Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de los tratamientos deseados en la reparación de las células lesionadas y estudiar los procesos subcelulares que ayudan a reparar las células lesionadas. Esto se logra lesionando las células en presencia de tintes fluorescentes que no pueden atravesar las membranas celulares intactas para evaluar la cinética y la capacidad de las células lesionadas para evitar la entrada de estos tintes. Como segundo paso, monitorizamos la aparición de proteínas intracelulares en la membrana celular lesionada, que identifica la capacidad de un compartimento celular de interés para participar en la reparación mediante la fusión a la membrana celular lesionada.

A continuación, monitorizamos la fusión de los compartimentos celulares de interés con la membrana celular lesionada con el fin de monitorizar la cinética de la lesión. Se obtienen resultados de fusión desencadenada de este compartimento que muestran que la reparación de la lesión de la membrana celular se asocia con exocitosis lisosomal basada en una mayor apariencia de la proteína de membrana asociada al lisosoma, una en la superficie de la célula lesionada y una imagen en vivo de la secreción de contenido lisosomal por parte de las células lesionadas. Estos métodos pueden ayudar a abordar preguntas importantes en la lesión celular y la reparación.

Por ejemplo, estos se pueden usar para determinar qué proteínas y compartimentos celulares responden a lesiones focales en la membrana celular y luego evaluar su cinética de respuesta. Demostrando el procedimiento estarían Aurelia D, de cuatro años, y hamma stra, dos de las becarias postdoctorales de mi laboratorio. Para marcar por separado las células lesionadas que sanan y las que no sanan.

Siembre las células en cubreobjetos estériles para las tres condiciones experimentales. Cultive las células hasta que alcancen más del 50% de confluencia, luego lave C uno y C dos veces con CIM a 37 grados Celsius. Lavar C3 con PBS a 37 grados centígrados.

A continuación, transfiera los deslizamientos de la cubierta sobre las juntas tóricas de silicona. Agregue 100 microlitros de solución de dextrano fitzy precalentada en el tampón apropiado. Dañe la membrana plasmática de C one y C3 añadiendo 40 miligramos de perlas de vidrio sobre el cubreobjetos a temperatura ambiente e inclinando manualmente la tapa.

Se desliza hacia adelante y hacia atrás de seis a ocho veces en un ángulo de 30 grados para lesiones leves. Asegúrese de que las perlas de vidrio se distribuyan uniformemente, minimizando así las lesiones repetidas para mejorar la reproducibilidad de las lesiones entre muestras. Realizar simultáneamente el daño de las perlas de vidrio de las diferentes muestras a comparar, evitando que las perlas se enrollen más.

Transfiera todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 grados centígrados a temperatura ambiente de CO2 y deje que la reparación continúe durante cinco minutos sin dejar que las perlas rueden. Retire las perlas de vidrio y el dextrano fitzy lavando con tampón o PBS. Ahora vuelva a colocar los cubreobjetos en la junta tórica y agregue 100 microlitros de lisina precalentada.

Solución fijable de trissy dextrano Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos con CO2 ambiente. Lave los cubreobjetos dos veces con CIM precalentado y fije con 4% de PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente después de dos lavados con PBS. Incubar durante dos minutos en tinte hersch y, después de dos lavados con PBS, montar la muestra en un portaobjetos utilizando medios de montaje.

A continuación, obtenga imágenes de las células utilizando un microscopio de epifluorescencia de la muestra C dos. Determine la intensidad de la tinción roja y verde del fondo. A continuación, utilice este valor para establecer el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras.

Marque el número total de celdas que son verdes. También marque las celdas que son rojas o rojas y verdes en las muestras C uno y C3. Ahora cuente más de 100 células verdes lesionadas para cada condición y exprese la fracción de células que no lograron repararse como un porcentaje de todas las células lesionadas.

Lave las células cultivadas a más del 50%Confluence con CIM preadvertido y monte el cubreobjetos en CIM con tinte FM. En un soporte en la incubadora superior de la etapa mantenida a 37 grados centígrados. Seleccione una región de la membrana celular con una potencia óptima que permita una lesión consistente pero no letal.

