Name: Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Aprende a observar la reparación de células lesionadas mediante tinciones fluorescentes y análisis de la exocitosis lisosomal. Este protocolo permite estudiar los mecanismos de respuesta a lesiones en la membrana celular.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones AR055686 y AR060836 y beca postdoctoral de AD por la Asociación Francesa de Distrofia Muscular (AFM). La instalación de imagen celular utilizado en este estudio es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HD040677.

1. Imágenes de células de reparación de membrana Usando granel (grano de cristal) Herir Este protocolo permite el marcado por separado las células dañadas y las que no cicatrizan. La cuantificación de estas poblaciones de células requiere el uso de tres condiciones: 1. Prueba (C1) - Las células se dejan reparar en presencia de Ca 2 +, 2. Control de 1 (sin lesión C2) - Las células se incubaron en presencia de Ca 2 +, pero no heridos, y 3. Control 2 (sin reparación C3) - las células se les permite reparar en ausencia de Ca 2 +. <ol><li> Se cultivan las células a&gt; 50% de confluencia en tres cubreobjetos estériles y lavar C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 ° C y cubreobjetos de transferencia de juntas tóricas de silicona. </li><li> Añadir 100 l de solución de dextrano FITC precalentado en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3. </li><li> Herir membrana plasmática en C1 y C3 por suaves ondulaciones 40 mg de perlas de vidrio sobre el portaobjetos a temperatura ambiente por cubreobjetos inclinación manualmente hacia atrás ysucesivamente 6-8 veces en un ángulo de 30 °. Nota: Para las lesiones leves, asegúrese de que las cuentas de vidrio se distribuyen de manera uniforme, minimizando las lesiones repetidas. Para mejorar la reproducibilidad de lesiones entre las muestras, realización simultánea de la lesiones de perlas de vidrio de las diferentes muestras que se van a comparar. </li><li> Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO 2 y permitir la reparación de proceder durante 5 min. </li><li> Sin dejar que las bolas rueden, retire las cuentas de vidrio y FITC dextrano por lavado con CIM (C1 y C2) o PBS (C3) a 37 ° C. </li><li> Lugar cubreobjetos de vuelta en el ring y añadir 100 l de solución precalentada lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 o en PBS en C3. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 5 min a temperatura ambiente de CO 2. </li><li> Lavar dos veces con cubreobjetos precalentado CIM y fijar con 4% PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a temperatura ambiente en el reactivo de Hoechst. </li><li> Lave samples dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y células de imagen usando un microscopio de epifluorescencia. </li><li> Usar células de C2 para determinar la intensidad de la tinción de fondo rojo y verde, y utilizar este valor para el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3). </li><li> Puntuación número total de células que son a) verde (lesionado y reparado) yb) de color rojo o rojo y verde (lesionado, pero no pudieron reparar) en muestras C1 y C3. </li><li> Conde&gt; 100 células verdes para cada condición y expresar la fracción de células que han fallado para reparar como un porcentaje de todas las células lesionadas (verde y rojo). </li></ol> 2. Imágenes en vivo de la cinética de la reparación de la membrana de la célula después de la lesión con láser <ol><li> Lavar las células con precalentado CIM y luego poner el cubreobjetos en CIM con el tinte FM. </li><li> Coloque el cubreobjetos en un soporte en la incubadora de etapa superior se mantiene a 37 ° C. </li><li> Seleccione una región de 1-2 mm 2 de la membrana celular, y para irradiar &lt;; 10 mseg con el láser pulsado. Atenuar la potencia del láser a través del software para el 40-50% de la potencia de pico. Potencia óptima permite lesión consistente, pero no letal y esto debe ser determinado por ensayo y error para cada instrumento individual y célula de la línea que se utiliza. </li><li> Para supervisar la reparación, la imagen cada 10 segundos en epifluorescencia y campo claro, comenzando antes de la lesión y continuar durante 3-5 min después de una lesión. Nota: Para control de reparación, repita los pasos 2.1 a 2.4 con las células dañadas en PBS que contenía colorante FM. </li><li> Para cuantificar la cinética de reparación, medir FM celular colorante fluorescente y trazar el cambio en la intensidad (ΔF/F0) durante el curso de formación de imágenes. Estos datos deben promediarse durante más de 10 células de cada condición y se representa como promedio o el