Name: Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Aprende a observar la reparación de células lesionadas mediante tinciones fluorescentes y análisis de la exocitosis lisosomal. Este protocolo permite estudiar los mecanismos de respuesta a lesiones en la membrana celular.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones AR055686 y AR060836 y beca postdoctoral de AD por la Asociación Francesa de Distrofia Muscular (AFM). La instalación de imagen celular utilizado en este estudio es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HD040677.

1. Imágenes de células de reparación de membrana Usando granel (grano de cristal) Herir Este protocolo permite el marcado por separado las células dañadas y las que no cicatrizan. La cuantificación de estas poblaciones de células requiere el uso de tres condiciones: 1. Prueba (C1) - Las células se dejan reparar en presencia de Ca 2 +, 2. Control de 1 (sin lesión C2) - Las células se incubaron en presencia de Ca 2 +, pero no heridos, y 3. Control 2 (sin reparación C3) - las células se les permite reparar en ausencia de Ca 2 +. <ol><li> Se cultivan las células a&gt; 50% de confluencia en tres cubreobjetos estériles y lavar C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 ° C y cubreobjetos de transferencia de juntas tóricas de silicona. </li><li> Añadir 100 l de solución de dextrano FITC precalentado en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3. </li><li> Herir membrana plasmática en C1 y C3 por suaves ondulaciones 40 mg de perlas de vidrio sobre el portaobjetos a temperatura ambiente por cubreobjetos inclinación manualmente hacia atrás ysucesivamente 6-8 veces en un ángulo de 30 °. Nota: Para las lesiones leves, asegúrese de que las cuentas de vidrio se distribuyen de manera uniforme, minimizando las lesiones repetidas. Para mejorar la reproducibilidad de lesiones entre las muestras, realización simultánea de la lesiones de perlas de vidrio de las diferentes muestras que se van a comparar. </li><li> Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO 2 y permitir la reparación de proceder durante 5 min. </li><li> Sin dejar que las bolas rueden, retire las cuentas de vidrio y FITC dextrano por lavado con CIM (C1 y C2) o PBS (C3) a 37 ° C. </li><li> Lugar cubreobjetos de vuelta en el ring y añadir 100 l de solución precalentada lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 5 min a temperatura ambiente de CO 2. </li><li> Lavar dos veces con cubreobjetos precalentado CIM y fijar con 4% PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a temperatura ambiente en el reactivo de Hoechst. </li><li> Lave samples dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y células de imagen usando un microscopio de epifluorescencia. </li><li> Usar células de C2 para determinar la intensidad de la tinción de fondo rojo y verde, y utilizar este valor para el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3). </li><li> Puntuación número total de células que son a) verde (lesionado y reparado) yb) de color rojo o rojo y verde (lesionado, pero no pudieron reparar) en muestras C1 y C3. </li><li> Conde&gt; 100 células verdes para cada condición y expresar la fracción de células que han fallado para reparar como un porcentaje de todas las células lesionadas (verde y rojo). </li></ol> 2. Imágenes en vivo de la cinética de la reparación de la membrana de la célula después de la lesión con láser <ol><li> Lavar las células con precalentado CIM y luego poner el cubreobjetos en CIM con el tinte FM. </li><li> Coloque el cubreobjetos en un soporte en la incubadora de etapa superior se mantiene a 37 ° C. </li><li> Seleccione una región de 1-2 mm 2 de la membrana celular, y para irradiar &lt;; 10 mseg con el láser pulsado. Atenuar la potencia del láser a través del software para el 40-50% de la potencia de pico. Potencia óptima permite lesión consistente, pero no letal y esto debe ser determinado por ensayo y error para cada instrumento individual y célula de la línea que se utiliza. </li><li> Para supervisar la reparación, la imagen cada 10 segundos en epifluorescencia y campo claro, comenzando antes de la lesión y continuar durante 3-5 min