Irradie la muestra durante menos de 10 milisegundos con el láser pulsado para lograr esto. Atenúe la potencia del láser a través del software hasta el 40 al 50% de la potencia máxima para monitorear, reparar y adquirir imágenes cada dos a 10 segundos en epi, fluorescencia y campo claro comenzando antes de la lesión y continuando durante tres a cinco minutos después de la lesión. Para cuantificar la cinética de reparación, mida la fluorescencia del colorante FM celular.

Calcule el cambio en la intensidad durante el curso de la imagen. Promedie los datos de más de 10 celdas en cada condición y represente como un valor de celdas promediadas o individuales. Lave los cubreobjetos de C uno y C dos.

Preparaciones de cultivo con CIM a 37 grados Celsius y lavado C3 con PBS a 37 grados Celsius. A continuación, transfiera las muestras a juntas tóricas de silicona. Añadir 100 microlitros de lisina trissy dextra fijable precalentada.

Lesiona la membrana plasmática en C one y C3 como se muestra anteriormente. A continuación, evite que las cuentas se enrollen más. Transfiera todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 grados centígrados a temperatura ambiente de CO2 y deje que la reparación continúe durante cinco minutos.

Ahora, para quitar las cuentas de vidrio y Trixie dextran, lave los resbalones de la cubierta en un medio de crecimiento frío, asegurándose de que las cuentas de vidrio no rueden en las celdas. Enjuague los cubreobjetos dos veces con medio de crecimiento en frío y transfiéralos a las juntas tóricas a C uno y C3. Agregue 100 microlitros de lámpara anti-US para ratas, un anticuerpo en un medio de crecimiento completo frío y agregue el medio de crecimiento completo frío a C dos para permitir la unión de anticuerpos. Incubar los cubreobjetos durante 30 minutos a cuatro grados centígrados después de tres lavados con CIM en frío.

Fije todos los cubreobjetos con 4% de PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, enjuague tres veces con CIM. A continuación, incube todos los cubreobjetos en 100 microlitros de una solución de bloqueo durante 15 minutos, seguido de 100 microlitros de ofor, 4 88 anticuerpo anti ratas durante 15 minutos.

Lavar dos veces con PBS e incubar en su mancha durante dos minutos a temperatura ambiente después de dos lavados con PBS. Monte las muestras en un portaobjetos, luego obtenga imágenes de las muestras usando un microscopio de epifluorescencia usando imágenes de células C dos. Determine la tinción de fondo inespecífica en los canales rojo y verde.

Utilice estos valores de tinción de fondo para establecer el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras. Utilice las más de 100 células marcadas con rojo de C one y C3 para medir la intensidad de la tinción de la lámpara uno en las células lesionadas. En un experimento exitoso, la lámpara que tiñe las células de C3 será significativamente más baja que en las células de C uno para marcar lisosomas con colorante fluorescente e incubar las células cultivadas hasta un 50% de confluencia en medios de crecimiento que contienen fitzy dextrano.

Deje que el dextrano se endocitose durante dos horas en la incubadora de cultivos celulares. Lave las células con medios de crecimiento precalentados e incube en ellos durante dos horas en una incubadora de CO2 para permitir que todo el dextrano endocitoso se acumule en el lisosoma antes de la obtención de imágenes. Enjuague el cubreobjetos en Prewarm CIM y móntelo en CIM en un soporte de cubreobjetos en la incubadora superior de la plataforma a 37 grados centígrados.

Seleccione para células que no tengan lisosomas marcados con dextrano fitzy abarrotados para la obtención de imágenes. Movimiento y exocitosis de los lisosomas individuales. Adquiera imágenes de campo amplio para el movimiento de los lisosomas en toda la célula.

Alternativamente, adquieren imágenes del césped para el movimiento en la superficie celular y para monitorear su exocitosis. Lesionar la membrana celular por irradiación, como se ha mostrado anteriormente para monitorear la respuesta del lisosoma a la lesión celular, imagen de las células a cuatro a seis fotogramas por segundo durante al menos dos minutos o más, dependiendo de la dinámica de la exocitosis en las células de interés. En este ensayo masivo, se marcan todas las células lesionadas y se identifican las que no lograron repararse, mientras que las células no lesionadas permanecen sin etiquetar.

Las células dañadas por las perlas de vidrio en presencia de dextrano fitzy se etiquetan en verde cuando se permite que las células se reparen en presencia de calcio. La mayoría de las células lesionadas logran repararse y no están marcadas por dextrano trissy cuando se permite que las células se reparen. En ausencia de calcio, la mayoría de las células lesionadas también están marcadas como rojas por el dextrano trissy.

