. Después de 5 minutos, con el tubo aún en el imán, vierta las células de interés en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Tome una pequeña alícuota y tiña las células con anticuerpos contra CD3 y CD8 en 1X PBS-2% FBS durante 30 min a 4 °C. La pureza de las células T CD8+ se puede medir mediante citometría de flujo con una pureza esperada del 95% o superior.</li>
	<li>Resuspenda las células T CD8+ en 450 μl con RPMI completo.</li>
	<li>Agregue 225 μl de RPMI completo en 5 tubos con tapón de rosca.</li>
	<li>Prepare diluciones seriadas (de 1:2 a 1:32) transfiriendo 225 μl de CD8+ al siguiente tubo (ver Figura 1 panel superior).</li>
</ol>
2. Preparación de linfocitos T CD4+ diana
<ol>
	<li>Descongele las PBMC criopreservadas autólogas (1 vial de 50 x 106 células) transfiriendo el criovial de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de RPMI.</li>
	<li>Lave las células y vuelva a suspender las PBMC a 5 x 107/ml con tampón de separación en tubos de fondo redondo de 14 ml. Añadir cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos a 50 μl/ml de células. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir partículas magnéticas a 100 μl/ml e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lleve la suspensión celular hasta 7 ml agregando tampón de separación. Proceda al aislamiento de las células T CD4+ colocando el tubo en el imán. Después de 5 minutos, con el tubo aún dentro del imán, vierta las células deseadas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Tome una pequeña alícuota y tiña las células con anticuerpos contra CD3 y CD4 en 1x PBS-2% FBS durante 30 min a 4 °C. La pureza de las células T CD4+ se puede medir mediante citometría de flujo con una pureza esperada del 95% o superior.</li>
	<li>Cuente las células T CD4+, divídalas en dos tubos cónicos de 15 ml y lávelas con 1x PBS tibio.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de 0,4 μM de alto CFSE en PBS caliente.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de 0,04 μM con bajo contenido de CFSE diluyendo una porción de la solución de trabajo con alto contenido de CFSE 10x en PBS tibio.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células a 20 x 106/ml de PBS (si el número de células T CD4+ es inferior a 10 x 106/ml, resuspenda las células en 0,5 ml de PBS) y tiña la mitad de las células T CD4+ añadiendo un volumen igual de 0,4 μM de solución de trabajo con alto contenido de CFSE (concentración final de 0,2 μM). Por ejemplo, para 1 ml de células, agregue 1 ml de la solución de trabajo CFSE. Teñir la mitad restante del CD4+ añadiendo un volumen igual de 0,04 μM de solución de trabajo baja en CFSE (concentración final de 0,02 μM). Tiñir las células durante 15 min a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.</li>
	<li>Después de la incubación, las células de pellets a 1.500 rpm durante 5 min y resuspender en 1 ml de RPMI completo caliente para apagar la reacción de etiquetado.</li>
	<li>Pulsar las células T CD4+ con CFSE bajo añadiendo el péptido de interés a una concentración final de 5 μg/ml en el RPMI completo e incubar durante 45 min en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C.</li>
	<li>Lave las células T CD4+ con CFSE alto y CFSE bajo en RPMI completo. Repita para un total de dos lavados. Vuelva a suspender a una concentración de 2 x 105 células/ml cada una en RPMI completo.</li>
	<li>Mezcle las dos poblaciones objetivo en una proporción de 1:1 (CFSE-Alto:CFSE-Bajo) (consulte el panel inferior de la Figura 1).</li>
</ol>
3. Cocultura
<ol>
	<li>De cada dilución de linfocitos T CD8+, siembre 100 μl por duplicado en una placa de 96 pocillos de fondo redondo.</li>
	<li>Añadir los linfocitos T CD4+ diana mezclados (100 μl) a cada dilución de células efectoras hasta obtener un volumen final de 200 μl.</li>
	<li>Para medir la apoptosis basal, siembre 3 pocillos solo con células objetivo.</li>
	<li>Incubar el cocultivo durante 6 horas en una atmósfera con 5% de CO2 a 37 °C.</li>
</ol>
4. Tinción y adquisición de citometría de flujo
<ol>
	<li>Transfiera las células a una placa de 96 pocillos con fondo en V y tiña con tetrámeros pMHC conjugados con PE durante 15 min en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 °C.</li>
	<li>Lavar en 1x PBS-2% FBS y teñir las celdas con celda muerta fijable Far Red LIVE/DEAD, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 durante 30 min a 4 °C, protegido de la luz.</li>
	<li>Lave las células una vez con 1x PBS-2% FBS y vuelva a suspender en 100 μl con formaldehído al 2% en 1x PBS.</li>
	<li>Adquiera células en el citómetro de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El ensayo descrito aquí permite cuantificar la función principal de las células T CD8+: la actividad citolítica. La medición precisa de esta función es de suma importancia cuando se caracterizan las funciones efectoras de las células T CD8+, ya que estudios previos informaron discordancia entre esta función y la secreción de citoquinas de células T CD8+ específicas de antígeno10,11. Debido al corto tiempo de incubación del cocultivo (6 horas) y al uso de células diana autólogas, existe una baja tasa de muerte ...