después de una lesión. Nota: Para control de reparación, repita los pasos 2.1 a 2.4 con las células dañadas en PBS que contenía colorante FM. </li><li> Para cuantificar la cinética de reparación, medir FM celular colorante fluorescente y trazar el cambio en la intensidad (ΔF/F0) durante el curso de formación de imágenes. Estos datos deben promediarse durante más de 10 células de cada condición y se representa como promedio o el valor de la celda individual, según sea necesario. </li></ol> 3. Imaging granel (grano de cristal) lesión inducida Lysosomal Exocitosis Las muestras incluyen siguientes células cultivadas hasta&gt; 50%confluencia: 1. Test (C1) - Las células se permiten reparar en la presencia de Ca 2 +, 2. Control de 1 (C2; Ninguna lesión) - Las células no lesionadas ni incubadas con el anticuerpo primario, y 3. Control 2 (C3; Ninguna reparación) - Las células se permiten reparar en ausencia de Ca 2 +. <ol><li> Lave cubreobjetos C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 º C y transferirlos en silicona las juntas tóricas. </li><li> Añadir 100 l de precalentado lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 y C3 en PBS. </li><li> Herir membrana plasmática en C1 y C3 como en el paso 1.3. </li><li> Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO 2 y permitir la reparación de proceder durante 5 min. </li><li> Retire las perlas de vidrio y TRITC dextrano mediante el lavado de los cubreobjetos en medio de crecimiento frío, asegurando de nuevo sin rodadura de las perlas de vidrio en las células. </li><li> Enjuagar los portaobjetos dos veces con medio de crecimiento frío y la transferencia a las juntas tóricas. </li><li> Para C1 y C3, Añadir 100 ml de rata anticuerpo anti ratón LAMP1 en medio de crecimiento completo de frío y añadir el, medio de crecimiento completo fría para C2. </li><li> Para permitir la unión del anticuerpo cubreobjetos se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar los cubreobjetos tres veces con CIM frío y corregir todos los cubreobjetos con PFA al 4% durante 10 min a TA y luego enjuague 3x con la CIM. </li><li> Incubar todos los cubreobjetos en 100 l de solución de bloqueo durante 15 min a TA </li><li> Incubar todos los cubreobjetos en 100 l Alexa Fluor 488 anticuerpo anti rata durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a RT en Hoechst. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y la imagen usando un microscopio de epifluorescencia. </li><li> El uso de imágenes de células C2, determinar la tinción inespecífica de fondo en el rojo (dextrano TRITC) y verde (Alexa Fluor 488 anticuerpos) canales y utilizar estos valores de tinción de fondo con el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Utilice los&gt; 100 marcados con rojo células de C1 y C3 para medir la intensidad de la tinción LÁMPARA1 (verde) en células lesionadas. Para un experimento exitoso la tinción LÁMPARA1 en las células de C3 será significativamente menor que en las células de C1. </li></ol> 4. Imágenes en vivo del daño celular membrana Se activa el Tráfico subcelular <ol><li> Fluorescently etiquetar el compartimento de interés transfectando reportero apropiado (por ejemplo CD63-GFP para lisosomas 8) o mediante el uso de colorantes fluorescentes 9. </li><li> Para lisosomas etiquetado con colorante fluorescente, incubar las células cultivadas a 50% de confluencia en medio de cultivo conteniendo FITC-dextrano </li><li> Permitir dextrano a ser endocitosis durante 2 horas (o más largo, según sea necesario para el etiquetado suficiente endosomal con dextrano por la línea celular de interés) en la incubadora de CO 2. </li><li> Lavar las células con medio de cultivo y se incuban precalentadas en ella durante 2 horas en una incubadora de CO2 para permitir a todosendocitosis dextrano a acumularse en el lisosoma. </li><li> Antes de imágenes, enjuague el cubreobjetos precalentado CIM y montar en un soporte de portaobjetos en la incubadora de etapa superior a 37 ° C. </li><li> Realizar campo amplio (para el movimiento a lo largo de la célula) o TIRF (movimiento en la superficie celular y la exocitosis) de imágenes - las células que no tienen abarrotadas FITC