Name: Recopilación y análisis de Arabidopsis Floema exudados mediante el método de EDTA-facilitado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende a recopilar exudados de floema en Arabidopsis mediante el método facilitado por EDTA. Esta técnica permite analizar metabolitos, proteínas y ARN para estudiar la señalización vegetal.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de subvención NSF-IOS Nacional N º 1144391 de SHB.

1. Preparación de Plantas <ol><li> Semillas de Arabidopsis se pueden germinaron directamente en el suelo o sobre placas de MS. Cultivar las plantas de cuatro a seis semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperíodo de 12 horas (22 ° C el día, 15 ° C la noche 14). Las plantas de agua una o dos veces a la semana. Utilice la bandeja inferior para riego; qué no plantas de agua desde la parte superior, permiten que las bandejas que se seque antes de volver a regar. Asegúrese de que las plantas estén bien hidratados en el momento de la cosecha. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones y platos <ol><li> K-EDTA solución 2: Haga una mM K 2-EDTA solución solución de 100 acciones, que se puede guardar en el refrigerador. En el día de la recogida, se diluye la solución de un solo a cinco (una solución de EDTA parte, cuatro partes de agua) para obtener una solución de 20 mM de K 2-EDTA. </li><li> Llene un vaso o una placa de Petri (diámetro de 7-15 cm) hasta la mitad con la solución de 20 mM K 2-EDTA. Si la recogida de muestras de diferentes tratamientos (por ejun amplio control y las plantas de sal estrés o diferentes genotipos), preparan platos separados para cada tratamiento. </li><li> Llenar número deseado de tubos de reacción de 1,7 ml con 1,4 ml de solución de 20 mM de K 2-EDTA. Llenar un número igual de tubos de reacción con 1,4 ml de agua desionizada autoclave o Millipore. </li><li> Ponga toallas de papel en el banco para establecer plantas de, obtener una nueva hoja de afeitar y se puso los guantes. </li></ol> 3. Colección de floema exudados (Representado en el Diagrama de flujo en la Figura 1) <ol><li> Cosechar las hojas de roseta de cuatro a seis semanas de edad, las plantas cortándolos con la hoja de afeitar en la base del pecíolo cerca del centro de la roseta. </li><li> Coloque inmediatamente las hojas de los platos que contienen 20 mM K 2-EDTA. Asegúrese de que el extremo cortado del peciolo se sumerge en la solución (Figura 2). </li><li> Una vez que se han recogido 15 hojas (aproximadamente tres y cincuenta y siete plantas), la pila con cuidado las hojas en la parte superior de uno al otro como tsombrero pecíolos el corte están alineados uno con el otro. Volver a cortar la base de los pecíolos (ca. 1 mm) y transferir inmediatamente las hojas en uno de los tubos de reacción con la solución de 20 mM de K 2-EDTA. Las hojas se ajustan más fácil si están ligeramente enrolladas. Evite apretar las hojas en ya que esto puede causar lesiones de las células y, por lo tanto, conduce a la colección del extendido de la hoja. </li><li> Si se necesita más material, cubra suavemente las muestras con una toalla de papel húmeda. Utilice un nuevo conjunto de platos, si para la recogida de muestras de diferentes tratamientos o genotipos. </li><li> Una vez que todas las muestras se colocan en tubos de reacción, recoger los exudados, ya sea en la oscuridad o en la luz. </li><li> Para la recogida en la oscuridad, la línea del piso de un gran plato hondo con toallas de papel mojadas. Coloque el bastidor con los tubos de reacción de hojas llenas en el plato y bien cubierta con toallas de papel húmedo o poner en una parte trasera de plástico negro con aberturas de aireación. Toda la instalación en un armario o una habitación oscura. </li><li> Para la recolección de la luz, cubrir el fondo de un recipiente de plexiglás transparente con toallas de papel mojadas. Coloque el bastidor con los tubos de reacción de hojas llenas en el recipiente y cerrarlo. </li><li> Después de 1 hora, quitar las hojas con cuidado desde el contenedor y los tubos de reacción y lavar a fondo con agua destilada, desionizada o Millipore para eliminar todo el EDTA. Este paso sirve para tres propósitos: (1) que elimina el EDTA para minimizar el daño a las células, (2) que elimina la interferencia de EDTA con SDS-PAGE y cromatografía, y (3) elimina los compuestos que se han acumulado a partir de corte / dañado las células. Transferir inmediatamente a los tubos de reacción preparados que contienen agua tratada en autoclave y volver a los contenedores de recogida humedecidas para la recogida de exudados. En este punto, añadir inhibidor de RNasa si el exudado necesita ser utilizado para la extracción de ARN. Opcional: inhibidor de la proteinasa puede ser añadido si se desea el análisis de proteínas. </li><li> Después de la hora de recogida previsto, sacar y discaª las hojas y congelar los exudados del floema en N2 líquido para su uso posterior. Si se necesita un almacenamiento prolongado, liofilizar las muestras y almacenar a -80 ° C. </li><li> En el caso de Arabidopsis, ya metabolitos pueden ser detectados después de la recogida de exudados durante 1 hora. Sin embargo, la colección de 5-8 horas es aconsejable si se prevé el análisis de los componentes menos abundantes. Para las plantas más grandes como Perilla, se recomiendan tiempos de recogida más largos (8 h). Exudado recogido de 15 hojas es normalmente suficiente para un carril en un gel de SDS-PAGE (proteínas), para la extracción de ARNm, GC-MS (azúcares y metabolitos). Para el análisis de los lípidos de la puesta en común de 2-3 muestras (exudado 30-45 hojas) se recomienda y conduce a resultados más claros. </li></ol> 4. Análisis posteriores (para vídeo sólo mostramos 4.4) <ol><li> Para el análisis de proteínas, muestra de resuspender en 15 l de agua y 30 l tampón Lämmli, calentar a 95 ° C durante 5 min, girar rápidamente por cualquier precipitates y cargar totalidad de la muestra en un gel de SDS-PAGE (45 bolsillos de carga l). Las muestras se tiñeron con Coomassie coloidal u otras manchas sensibles desde la abundancia de proteínas es muy bajo. </li><li> Para el azúcar y el análisis de metabolitos pequeña, añadir agentes de derivatización de la muestra seca como se describe en la literatura 14. </li><li> ARNm puede ser analizada mediante RT-PCR, el análisis de microarrays o ARN-Seq. </li><li> Para el análisis de lípidos inmediatamente piscina dos y cincuenta y ocho muestras de partición y contra cloroformo: metanol (01:01) en la campana de humos de la siguiente manera: añadir una cantidad igual de cloroformo: metanol a cada muestra, de vórtice durante unos pocos segundos, y se centrifuga durante 4 min a 400 x g. Recoger la fase inferior (orgánica) en un tubo de vidrio con tapa de teflón y la partición de repetición con la fase superior tres veces más. Se secan las fases orgánicas reunidas bajo una corriente de N 2 y someter a análisis adicional (cromatografía en capa fina: TLC 14, 37; cromatografía líquida espectrometría de masa: LC-MS 14). </li></ol>

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<li>Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolome+and+proteome+suggest+functional+independence+of+dual+phloem+transport+systems+in+cucurbits%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits.</a> PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).</li>
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<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phloem-Delivered+RNA+Pool+Contains+Small+Noncoding+RNAs+and+Interferes+with+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation.</a> Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

La colección de EDTA-facilitado de floema exudados es muy simple, necesita un mínimo de equipo, y es aplicable a la mayoría de las plantas. En general, este método se extiende a la capacidad de analizar exudados del floema de más especies. A pesar de que el exudado se diluye, que es fácil de recoger muchas muestras diferentes o de muchas plantas a escala hasta una gran cantidad de material. Esto entonces permite la detección de nuevos compuestos que se encuentran en muy baja abundancia y de otro modo se pasan por alto. Este método puede ser utilizado para múltiples especies de plantas y funciona como se describe para los que se enumeran en este manuscrito. Si se exploran nuevas especies, los