La actividad citolítica es la función principal de las células T CD8+, pero aún se mide raramente, ya que los ensayos utilizados para este propósito son engorrosos y han sido difíciles de estandarizar. La medición precisa de esta función es de suma importancia cuando se caracterizan las funciones efectoras de las células T CD8+, ya que aún no se han descrito predictores fiables de citotoxicidad efectiva mediada por células1,2. Aquí, proponemos un nuevo ensayo funcional para medir la actividad citotóxica de las células T CD8+ específicas de antígeno en las células T CD4+ diana. Se han desarrollado varios enfoques para proporcionar alternativas al estándar de oro, el ensayo de liberación de cromo. Presentamos aquí un ensayo basado en células que revela todo el proceso de matanza a medida que mide la muerte de las células diana vivas. Este método se derivó de protocolos de ensayos citotóxicos basados en citometría de flujo in vivo en ratones4,5 e in vitro en humanos6. En este protocolo, los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno contenidos en la población total de linfocitos T CD8+ se utilizan como células efectoras y los linfocitos T CD4+ autólogos se utilizan como células diana. Los linfocitos T efectores CD8+ de interés se enumeran utilizando MHCI/tetrámeros peptídicos7. La muerte de las células diana se calcula mediante la relación entre las células T CD4+ cargadas y no cargadas de péptidos. Hemos demostrado previamente que este método era reproducible, sensible, específico y no dependía del número de células efectoras dentro de la población total de linfocitos T CD8+8. Al enumerar tanto el número de células efectoras como las células diana en el ensayo de cocultivo, se puede calcular la capacidad intrínseca de las células T CD8+ para matar a las células diana y expresarla en unidades líticas9.

<table><tbody><tr><td>Kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas</td><td>EasySep Células madre</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células T CD8+ humanas EasySep</td><td>Células madre</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Kit de proliferación de células CFSE - para citometría de flujo</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD célula muerta fijable</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Ratón Anti-Humano CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anticuerpo CD4 Antihumano</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anticuerpo CD8 antihumano</td><td>Biolegend</td><td>344707</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 100x Solución</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino - Oro, PAA Inactivado por Calor</td><td></td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 pocillos; Tratado; Parte inferior en U; con tapa</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml de poliestireno estéril, envueltos individualmente</td><td>Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Placas de pocillos de 2 ml de fondo en U estériles de 96 pocillos, estériles de 2 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), grado de investigación</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Buffer, tampón de separación</td><td>Célula madre</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de polipropileno de 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>tubo de fondo redondo de 14 ml, polipropileno</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep</td><td>Célula madre</td> magnética <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-pocillo; Placa inferior en V con tapa</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído, reactivo ACS, 37 % en peso en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microtubo con tapón de rosca de 1,5 ml, cónico</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