dextrano lisosomas marcados son ideales para obtener imágenes de los movimientos y la exocitosis de los lisosomas individuales. </li><li> Alineación de los láseres TIRF para microscopio de imagen: Use 60X o 100X objetivo con&gt; 1,45 NA. Configure el ángulo de incidencia del rayo láser TIRF utilizando el enfoque del fabricante. </li><li> Lesionar la membrana celular mediante la irradiación de una región pequeña (1-2 mm 2) de &lt;100 ms, con el láser pulsado a 40-50% de atenuación. </li><li> Para monitorear la respuesta del lisosoma a la celda de lesiones, celdas de imagen a los 4-6 cuadros / seg durante al menos 2 minutos o más dependiendo de la dinámica de la exocitosis en las células de interés. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
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<li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li>
<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Lesión de la membrana celular in vivo se produce debido a una variedad de factores de estrés fisiológicos y se han desarrollado varios enfoques experimentales para imitar éstos. Estos incluyen hiriendo membrana celular de las células adherentes al quitarlas de la antena o haciendo pasar a través de un estrecho orificio 9,10 jeringa. Después de este tipo de lesiones se curan las células en suspensión y no adherido a la matriz extracelular como lo hacen normalmente en el tejido. Y otros, tales como el ...

La membrana de la célula mantiene la integridad de las células, proporcionando una barrera entre la célula y el medio ambiente extracelular. Un estímulo químico, eléctrico o mecánico que excede el umbral fisiológico normal, así como la presencia de los patógenos invasores puede cada resultado de lesiones a la membrana celular y desencadenar una respuesta celular posterior para reparar esta lesión. Para sobrevivir a estas lesiones a la membrana celular, las células poseen un mecanismo eficiente para la reparación. Este mecanismo es dependiente de calcio e implica el tráfico intracelular de proteínas como anexinas y MG53, entre otros, así como los compartimentos subcelulares tales como endosomas, lisosomas, vesículas de Golgi y mitocondrias derivadas de la membrana de la célula lesionada 1-7. Sin embargo, los detalles de la secuencia de eventos moleculares y subcelulares involucrados en la reparación de la membrana celular dañada sigue siendo poco conocida. Respuesta de reparación de la célula se puede segregar en el oídomente y las respuestas tardías. Las primeras respuestas, que se producen dentro de segundos a minutos escala de tiempo, son tremendamente importante en la determinación de la naturaleza de las respuestas tardías que conducen a la reparación celular éxito o muerte celular. Ensayos de punto final basado en el análisis bioquímico y celular a granel han ayudado a establecer la participación de los procesos moleculares y celulares de la reparación. Pero, debido a la heterogeneidad y la rapidez de respuesta de reparación celular, ensayos de punto final no proporcionan los detalles cinéticos y espaciales de la secuencia de eventos que conducen a reparar. Los enfoques que permitan lesión controlada de la membrana celular y permiten el seguimiento de la reparación de la membrana celular y subcelular respuestas asociadas a una alta resolución espacial y temporal son ideales para este tipo de estudios. En este caso, se han presentado este tipo de enfoques. Dos de los protocolos describen enfoques para controlar la cinética en tiempo real de reparación de la membrana celular y las respuestas subcelulares asociados con el proceso de reparación en células vivas siguientes inj láserury. Como complemento a estos ensayos basados ​​en imágenes de células vivas, los ensayos de punto final también se han descrito que proporcionan una medida basada en la población para la reparación de la vigilancia de las células individuales y las respuestas asociadas subcelulares. Para demostrar su utilidad estos enfoques se han utilizado para vigilar el tráfico y exocitosis de lisosomas en respuesta a la lesión de la membrana celular.