dos aspectos que podrían necesitar modificaciones son el número de hojas utilizadas y el tiempo de la exudación. En la mayoría de los casos, una hora exudación siete y cincuenta y cinco debe ser adecuado. Para confirmar el uso de este método para una nueva especie vegetal, exudado necesita ser recopilada y uno o más de los análisis posterior tal como se describe en el protocolo de la parte 4 nECESIDADES a realizar. Dependiendo de la intensidad de la señal observada, puede necesitar ser reducido hasta el volumen de recogida. En general, los lípidos y análisis de proteínas se requieren más material que el análisis de azúcar y el metabolito ya que los primeros son menos abundantes en los exudados del floema. Debido a que el exudado de la colección de EDTA-facilitado consiste en superficies de corte, así como un efecto potencialmente dañino de EDTA, varios puntos tienen que ser considerados: (1) después de la una hora de incubación con EDTA, los pecíolos tienen que ser lavado a fondo. Esto elimina cualquiera de los compuestos obtenidos a partir de células heridos, así como el propio EDTA, lo que podría dañar las células o interferir con la extracción. (2) Los controles positivos y negativos deben ser incluidos para asegurar que los datos obtenidos se derivan de la savia del floema y no de las células dañadas (ver pasos críticos a continuación). (3) savia del floema contiene varias enzimas, que podrían ser activa durante la recogida de exudado. Por lo tanto, en algunos casos, puede ser útil para recoger FOr diferentes cantidades de tiempo. (4) Dado que el método implicaba exudación en agua, una cuantificación absoluta de los compuestos no es posible. Los pasos críticos: La clave para el uso exitoso de este método es el uso de precauciones durante la manipulación de la muestra no debe dañar a las células, así como el uso de controles apropiados (véase la referencia 14.). Un control adecuado es la colección de exudados del floema sin tratamiento previo con EDTA. En este caso, el floema sellará en sí y no hay exudado puede ser recogido. Cualquier compuestos contaminantes procedentes de las células heridos serán detectados aquí. Un segundo control sería el análisis de los azúcares en el exudado. En Arabidopsis, sacarosa debe ser el metabolito predominante dentro de la savia del floema, con fructosa a la relación de sacarosa de 01:04-01:08 (ref 8, 14). Para la extracción de ARN es necesario el uso de un inhibidor de RNAsa. Además, un control positivo de los anteriormente describiendoed ARNm floema-localizada (UBC9: enzima de conjugación de ubiquitina 9, At4g27960; 8, 14) y un control negativo de por ejemplo un ARNm cloroplasto (Rubisco LSU) son aconsejables. Debido a que el exudado contiene enzimas activas, un curso de tiempo se aconseja para asegurar que los cambios en el perfil de floema no son simplemente debido a las variaciones en el tiempo de recogida. En algunos casos, puede ser beneficioso utilizar inhibidores de proteinasas. Sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta, que el exudado recogido se concentra y que los compuestos añadidos se concentran en gran medida. Un segundo paso crítico en el protocolo es el recutting del pecíolo bajo EDTA. Este paso tiene un doble propósito: en primer lugar, que elimina cualquier placa de tamiz sellados mientras que la prevención de la formación de nuevas bujías permitiendo así la libre circulación de la savia del floema. En segundo lugar, se elimina la burbuja de cavitación en el xilema generado durante el corte y por lo tanto permite el transporte xilema. El tamaño de la segunda corte dependes de las plantas utilizadas. En las plantas con pecíolos más grandes que debería ser de varios milímetros (hasta 1 cm) por encima del primer corte, en plantas como Arabidopsis, 1-2 mm son suficientes. El uso de este método puede conducir al descubrimiento de nuevos compuestos en los exudados del floema que podría haber de señalización, consecuencias para el desarrollo o biomédica. Se ha impulsado una mirada más profunda a la señalización de lípidos de larga distancia, que era un campo poco estudiado dentro de la ciencia de la planta debido a la falta de acceso al floema.