Este experimento evalúa la cinética de la reparación de la membrana celular mediante el monitoreo de la entrada de colorante FM en la célula. Cuando se incuban en FM, las células intactas muestran poca o ninguna tinción intracelular. Después de una lesión láser localizada de la membrana celular, FM D comienza a ingresar a la célula y se une a las endomembranas, lo que causa un aumento repentino en la fluorescencia del colorante FM, ya que la capacidad de la membrana celular para repararse después de una lesión por láser depende del calcio.

Una célula lesionada en presencia de calcio es capaz de repararse, lo que hace que la entrada del tinte FM cese dentro de un minuto después de la lesión. Por el contrario, una célula a la que se le permite repararse en ausencia de calcio no se repara, lo que resulta en la entrada continua de colorante y, por lo tanto, en un aumento continuo de la fluorescencia de FM d incluso cuatro minutos después de la lesión. Por lo tanto, la reparación de la membrana celular conduce a un estancamiento de la tinción del colorante FM.

Mientras que la falta de reparación de la membrana celular provoca una entrada continua de tinte que no se estabiliza. El enfoque de lesión por perlas de vidrio a granel se puede utilizar para monitorear la translocación de vesículas y proteínas en la superficie celular en respuesta a una lesión. Aquí, las células se lesionan en presencia de trissy dextrano.

Por lo tanto, mientras que las células no lesionadas no están etiquetadas como rojas, todas las células lesionadas están etiquetadas como rojas. Tenga en cuenta que las células no lesionadas que no se tratan con anticuerpos primarios muestran un etiquetado de nivel de fondo para la lámpara de superficie celular uno. Sin embargo, cuando las células se lesionan y se les permite sanar en presencia de calcio, los lisosomas sufren exocitosis y, por lo tanto, hay un mayor nivel de tinción de lámpara uno en la superficie de las células lesionadas.

Este aumento en la superficie celular es mucho menor en las células a las que se les permite sanar en ausencia de calcio. Por lo tanto, cuantifica el número de células con una tinción de lámpara de alta superficie de celda, así como mide el nivel de la lámpara de superficie de celda. Uno. La tinción en las células lesionadas individuales proporciona medidas para la capacidad de la célula para sufrir una exocitosis lisosomal desencadenada por una lesión.

Este experimento monitorea directamente la cinética, la naturaleza y la ubicación de la fusión individual de lisosomas. En respuesta a la lesión de la membrana celular, las células son lesionadas por el láser pulsado y los lisosomas de la superficie celular son fotografiados por imágenes de césped, lo que permite monitorear la exocitosis desencadenada por lesiones de los lisosomas en células individuales. Esta figura muestra una célula que se visualiza mediante imágenes de contraste de fase en el panel izquierdo y mediante microscopía de césped en el panel central.

El panel derecho muestra la imagen del césped de la misma celda 105 segundos después de la lesión. Aquí, se muestra la lesión desencadenada por el reclutamiento de un lisosoma a la membrana celular, seguido de exocitosis. Este lisosoma no es visible en la imagen del césped antes de la lesión, pero después de la lesión, el lisosoma llega a la membrana celular y se vuelve detectable.

A medida que la vesícula se acerca a la membrana celular, es mejor excitada por la iluminación del césped, lo que hace que la fluorescencia de la hebra dex fitsy lisosomal alcance el valor máximo. Cuando se abre el vertido de fusión, esto provoca la neutralización del pH lisosomal y, por lo tanto, la extinción de la fluorescencia de la hebra DExT fitzy. Posteriormente, la hebra DExT se descarga de la vesícula al exterior de la célula, lo que hace que la fluorescencia de ZI se extienda lateralmente y que la fluorescencia de la vesícula disminuya gradualmente se pueden medir varias respuestas desencadenadas por lesiones de los lisosomas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo monitorear la capacidad de las células para repararse de lesiones focales grandes y para monitorear los compartimentos subcelulares y las proteínas que responden y ayudan con el proceso de reparación. Se pueden realizar experimentos adicionales utilizando diferentes marcadores vitales de etiqueta, compartimentos o proteínas para monitorear la respuesta a la lesión y la participación en la reparación de las células IND.