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Se utiliza para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Se utiliza para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>FITC dextrano (lisina fijable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml en CIM o PBS</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextrano (lisina fijable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml en CIM o PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% en PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 en PBS</td></tr><tr><td>FM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&micro; l en CIM o PBS</td></tr><tr><td>FITC dextrano</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml en medio de crecimiento</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 en medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 pollo anti-ratas IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 en solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Fondo de vidrio Petridish</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Junta tórica</td> <td>de siliconaBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Utilizado para el medio de crecimiento: 10% FBS, 1% P/S en DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina/Esreptomicina</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Utilizado para el medio de crecimiento: 10% FBS, 1% P/S en DMEM</td></tr><tr><td>Suero de pollo</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>El suero de pollo al 5% en CIM se utiliza para bloquear la solución durante la inmunotinción</td></tr><tr><td>PBS (libre de Ca2+ y Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illuminator&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de epifluorescencia</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Fotométrica, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición y análisis de imágenes</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Láser pulsado</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora superior de etapa</td><td>Tokaihit, Japón</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

La capacidad de las células para curar heridas es un proceso celular fundamental, pero los mecanismos celulares y moleculares implicados en las células curativas heridos son poco conocidos. Aquí se describen ensayos para controlar la capacidad y la cinética de la curación de las células cultivadas después de una lesión localizada. El primer protocolo describe un método de punto final a base de evaluar simultáneamente la capacidad de reparación de la membrana celular de cientos de células. El segundo protocolo describe un enfoque de formación de imágenes en tiempo real para controlar la cinética de la reparación de la membrana celular en las células individuales después de una lesión localizada con un láser pulsado. Como las células curativas heridos implica el tráfico de proteínas específicas y compartimentos subcelulares a la zona de la lesión, el tercer protocolo describe el uso de la aproximación al punto final más arriba basado para evaluar el tráfico de uno de esos eventos (exocitosis lisosomales) en cientos de células dañadas de forma simultánea y el último protocolo describe el uso de lesión láser pulsado junto con micros TIRFcopia para monitorear la dinámica de los compartimentos subcelulares individuales en las células dañadas en alta resolución espacial y temporal. Si bien los protocolos siguientes describen la utilización de estos enfoques para estudiar la relación entre la reparación de la membrana celular y exocitosis lisosomal en las células musculares cultivadas, que se pueden aplicar como tal para cualquier otra célula en cultivo adherente y compartimento subcelular de elección.

Protocolos que se describen aquí para obtener imágenes de células individuales son para controlar la capacidad y la cinética de la reparación de la membrana celular (Protocolos 1 y 2) y el tráfico subcelular y fusión de lisosomas durante la reparación (Protocolos 3 y 4). Protocolo 1 muestra un ensayo mayor que permite el marcado todas las células dañadas y la identificación de las células dañadas que no pudieron reparar. Los resultados en la Figura 1 muestran que mientras qu...

