Ensayo de citometría de flujo basado en células para medir la actividad citotóxica

El objetivo general de este procedimiento es medir la actividad citotóxica de linfocitos T CD8 específicos para un antígeno mediante un ensayo de citometría de flujo basado en células. Esto se logra primero expandiendo los linfocitos T CD8 efector durante seis días en presencia del péptido de interés; en un segundo paso, los linfocitos T CD4 diana se sensibilizan con el péptido de interés y luego se mezclan con linfocitos T CD4 no expuestos. A continuación, los linfocitos T CD8 efector y los linfocitos T CD4 diana se cultivan conjuntamente durante seis horas en diferentes proporciones de efector a diana.

En el paso final, la eliminación de las células T CD4 diana cargadas con péptidos y el número de células T CD8 efectoras se cuantifican mediante citometría de flujo. En última instancia, puede calcularse la capacidad intrínseca de eliminación de las células T CD8 específicas para el antígeno, expresada en unidades líticas. Las principales ventajas de esta técnica de ensayo de liberación de oxígeno tipo aro son que utiliza células diana primarias autólogas en lugar de líneas celulares inmortalizadas y la célula diana real.

Y los números de células efectoras son cuantificables a nivel de célula individual. En este momento, un ayudante de investigación en mi laboratorio demostrará el procedimiento para aislar las células efectoras positivas para CD8. Comience por descongelar los pbmc autólogos criopreservados en un baño de agua a 37 grados Celsius, y luego lave las células con hasta 50 mililitros de medio completo.

Después de contar, diluya los PBMC a una concentración de 5 millones de células por mililitro en medio completo y luego agregue IL-2 y el péptido de interés a la cultura. A continuación, siembre un mililitro de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de tres días de cultivo, reemplace la mitad del sobrenadante con medio completo fresco. Después de seis días de cultivo, use una pipeta multicanal para transferir las células a un reservorio estéril y luego cuéntelas y lávelas.

Re-suspender el precipitado a 50 millones de células por mililitro en un tampón de separación e incubar los PBMC en un tubo redondo de 14 mililitros con un cóctel de enriquecimiento de linfocitos T CD8 positivos humanos a 50 microlitros por mililitro de células a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, incubar las células con partículas magnéticas conjugadas con IgG anti-CD8 a 150 microlitros por mililitro durante cinco minutos más, y luego llevar la suspensión celular a un volumen final de siete mililitros con tampón de separación adicional. Colocar el tubo en el imán de separación; después de cinco minutos, con el tubo aún en el imán, verter las células en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, teñir una pequeña alícuota de las células con anticuerpos contra CD3 y CD8 en PBS suplementado con 2% de FBS durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Confirme que la pureza de las células es de 95 % CD8 positivo o superior mediante citometría de flujo. Ahora agregue 225 microlitros de medio completo en cinco tubos con tapa roscada y luego diluya seriamente las células de uno a dos hasta uno a 32. Para aislar las células diana CD4 positivas, comience descongelando pbmc autólogos criopreservados en un baño de agua a 37 grados Celsius.

Transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio. Enriquezca las células T que expresan CD4 mediante separación por partículas magnéticas, tal como se acaba de demostrar, confirmando una pureza del 95 % o superior de células T positivas para CD4 mediante citometría de flujo. Después de contar las células, divídalas en dos tubos cónicos de 15 mililitros y luego lávelas con PBS tibio; re suspenda los pellets a 20 millones de células por mililitro en PBS.

Después de asegurarse de que las células estén protegidas de la luz, tiña una mitad de las células T CD4 positivas con una solución de trabajo fresca de CFSE a alta concentración hasta una concentración final de 0,2 milimolar y la otra mitad con una solución de trabajo fresca de CFSE a baja concentración hasta una concentración final de 0,04 milimolar durante 15 minutos a 37 grados Celsius en 5 %CO2. Al final del periodo de tinción, centrifugue las células y reconstituya los precipitados en un mililitro de medio completo tibio para detener la reacción de marcado. Pulse las células T CD4 positivas con CFSE a baja concentración con una concentración final de cinco microgramos por mililitro del péptido de interés en medio completo durante 45 minutos en el incubador de cultivo celular.