La actividad citolítica de las células T CD8+ rara vez se evalúa. Describimos aquí un nuevo ensayo basado en células para medir la capacidad de las células T CD8+ específicas de antígeno para matar las células T CD4+ cargadas con su péptido afín. Las células T CD4+ diana se dividen en dos poblaciones, marcadas con dos concentraciones diferentes de CFSE. Una población es pulsada con el péptido de interés (CFSE-bajo) mientras que la otra permanece sin pulso (CFSE-alto). Los linfocitos T CD4+ pulsados y no pulsados se mezclan en una proporción igual y se incuban con un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ purificados. La destrucción específica de los linfocitos T CD4+ diana autólogos se analiza mediante citometría de flujo después del cocultivo con linfocitos T CD8+ que contienen los linfocitos T CD8+ efector específico del antígeno detectados mediante tinción de péptido/tetrámero MHCI. La lisis específica de los linfocitos T CD4+ diana, medida en diferentes proporciones efectoras frente a dianas, permite el cálculo de unidades líticas, LU30/106 células. Este ensayo simple y directo permite la medición precisa de la capacidad intrínseca de las células T CD8+ para matar las células T CD4+ objetivo.

El esquema de la Figura 1 resume el ensayo. Los linfocitos T CD8+ purificados (células efectoras) se reconstituyeron en 450 µl de RPMI completo y se realizaron diluciones seriadas añadiendo 225 µl de células T CD8+ al siguiente tubo que contenía 225 µl de medio (panel superior). Se contaron los linfocitos T CD4+ purificados, se dividieron en dos tubos y se marcaron con dos concentraciones diferentes de CFSE (alta y baja), tal como se describe en el protocolo. Las células T CD4+ con CFSE bajo se sensibili...