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de tratamientos deseados sobre la reparación de células dañadas y estudiar los procesos subcelulares que contribuyen a la reparación de dichas células. Esto se logra provocando daño celular en presencia de colorantes fluorescentes que no pueden atravesar membranas celulares intactas, para evaluar la cinética y la capacidad de las células dañadas para impedir la entrada de estos colorantes. Como segundo paso, monitoreamos la aparición de proteínas intracelulares en la membrana de la célula dañada, lo que indica la capacidad de un compartimento celular de interés para participar en la reparación mediante la fusión con la membrana celular lesionada.A continuación, monitoreamos la fusión de compartimentos celulares de interés con la membrana celular dañada para evaluar la cinética de la lesión. La fusión inducida de este compartimento permite obtener resultados que indican que la reparación del daño en la membrana celular está asociada con la exocitosis lisosomal, basada en la mayor presencia de la proteína de membrana asociada a lisosomas uno en la superficie celular lesionada y en la imagenología en vivo de la secreción del contenido lisosomal por las células dañadas. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas importantes sobre la lesión y reparación celular.Por ejemplo, estos pueden utilizarse para determinar qué proteínas y compartimentos celulares responden a lesiones focales en la membrana celular y luego evaluar la cinética de dicha respuesta. Realizando el procedimiento estarán Aurelia D cuatro y Hamma Stra dos, becarios postdoctorales de mi laboratorio. Para marcar por separado las células lesionadas que sanan y aquellas que no logran sanar.Siembre las células sobre cubreobjetos estériles para las tres condiciones experimentales. Incube las células hasta que alcancen una confluencia mayor al 50 %, luego lave C uno y C dos dos veces con CIM a 37 grados Celsius. Lave C3 con PBS a 37 grados Celsius.Luego, transfiera los cubreobjetos a anillos de silicona. Añada 100 microlitros de solución de dextrano fitzy precalentada en tampón adecuado. Lesione la membrana plasmática en C uno y C3 añadiendo 40 miligramos de perlas de vidrio sobre el cubreobjetos a temperatura ambiente e inclinando manualmente el cubreobjetos.Deslice hacia adelante y hacia atrás entre seis y ocho veces con un ángulo de 30 grados para producir una lesión leve. Asegúrese de que las perlas de vidrio estén distribuidas uniformemente, minimizando así lesiones repetidas y mejorando la reproducibilidad de la lesión entre muestras. Realice simultáneamente la lesión con perlas de vidrio en las diferentes muestras que se compararán, evitando el rodaje adicional de las perlas.Transfiera todas las laminillas a una incubadora a 37 grados Celsius con CO₂ ambiente y permita que la reparación continúe durante cinco minutos sin que las perlas se muevan. Retire las perlas de vidrio y el dextrano fitzy lavando con tampón o PBS. A continuación, coloque nuevamente las laminillas sobre la arandela de goma y agregue 100 microlitros de lisina precalentada.Solución fijable de dextrano trissy Incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos a CO₂ ambiente. Lavar las laminillas dos veces con CIM precalentado y fijar con PFA al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente tras dos lavados con PBS. Incubar durante dos minutos en colorante de Hersch y, tras dos lavados con PBS, montar la muestra en un portaobjetos utilizando medio de montaje.A continuación, obtenga imágenes de las células utilizando un microscopio de fluorescencia epiescopia de la muestra C dos. Determine la intensidad de fondo de la tinción roja y verde. Luego utilice este valor para establecer el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras.Puntúe el número total de células que son verdes. También puntúe las células que son rojas o tanto rojas como verdes en las muestras C1 y C3. Ahora cuente más de 100 células dañadas verdes para cada condición y exprese la fracción de células que no lograron repararse como un porcentaje de todas las células dañadas.Lave las células cultivadas hasta más del 50 % de confluencia con CIM precalentado y monte el cubreobjetos en CIM con el colorante FM. En un soporte dentro del incubador sobre la platina mantenido a 37 grados Celsius. Seleccione una región de la membrana celular utilizando una potencia óptima que permita una lesión constante pero no letal.Irradie la muestra durante menos de 10 milisegundos con el láser pulsado para lograr esto. Atenúe la potencia del láser mediante el software al 40-50 % de la potencia máxima