valor de la celda individual, según sea necesario. </li></ol> 3. Imaging granel (grano de cristal) lesión inducida Lysosomal Exocitosis Las muestras incluyen siguientes células cultivadas hasta&gt; 50%confluencia: 1. Test (C1) - Las células se permiten reparar en la presencia de Ca 2 +, 2. Control de 1 (C2; Ninguna lesión) - Las células no lesionadas ni incubadas con el anticuerpo primario, y 3. Control 2 (C3; Ninguna reparación) - Las células se permiten reparar en ausencia de Ca 2 +. <ol><li> Lave cubreobjetos C1 y C2 dos veces con CIM a 37 ° C y C3 con PBS a 37 º C y transferirlos en silicona las juntas tóricas. </li><li> Añadir 100 l de precalentado lisina fixable dextrano TRITC en CIM en C1 y C2 y C3 en PBS. </li><li> Herir membrana plasmática en C1 y C3 como en el paso 1.3. </li><li> Evitar más de rodadura de cuentas, transferir todos los cubreobjetos a una incubadora a 37 ° C en ambiente de CO 2 y permitir la reparación de proceder durante 5 min. </li><li> Retire las perlas de vidrio y TRITC dextrano mediante el lavado de los cubreobjetos en medio de crecimiento frío, asegurando de nuevo sin rodadura de las perlas de vidrio en las células. </li><li> Enjuagar los portaobjetos dos veces con medio de crecimiento frío y la transferencia a las juntas tóricas. </li><li> Para C1 y C3, Añadir 100 ml de rata anticuerpo anti ratón LAMP1 en medio de crecimiento completo de frío y añadir el, medio de crecimiento completo fría para C2. </li><li> Para permitir la unión del anticuerpo cubreobjetos se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar los cubreobjetos tres veces con CIM frío y corregir todos los cubreobjetos con PFA al 4% durante 10 min a TA y luego enjuague 3x con la CIM. </li><li> Incubar todos los cubreobjetos en 100 l de solución de bloqueo durante 15 min a TA </li><li> Incubar todos los cubreobjetos en 100 l Alexa Fluor 488 anticuerpo anti rata durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar dos veces con PBS y se incuba durante 2 min a RT en Hoechst. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS, montar en una diapositiva utilizando medio de montaje y la imagen usando un microscopio de epifluorescencia. </li><li> El uso de imágenes de células C2, determinar la tinción inespecífica de fondo en el rojo (dextrano TRITC) y verde (Alexa Fluor 488 anticuerpos) canales y utilizar estos valores de tinción de fondo con el umbral de los canales rojo y verde para todas las muestras (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Utilice los&gt; 100 marcados con rojo células de C1 y C3 para medir la intensidad de la tinción LÁMPARA1 (verde) en células lesionadas. Para un experimento exitoso la tinción LÁMPARA1 en las células de C3 será significativamente menor que en las células de C1. </li></ol> 4. Imágenes en vivo del daño celular membrana Se activa el Tráfico subcelular <ol><li> Fluorescently etiquetar el compartimento de interés transfectando reportero apropiado (por ejemplo CD63-GFP para lisosomas 8) o mediante el uso de colorantes fluorescentes 9. </li><li> Para lisosomas etiquetado con colorante fluorescente, incubar las células cultivadas a 50% de confluencia en medio de cultivo conteniendo FITC-dextrano </li><li> Permitir dextrano a ser endocitosis durante 2 horas (o más largo, según sea necesario para el etiquetado suficiente endosomal con dextrano por la línea celular de interés) en la incubadora de CO 2. </li><li> Lavar las células con medio de cultivo y se incuban precalentadas en ella durante 2 horas en una incubadora de CO2 para permitir a todosendocitosis dextrano a acumularse en el lisosoma. </li><li> Antes de imágenes, enjuague el cubreobjetos precalentado CIM y montar en un soporte de portaobjetos en la incubadora de etapa superior a 37 ° C. </li><li> Realizar campo amplio (para el movimiento a lo largo de la célula) o TIRF (movimiento en la superficie celular y la exocitosis) de imágenes - las células que no tienen abarrotadas FITC dextrano lisosomas marcados son ideales para obtener imágenes de los movimientos y la exocitosis de los lisosomas individuales. </li><li> Alineación de los láseres TIRF para microscopio de imagen: Use 60X o 100X objetivo con&gt; 1,45 NA. Configure el ángulo de incidencia del rayo láser TIRF utilizando el enfoque del fabricante. </li><li> Lesionar la membrana celular mediante la irradiación de una región pequeña (1-2 mm 2) de &lt;100 ms, con el láser pulsado a 40-50% de atenuación. </li><li> Para monitorear la respuesta del lisosoma a la celda de lesiones, celdas de imagen a los 4-6 cuadros / seg durante al menos 2 minutos o más dependiendo de la dinámica de la exocitosis en las células de interés. </li></ol>