Este protocolo describe un ensayo de citotoxicidad sensible basado en células. Al enumerar la disminución de la frecuencia de linfocitos T CD4+ diana vivos en presencia de un número cada vez mayor de linfocitos T CD8+ efectores, este ensayo permite la evaluación directa de la actividad citolítica de los linfocitos T CD8+ específicos del antígeno.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad citotóxica de linfocitos T CD8 específicos para un antígeno mediante un ensayo de citometría de flujo basado en células. Esto se logra primero expandiendo los linfocitos T CD8 efector durante seis días en presencia del péptido de interés; en un segundo paso, los linfocitos T CD4 diana se sensibilizan con el péptido de interés y luego se mezclan con linfocitos T CD4 no expuestos. A continuación, los linfocitos T CD8 efector y los linfocitos T CD4 diana se cultivan conjuntamente durante seis horas en diferentes proporciones de efector a diana.En el paso final, la eliminación de las células T CD4 diana cargadas con péptidos y el número de células T CD8 efectoras se cuantifican mediante citometría de flujo. En última instancia, puede calcularse la capacidad intrínseca de eliminación de las células T CD8 específicas para el antígeno, expresada en unidades líticas. Las principales ventajas de esta técnica de ensayo de liberación de oxígeno tipo aro son que utiliza células diana primarias autólogas en lugar de líneas celulares inmortalizadas y la célula diana real.Y los números de células efectoras son cuantificables a nivel de célula individual. En este momento, un ayudante de investigación en mi laboratorio demostrará el procedimiento para aislar las células efectoras positivas para CD8. Comience por descongelar los pbmc autólogos criopreservados en un baño de agua a 37 grados Celsius, y luego lave las células con hasta 50 mililitros de medio completo.Después de contar, diluya los PBMC a una concentración de 5 millones de células por mililitro en medio completo y luego agregue IL-2 y el péptido de interés a la cultura. A continuación, siembre un mililitro de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de tres días de cultivo, reemplace la mitad del sobrenadante con medio completo fresco. Después de seis días de cultivo, use una pipeta multicanal para transferir las células a un reservorio estéril y luego cuéntelas y lávelas.Re-suspender el precipitado a 50 millones de células por mililitro en un tampón de separación e incubar los PBMC en un tubo redondo de 14 mililitros con un cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD8 positivos humanos a 50 microlitros por mililitro de células a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, incubar las células con partículas magnéticas conjugadas con IgG anti-CD8 a 150 microlitros por mililitro durante cinco minutos más, y luego llevar la suspensión celular a un volumen final de siete mililitros con tampón de separación adicional. Colocar el tubo en el imán de separación; después de cinco minutos, con el tubo aún en el imán, verter las células en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, teñir una pequeña alícuota de las células con anticuerpos contra CD3 y CD8 en PBS suplementado con 2% de FBS durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Confirme que la pureza de las células es de 95 % CD8 positivo o superior mediante citometría de flujo. Ahora agregue 225 microlitros de medio completo en cinco tubos con tapa roscada y luego diluya seriamente las células de uno a dos hasta uno a 32. Para aislar las células diana CD4 positivas, comience descongelando pbmc autólogos criopreservados en un baño de agua a 37 grados Celsius.Transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio. Enriquezca las células T que expresan CD4 mediante separación por partículas magnéticas, tal como se acaba de demostrar, confirmando una pureza del 95 % o superior de células T positivas para CD4 mediante citometría de flujo. Después de contar las células, divídalas en dos tubos cónicos de 15 mililitros y luego lávelas con PBS tibio; re suspenda los pellets a 20 millones de células por mililitro en PBS.Después de asegurarse de que las células estén protegidas de la luz, tiña una mitad de las células T CD4 positivas con una solución de trabajo fresca de CFSE a alta concentración hasta una concentración final de 0,2 milimolar y la otra mitad con una solución de trabajo fresca de CFSE a baja concentración hasta una concentración final de 0,04 milimolar durante 15 minutos a 37 grados Celsius en 5 %CO2. Al final del periodo de tinción, centrifugue las células y reconstituya los precipitados en un mililitro de medio completo tibio para detener la reacción de marcado. Pulse las células T CD4 positivas con CFSE a baja concentración con una concentración final de cinco microgramos por mililitro del péptido de interés en medio completo durante 45 minutos en el incubador de cultivo celular.Después de la incubación, lave ambas poblaciones de células T del CFSC, alta y baja. Dos veces con medio incompleto y resuspenda ambas suspensiones celulares en 200.000 células por mililitro en medio incompleto. Luego mezcle las dos poblaciones diana en una proporción uno a uno de CFSC alto a CFSC bajo.Ahora agregue 100 microlitros de las células T diana CD4 positivas mezcladas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo redondo, luego siembre un microlitro de cada suspensión de células T CD8 positivas por duplicado para obtener un volumen final de 200 microlitros por pocillo. Mida la apoptosis basal sembrando tres pocillos con células diana solamente, e incube el cultivo conjunto durante seis horas en el incubador de cultivo celular. Una vez finalizada la incubación, transfiera las células a una placa VBO de 96 pocillos y marque cada pocillo con tetrámeros de péptido-MHC conjugados con PE durante 15 minutos.En el incubador de cultivo celular, lave las células con PBS suplementado con 2 % de FBS y luego tiña las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, protegido de la luz tras lavar las células. Nuevamente, re suspenda los pellets en 100 microlitros de 2 % de formaldehído en PBS y analice las células mediante citometría de flujo. Tras el co-cultivo, las células se analizan y seleccionan según se muestra en estos gráficos de dispersión.La proporción de células diana viables CFSE alto frente a CFSE bajo, sin pulsar o pulsadas con péptido, se analiza a partir de una pequeña puerta en dispersión directa versus dispersión lateral. Las células vivas se seleccionan entre las células negativas para marcador de muerte celular y positivas para CD4, y se representan según la señal de CFSE para analizar la proporción de células CFSE bajo frente a CFSE alto. A continuación, se crea una puerta más amplia en dispersión directa versus dispersión lateral para enumerar el número total de células efectoras y diana, ya sean vivas o muertas. Tras la incubación de seis horas, se representan las células T positivas para CD8 y tetramero, junto con las células T CD4 positivas CFSE bajo, para analizar la proporción de células efectoras frente a células diana.El número total de linfocitos T citotóxicos CD8 positivos se determina entonces mediante la selección de las células positivas para el tetrámero y CD8 positivas. El número total de células diana se determina mediante la selección de linfocitos T CD4 positivos, CFSE bajo y células positivas y negativas para marcadores de viabilidad. La proporción objetivo de células CFSE bajo frente a células CFSE alto es de uno a uno.Cuando las células diana CD4 positivas se cultivan en ausencia de células efectoras, esta proporción disminuye drásticamente. Cuando las células pulsadas CFSE positivas bajas se incuban con la población total de linfocitos T CD8 positivos que contienen linfocitos T efector CD8 positivos específicos del antígeno.A medida que disminuye la relación, las células diana pulsadas CFSE baja CD4 positivas comienzan a volverse positivas para vivo-muerto. La dilución de las células efectoras da como resultado, por tanto, una restauración de la relación CFSE y, finalmente, una recuperación en el número de células T diana viables pulsadas con péptido, CFSE baja, CD4 positivas. El porcentaje de lisis específica puede entonces representarse como una función de la relación efectora a diana en una escala logarítmica. Como se muestra en la gráfica, se calcula una regresión lineal a partir del gráfico y se utiliza la ecuación de la línea de tendencia para calcular las unidades líticas.Ese es el número de linfocitos T efector CD8 positivos necesarios para eliminar el 30 % de un millón de linfocitos T diana CD4 positivos, con el fin de determinar la capacidad citolítica intrínseca de los linfocitos T CD8 positivos específicos del antígeno y comparar los resultados entre donantes. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión sobre cómo utilizar la citometría para medir la actividad citotóxica de los linfocitos T CD específicos del antígeno. Esta técnica también puede adaptarse fácilmente para tu propio tipo de célula F.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica in vitro para medir la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas (CIK) contra las células cancerosas. Tras el cocultivo de células cancerosas diana con células CIK, las células cancerosas muertas se identifican utilizando un colorante fluorescente de viabilidad y se cuantifican mediante citometría de flujo, estimando el efecto citotóxico de las células CIK.