con el fin de supervisar, reparar y adquirir imágenes cada dos a diez segundos en modo epi, fluorescencia y campo claro, comenzando antes de la lesión y continuando durante tres a cinco minutos tras la lesión. Para cuantificar la cinética de la reparación, mida la fluorescencia del colorante FM celular.Calcule el cambio en la intensidad durante el transcurso de la adquisición de imágenes. Promedie los datos de más de 10 células en cada condición y represente gráficamente como valores promediados o individuales por célula. Lave las laminillas de C uno y C dos.Prepare cultivos con CIM a 37 grados Celsius y lave C3 con PBS a 37 grados Celsius. Luego transfiera las muestras a anillos de silicona. Añada 100 microlitros de dextrano trissy fijable con lisina precalentado.Lesione la membrana plasmática en C uno y C3 como se mostró anteriormente. Luego, evitando un mayor desplazamiento de las perlas, transfiera todas las laminillas a un incubador a 37 grados Celsius con CO2 ambiente y permita que la reparación continúe durante cinco minutos.Ahora, para eliminar las perlas de vidrio y el dextrano Trixie, lave las laminillas con medio de crecimiento frío, asegurándose de que las perlas de vidrio no se muevan sobre las células. Enjuague las laminillas dos veces con medio de crecimiento frío y transfiéralas a los anillos en C1 y C3. Añada 100 microlitros de anticuerpo ratón anti-US lamp 1 en medio de crecimiento completo frío y añada medio de crecimiento completo frío a C2 para permitir la unión del anticuerpo. Incube las laminillas durante 30 minutos a cuatro grados Celsius tras tres lavados con CIM frío.Fije todas las laminillas con PFA al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, enjuáguelas tres veces con CIM. A continuación, incube todas las laminillas en 100 microlitros de una solución bloqueadora durante 15 minutos, seguido de 100 microlitros de anticuerpo anti-rata 4 88 durante 15 minutos.Lave dos veces con PBS e incube en el tinción durante dos minutos a temperatura ambiente tras dos lavados con PBS. Monte las muestras sobre un portaobjetos y luego obtenga imágenes de las muestras mediante un microscopio de fluorescencia epifluorescente utilizando imágenes de células C2. Determine la tinción de fondo no específica en los canales rojo y verde.Utilice estos valores de tinción de fondo para establecer el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras. Utilice más de 100 células marcadas en rojo de C1 y C3 para medir la intensidad de la tinción de lamp1 en células dañadas. En un experimento exitoso, las células con tinción de lamp1 procedentes de C3 serán significativamente menores que en las células procedentes de C1 para la marcación de lisosomas con tinción fluorescente; incube las células crecidas hasta una confluencia del 50 % en medio de crecimiento que contenga dextrano fitzyl.Permita que la dextrana sea endocitada durante dos horas en el incubador de cultivo celular. Lave las células con medio de crecimiento precalentado e incúbelas en él durante dos horas en un incubador de CO₂ para permitir que toda la dextrana endocitada se acumule en el lisosoma antes de la adquisición de imágenes. Enjuague el cubreobjetos con medio de imagen celular (CIM) precalentado y móntelo en CIM sobre un porta-cubreobjetos en el incubador de platina a 37 grados Celsius.Seleccione células que no presenten lisosomas etiquetados con fitodextrana congestionados para la obtención de imágenes. El movimiento y la exocitosis de lisosomas individuales. Adquiera imágenes de campo amplio para observar el desplazamiento de los lisosomas en toda la célula.Alternativamente, adquiera imágenes de parches para observar el movimiento en la superficie celular y monitorear su exocitosis. Lesione la membrana celular mediante irradiación, como se mostró anteriormente, para monitorear la respuesta del lisosoma ante la lesión celular; capture imágenes de las células a una velocidad de cuatro a seis cuadros por segundo durante al menos dos minutos, o más tiempo según la dinámica de la exocitosis en las células de interés. En este ensayo masivo, se marcan todas las células lesionadas y se identifican aquellas que no lograron repararse, mientras que las células no lesionadas permanecen sin etiquetar.Las células dañadas por las perlas de vidrio en presencia de dextrano fitzy se etiquetan en verde cuando se permite que las células se reparen en presencia de calcio. La mayoría de las células dañadas logran repararse y no quedan marcadas con dextrano trissy cuando se permite la reparación. En ausencia de calcio, la mayoría de las células dañadas también se etiquetan en rojo con el dextrano