Las plantas no pueden moverse para escapar de condiciones adversas. Por lo tanto, tuvieron que desarrollar mecanismos para detectar el estrés ambiental, obtener y transmitir una señal relacionada con toda la planta, y ajustar en consecuencia el desarrollo. Existen dos sistemas de transporte para la distribución de agua, nutrientes y otros compuestos (señalización). El primero es el xilema; que normalmente transporta agua y minerales absorbidos por las raíces en toda la planta. El segundo es el floema. La vista de la floema ha cambiado de un sistema de transporte asimilar sencilla a un conducto para el ARN, proteínas, virus, lípidos y otras moléculas pequeñas. Desempeña un papel importante en la asimilación y transporte de nutrientes, la respuesta al estrés biótico y abiótico, así como en el crecimiento y desarrollo de plantas. Ahora se llama la &quot;supercarretera de la información&quot; de la planta 18. El floema se compone de varios tipos de células: parénquima del floema, así como compañero especializada ceLLS y elementos de tamiz. El elemento de tamiz es el sitio del movimiento de larga distancia. Para permitir el flujo sin obstáculos longitudinal, elementos de tamiz están perdiendo la mayoría de los orgánulos, así como núcleos y se cree que contienen en el mejor de una maquinaria de traducción limitada 21, 33. Se cree que las células de compañía sintetizan proteínas y otros compuestos, que viajan en la corriente de floema. Estos compuestos son entonces transportados en el elemento de tamiz a través de los plasmodesmos y pueden funcionar como señales de larga distancia 4,16. Varios grupos de compuestos se pueden encontrar en los exudados del floema: <ul><li> Los azúcares son con frecuencia los productos de la fotosíntesis y son transportados como &quot;portadora de energía&quot; moléculas a otras partes de la planta para el almacenamiento o como bloques de construcción. Sin embargo, también pueden funcionar como anticongelante o como compuestos de señalización. </li><li> Las proteínas también se pueden encontrar en los exudados del floema. Ellos incluyen enzimas metabólicas, sino también tener una función de señalización. Una exampLe de una proteína que sirve como una señal de desarrollo es la proteína T locus de floración, lo que indica la inducción de la floración, así como abscisión de las hojas en las plantas de temporada. 6 </li><li> Los ácidos nucleicos que están presentes en los exudados del floema en forma de ARNm, ARN pequeños y micro, y ARN virales. Ellos parecen estar implicadas en gran medida en la señalización 27, 28, 39. Al mismo tiempo, ARNr y ARNt para casi todos los aminoácidos se han observado en la savia del floema de las cucurbitáceas 42. Parecen ser transferida selectivamente en el sistema de tubo de tamiz. Los ARNt muestran modificaciones necesarias para la capacidad de transferencia de aminoácidos para el aparato de traducción. Sin embargo, en lugar de participar en la traducción, que parecen inhibir este proceso. Alternativamente, podrían servir como una fuente de citoquinina o señalar el estado metabólico de la planta 42. </li><li> Los ácidos grasos, Oxylipins, y otros lípidos también se han encontrado en el floema exudados 3, 13, 14, 23. Jasmoácido NIC, un oxylipin mueve a través del floema como parte de la respuesta a la infección por patógenos 22, 29, 31, 32. Mientras que el papel de la mayoría de los lípidos del floema todavía no está claro, algunos de ellos probablemente tienen una función de señalización 4. </li></ul> El desafío en el trabajo con el floema de plantas reside en su capacidad para sellar heridas a sí mismo. Hay cuatro métodos principales que se utilizan para recoger exudados del floema, sin embargo, sólo funcionan en especies seleccionadas: 1) En cucurbitáceas es posible obtener cantidades razonables de floema exudado a través de recortes de la pecíolo. Una vez que la caída inicial con la contaminación de las células lesionadas se retira, es posible obtener cantidades razonablemente grandes de pura savia del floema 1, 15. Sin embargo, con el aumento de tiempo de recogida, este exudado se espesa, por lo que es cada vez más inadecuados para enfoques de cromatografía de líquidos (no publicado). Publicaciones recientes sugieren, que dependiendo de la especie, esta savia del floema se deriva de either la fascicular (FP) o la extrafascicular floema (PE) y que, mientras que sí contiene &quot;móvil&quot; savia del floema de los elementos de tamiz (FP), que también es propenso a la contaminación de otros tipos de células, incluyendo el xilema 40, 41 . 