Después de la incubación, lave ambas poblaciones de células T del CFSC, alta y baja. Dos veces con medio incompleto y resuspenda ambas suspensiones celulares en 200.000 células por mililitro en medio incompleto. Luego mezcle las dos poblaciones diana en una proporción uno a uno de CFSC alto a CFSC bajo.

Ahora agregue 100 microlitros de las células T diana CD4 positivas mezcladas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo redondo, luego siembre un microlitro de cada suspensión de células T CD8 positivas por duplicado para obtener un volumen final de 200 microlitros por pocillo. Mida la apoptosis basal sembrando tres pocillos con células diana solamente, e incube el cultivo conjunto durante seis horas en el incubador de cultivo celular. Una vez finalizada la incubación, transfiera las células a una placa VBO de 96 pocillos y marque cada pocillo con tetrámeros de péptido-MHC conjugados con PE durante 15 minutos.

En el incubador de cultivo celular, lave las células con PBS suplementado con 2 % de FBS y luego tiña las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, protegido de la luz tras lavar las células. Nuevamente, re suspenda los pellets en 100 microlitros de 2 % de formaldehído en PBS y analice las células mediante citometría de flujo. Tras el co-cultivo, las células se analizan y seleccionan según se muestra en estos gráficos de dispersión.

La proporción de células diana viables CFSE alto frente a CFSE bajo, sin pulsar o pulsadas con péptido, se analiza a partir de una pequeña puerta en dispersión directa versus dispersión lateral. Las células vivas se seleccionan entre las células negativas para marcador de muerte celular y positivas para CD4, y se representan según la señal de CFSE para analizar la proporción de células CFSE bajo frente a CFSE alto. A continuación, se crea una puerta más amplia en dispersión directa versus dispersión lateral para enumerar el número total de células efectoras y diana, ya sean vivas o muertas. Tras la incubación de seis horas, se representan las células T positivas para CD8 y tetramero, junto con las células T CD4 positivas CFSE bajo, para analizar la proporción de células efectoras frente a células diana.

El número total de linfocitos T citotóxicos CD8 positivos se determina entonces mediante la selección de las células positivas para el tetrámero y CD8 positivas. El número total de células diana se determina mediante la selección de linfocitos T CD4 positivos, CFSE bajo y células positivas y negativas para marcadores de viabilidad. La proporción objetivo de células CFSE bajo frente a células CFSE alto es de uno a uno.

Cuando las células diana CD4 positivas se cultivan en ausencia de células efectoras, esta proporción disminuye drásticamente. Cuando las células pulsadas CFSE positivas bajas se incuban con la población total de linfocitos T CD8 positivos que contienen linfocitos T efector CD8 positivos específicos del antígeno.

A medida que disminuye la relación, las células diana pulsadas CFSE baja CD4 positivas comienzan a volverse positivas para vivo-muerto. La dilución de las células efectoras da como resultado, por tanto, una restauración de la relación CFSE y, finalmente, una recuperación en el número de células T diana viables pulsadas con péptido, CFSE baja, CD4 positivas. El porcentaje de lisis específica puede entonces representarse como una función de la relación efectora a diana en una escala logarítmica. Como se muestra en la gráfica, se calcula una regresión lineal a partir del gráfico y se utiliza la ecuación de la línea de tendencia para calcular las unidades líticas.

Ese es el número de linfocitos T efector CD8 positivos necesarios para eliminar el 30 % de un millón de linfocitos T diana CD4 positivos, con el fin de determinar la capacidad citolítica intrínseca de los linfocitos T CD8 positivos específicos del antígeno y comparar los resultados entre donantes. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión sobre cómo utilizar la citometría para medir la actividad citotóxica de los linfocitos T CD específicos del antígeno. Esta técnica también puede adaptarse fácilmente para tu propio tipo de célula F.