trissy.Este experimento evalúa la cinética de la reparación de la membrana celular mediante el seguimiento de la entrada del colorante FM en la célula. Cuando se incuban en colorante FM, las células íntegras muestran una tinción intracelular mínima o nula. Tras una lesión láser localizada de la membrana celular, el FM D comienza a entrar en la célula y a unirse a las membranas endocelulares, lo que provoca un aumento repentino de la fluorescencia del colorante FM, ya que la capacidad de la membrana celular para repararse tras la lesión láser depende del calcio.Una célula lesionada en presencia de calcio es capaz de repararse, lo que provoca que la entrada del colorante FM cese dentro de un minuto tras la lesión. Por el contrario, una célula que se permite reparar en ausencia de calcio no logra repararse, lo que resulta en una entrada continua del colorante y, por tanto, en un aumento continuo de la fluorescencia de FM d incluso cuatro minutos después de la lesión. Así, la reparación de la membrana celular conduce a una estabilización de la tinción con el colorante FM.Si bien la falta de reparación de la membrana celular provoca una entrada continua de colorante que no alcanza una meseta. El método de lesión con perlas de vidrio en masa puede utilizarse para monitorear la translocación en la superficie celular de vesículas y proteínas en respuesta a la lesión. Aquí, las células son lesionadas en presencia de dextrano marcado con trissy.Por lo tanto, aunque las células no lesionadas no se etiquetan en rojo, todas las células lesionadas se etiquetan en rojo. Tenga en cuenta que las células no lesionadas que no se tratan con el anticuerpo primario muestran una etiquetación de nivel de fondo para la lámpara uno en la superficie celular. Sin embargo, cuando las células resultan lesionadas y se les permite sanar en presencia de calcio, los lisosomas experimentan exocitosis y, por lo tanto, hay un aumento en el nivel de tinción de la lámpara uno en la superficie de las células lesionadas.Este aumento en la marcación de lamp uno en la superficie celular es mucho menor en las células que se permiten sanar en ausencia de calcio. Por lo tanto, tanto la cuantificación del número de células con tinción alta de lamp uno en la superficie celular, como la medición del nivel de tinción de lamp. uno. en la superficie celular de células individuales dañadas, proporcionan medidas de la capacidad de la célula para llevar a cabo la exocitosis lisosomal desencadenada por la lesión.Este experimento monitorea directamente la cinética, la naturaleza y la ubicación de la fusión lisosomal individual. En respuesta a una lesión de la membrana celular, las células son dañadas mediante un láser pulsado y los lisosomas de la superficie celular se visualizan mediante microscopía TURF, lo que permite monitorear la exocitosis inducida por la lesión de los lisosomas en células individuales. Esta figura muestra una célula que se visualiza mediante contraste de fase en el panel izquierdo y mediante microscopía TURF en el panel central.El panel derecho muestra la imagen de césped de la misma célula 105 segundos después de la lesión. Aquí se observa que la lesión indujo el reclutamiento de un lisosoma a la membrana celular, seguido de exocitosis. Este lisosoma no es visible en la imagen de césped antes de la lesión, pero tras la lesión, el lisosoma llega a la membrana celular y se vuelve detectable.A medida que la vesícula se acerca más a la membrana celular, queda mejor excitada por la iluminación del césped, lo que provoca que la fluorescencia del hilo lisosomal de fitsy dex alcance su valor máximo. Cuando se abre la abertura de fusión, esto provoca la neutralización del pH lisosomal y, por lo tanto, la desapantallación de la fluorescencia del hilo fitzy DExT. Posteriormente, el hilo DExT es expulsado desde la vesícula al exterior de la célula, haciendo que la fluorescencia ZI se extienda lateralmente y que la fluorescencia de la vesícula disminuya gradualmente. Se pueden medir diversas respuestas desencadenadas por lesiones en los lisosomas.Después de ver este video, debería tener una comprensión clara de cómo monitorear la capacidad de las células para repararse a partir de lesiones focales grandes y cómo observar los compartimentos subcelulares y las proteínas que responden y contribuyen al proceso de reparación. Se pueden realizar experimentos adicionales utilizando diferentes marcadores vitales, compartimentos o proteínas de interés, con el fin de monitorear la respuesta a la lesión y la participación en la reparación de las células IND.

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