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<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
<li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2%2B-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 Forthcoming.</li>
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<li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li>
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<li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li>
<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
<li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaiswal%2C+JK+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , Wiley and Sons Inc. 4.12.1-4.12.15 (2003).</li>
<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Lesión de la membrana celular in vivo se produce debido a una variedad de factores de estrés fisiológicos y se han desarrollado varios enfoques experimentales para imitar éstos. Estos incluyen hiriendo membrana celular de las células adherentes al quitarlas de la antena o haciendo pasar a través de un estrecho orificio 9,10 jeringa. Después de este tipo de lesiones se curan las células en suspensión y no adherido a la matriz extracelular como lo hacen normalmente en el tejido. Y otros, tales como el ...

La membrana de la célula mantiene la integridad de las células, proporcionando una barrera entre la célula y el medio ambiente extracelular. Un estímulo químico, eléctrico o mecánico que excede el umbral fisiológico normal, así como la presencia de los patógenos invasores puede cada resultado de lesiones a la membrana celular y desencadenar una respuesta celular posterior para reparar esta lesión. Para sobrevivir a estas lesiones a la membrana celular, las células poseen un mecanismo eficiente para la reparación. Este mecanismo es dependiente de calcio e implica el tráfico intracelular de proteínas como anexinas y MG53, entre otros, así como los compartimentos subcelulares tales como endosomas, lisosomas, vesículas de Golgi y mitocondrias derivadas de la membrana de la célula lesionada 1-7. Sin embargo, los detalles de la secuencia de eventos moleculares y subcelulares involucrados en la reparación de la membrana celular dañada sigue siendo poco conocida. Respuesta de reparación de la célula se puede segregar en el oídomente y las respuestas tardías. Las primeras respuestas, que se producen dentro de segundos a minutos escala de tiempo, son tremendamente importante en la determinación de la naturaleza de las respuestas tardías que conducen a la reparación celular éxito o muerte celular. Ensayos de punto final basado en el análisis bioquímico y celular a granel han ayudado a establecer la participación de los procesos moleculares y celulares de la reparación. Pero, debido a la heterogeneidad y la rapidez de respuesta de reparación celular, ensayos de punto final no proporcionan los detalles cinéticos y espaciales de la secuencia de eventos que conducen a reparar. Los enfoques que permitan lesión controlada de la membrana celular y permiten el seguimiento de la reparación de la membrana celular y subcelular respuestas asociadas a una alta resolución espacial y temporal son ideales para este tipo de estudios. En este caso, se han presentado este tipo de enfoques. Dos de los protocolos describen enfoques para controlar la cinética en tiempo real de reparación de la membrana celular y las respuestas subcelulares asociados con el proceso de reparación en células vivas siguientes inj láserury. Como complemento a estos ensayos basados ​​en imágenes de células vivas, los ensayos de punto final también se han descrito que proporcionan una medida basada en la población para la reparación de la vigilancia de las células individuales y las respuestas asociadas subcelulares. Para demostrar su utilidad estos enfoques se han utilizado para vigilar el tráfico y exocitosis de lisosomas en respuesta a la lesión de la membrana celular.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Se utiliza para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Se utiliza para preparar CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td></tr><tr><td>FITC dextrano (lisina fijable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml en CIM o PBS</td></tr><tr><td>Perlas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC dextrano (lisina fijable)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml en CIM o PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% en PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 en PBS</td></tr><tr><td>FM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&micro; l en CIM o PBS</td></tr><tr><td>FITC dextrano</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml en medio de crecimiento</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 en medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 pollo anti-ratas IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 en solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Fondo de vidrio Petridish</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Junta tórica</td> <td>de siliconaBellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Utilizado para el medio de crecimiento: 10% FBS, 1% P/S en DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina/Esreptomicina</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Utilizado para el medio de crecimiento: 10% FBS, 1% P/S en DMEM</td></tr><tr><td>Suero de pollo</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>El suero de pollo al 5% en CIM se utiliza para bloquear la solución durante la inmunotinción</td></tr><tr><td>PBS (libre de Ca2+ y Mg2+)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF illuminator&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de epifluorescencia</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD</td><td>Fotométrica, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición y análisis de imágenes</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Láser pulsado</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora superior de etapa</td><td>Tokaihit, Japón</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