Ensayo in vitro para estudiar la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas

Este video demuestra la actividad lítica de las células asesinas naturales contra las células diana teñidas con fluorescencia. El método permite la medición de la citotoxicidad inducida por células NK mediante la tinción de células muertas y el uso de un citómetro de flujo para cuantificar las células diana vivas y muertas.

Ensayo de citotoxicidad mediada por células asesinas naturales Preparación de muestras para análisis de citometría de flujo

Este video muestra un ensayo de apoptosis en células cancerosas inducida por linfocitos T efectores preactivados. Al co-cultivar estas células con células cancerosas marcadas con núcleos fluorescentes, se agrega un sustrato fluorogénico escindible en caspasas. Las células cancerosas apoptóticas mostrarán un color diferente en sus núcleos, lo que dará lugar a una fluorescencia dual. Esta doble fluorescencia es indicativa de células cancerosas que experimentan apoptosis.

Un ensayo in vitro para estudiar la citotoxicidad de las células T CD8+ preactivadas contra las células cancerosas

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

Un método sencillo y fiable se describe aquí para analizar un conjunto de funciones de las células NK, tales como la desgranulación, de citoquinas y la producción de quimioquinas dentro de los diferentes subconjuntos de células NK.

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Este trabajo describe un flujo de trabajo avanzado para la determinación precisa y rápida del recuento de células NK (Natural Killer) y la citotoxicidad de las células NK en muestras de sangre humana.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo estandarizado in vitro. para la medición consistente de la citotoxicidad natural, mediada por receptores de antígenos quiméricos y dependiente de anticuerpos en células humanas natural killer mediante imagen de células vivas y citometría de flujo.

Cuantificación de la citotoxicidad de células NK potenciada por receptores de antígenos quiméricos y anticuerpos terapéuticos mediante imagen de células vivas y citometría de flujo

Aprende a medir la actividad citotóxica de células T CD8+ específicas de antígeno mediante un ensayo de citometría de flujo basado en células primarias autólogas. Este método cuantifica unidades líticas con relevancia fisiológica superior a líneas celulares inmortalizadas.

Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

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