La capacidad de las células para curar heridas es un proceso celular fundamental, pero los mecanismos celulares y moleculares implicados en las células curativas heridos son poco conocidos. Aquí se describen ensayos para controlar la capacidad y la cinética de la curación de las células cultivadas después de una lesión localizada. El primer protocolo describe un método de punto final a base de evaluar simultáneamente la capacidad de reparación de la membrana celular de cientos de células. El segundo protocolo describe un enfoque de formación de imágenes en tiempo real para controlar la cinética de la reparación de la membrana celular en las células individuales después de una lesión localizada con un láser pulsado. Como las células curativas heridos implica el tráfico de proteínas específicas y compartimentos subcelulares a la zona de la lesión, el tercer protocolo describe el uso de la aproximación al punto final más arriba basado para evaluar el tráfico de uno de esos eventos (exocitosis lisosomales) en cientos de células dañadas de forma simultánea y el último protocolo describe el uso de lesión láser pulsado junto con micros TIRFcopia para monitorear la dinámica de los compartimentos subcelulares individuales en las células dañadas en alta resolución espacial y temporal. Si bien los protocolos siguientes describen la utilización de estos enfoques para estudiar la relación entre la reparación de la membrana celular y exocitosis lisosomal en las células musculares cultivadas, que se pueden aplicar como tal para cualquier otra célula en cultivo adherente y compartimento subcelular de elección.

Protocolos que se describen aquí para obtener imágenes de células individuales son para controlar la capacidad y la cinética de la reparación de la membrana celular (Protocolos 1 y 2) y el tráfico subcelular y fusión de lisosomas durante la reparación (Protocolos 3 y 4). Protocolo 1 muestra un ensayo mayor que permite el marcado todas las células dañadas y la identificación de las células dañadas que no pudieron reparar. Los resultados en la Figura 1 muestran que mientras qu...

El proceso de las células de curación heridas implica el tráfico de proteínas específicas y los compartimentos subcelulares al sitio de la lesión de la membrana celular. Este protocolo describe ensayos para controlar estos procesos.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto de tratamientos deseados sobre la reparación de células dañadas y estudiar los procesos subcelulares que contribuyen a la reparación de dichas células. Esto se logra provocando daño celular en presencia de colorantes fluorescentes que no pueden atravesar membranas celulares intactas, para evaluar la cinética y la capacidad de las células dañadas para impedir la entrada de estos colorantes. Como segundo paso, monitoreamos la aparición de proteínas intracelulares en la membrana de la célula dañada, lo que indica la capacidad de un compartimento celular de interés para participar en la reparación mediante la fusión con la membrana celular lesionada.A continuación, monitoreamos la fusión de compartimentos celulares de interés con la membrana celular dañada para evaluar la cinética de la lesión. La fusión inducida de este compartimento permite obtener resultados que indican que la reparación del daño en la membrana celular está asociada con la exocitosis lisosomal, basada en la mayor presencia de la proteína de membrana asociada a lisosomas uno en la superficie celular lesionada y en la imagenología en vivo de la secrec

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Biología

Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN...

Imágenes de reparación del ADN y la respuesta celular al daño del ADN en Bacillus subtilis</em

Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Formación de imágenes en vivo de las células expuestas a la colorante lipófilo FM1-43 permite la determinación precisa de la cinética por el cual las toxinas formadoras de poros son retirados de la membrana plasmática. Este es un ensayo sensible que puede ser utilizado para evaluar las necesidades del Ca 2 +, esfingomielinasa y otros factores en la reparación de la membrana de plasma.

Viva Imaging Ensayo para la evaluación de los Roles de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y esfingomielinasa en la reparación de los poros de la formación de toxina Heridas

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Herir la membrana de la célula a través de dos fotones láser es un método ampliamente utilizado para evaluar la capacidad mismo-resellado de la membrana y se puede aplicar a múltiples tipos de células. Aquí, describimos un protocolo en vitro en vivo imágenes de cierre de membrana en células de pacientes dysferlinopathy después de la ablación láser de dos fotones.

Ensayo de reparación de membrana de la célula utilizando un microscopio de dos fotones láser

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

El método de punción termoplasmónica integra microscopía confocal, pinzas ópticas y nanopartículas de oro para estudiar las respuestas de las proteínas durante la reparación de la membrana plasmática en células y vesículas unilamelares gigantes. La técnica permite la punción rápida y localizada de la membrana, lo que permite la identificación de proteínas clave y sus funciones en la intrincada maquinaria de reparación de la membrana plasmática.

Un enfoque termoplasmónico para investigar la reparación de la membrana plasmática en células vivas y membranas modelo

Aprende a observar la reparación de células lesionadas mediante tinciones fluorescentes y análisis de la exocitosis lisosomal. Este protocolo permite estudiar los mecanismos de respuesta a lesiones en la membrana celular.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

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