2) Un segundo enfoque es el de obtener savia del floema a través de cortes poco profundos o punciones en tallo o pecíolo. Este método ha sido utilizado con éxito en altramuz 17, 25, 36 cucurbitáceas, y Brassica napus 12. Aquí la contaminación de las células lesionadas es mínimo y los exudados muy puro. Sin embargo, las plantas necesitan para estar sanos y bien regada, ya que es muy difícil para perforar selectivamente sólo los elementos cribosos. Si están mellados vasos del xilema, todos exudado es arrastrado en el flujo de xilema. Esto hace que el método adecuado para plantas con pecíolos o tallos muy frágiles o altamente lignificada. 3) stylectomy áfidos pulgones permite insertar su estilete en los elementos cribosos deln retirar el pulgón con un láser. Savia del floema es exudada a través de la restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. En teoría, cualquier planta que puede ser infectado por los áfidos se puede utilizar para este enfoque. Sin embargo, la mayoría de invernadero o administradores de cámara de crecimiento no apoyará el uso de un agente patógeno. Además, los áfidos introducen varias proteínas en el floema con su saliva 19, 33. Esto conduce a una reprogramación transcripcional limitada 30 y tiene el potencial de cambiar la composición del floema 26. 4) El método descrito aquí es la exudación EDTA-facilitado de savia del floema. Este método emplea EDTA para evitar la obturación del floema 20. EDTA quelatos de iones Ca 2 + que participarían de otra manera en los procesos que sellan el floema. Mientras que el EDTA puede conducir a daño celular 30, varios grupos han utilizado este método y se observó ningún efecto adverso de las concentraciones de EDTA de 10 mM a 20 mM sobre la ultraestructura de células o en phloem carga y transporte 5, 24. Para reducir cualquier efecto perjudicial así como la interferencia de EDTA con cromatografía y electroforesis en gel, las plantas se mueven en el agua después de 1 h, y sólo la parte posterior de la exudado se utiliza 14. Por lo tanto, en lugar de exudación en EDTA, floema se exudados en agua (EDTA-facilitado exudación). Se trata de un sencillo, de bajo costo y baja tecnología, método para la recogida de exudados del floema. Savia del floema obtenidos de este modo se puede utilizar para analizar las proteínas, moléculas pequeñas, lípidos, y ARN y se ha utilizado con éxito en muchas plantas. Si bien una cantidad limitada de experimentos se ha realizado en monocotiledóneas 11, el método parece ser más adecuado para las dicotiledóneas (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, álamo 7). Colección de exudados tiene que ocurrir en un ambiente húmedo para evitar la pérdida de exudados a través de la transpiración. Dependiendo de la planta, la incubación en EDTA durante una a dos horas essuficiente para evitar el sellado de los elementos del floema / tamiz. La colección, entonces puede ocurrir en agua. Esto tiene la ventaja de evitar el efecto negativo de EDTA tiene en la estructura celular y la estabilidad. También elimina la interferencia de EDTA con métodos como HPLC o SDS-PAGE. Se muestra como se aplica a Arabidopsis. Para las plantas más grandes, la incubación en EDTA y exudado colecciones tiene que ser ampliado y se realiza en vasos y no en tubos de reacción de 1,7 ml.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidrio o plástico poco profunda (7-15 cm)</td><td>PYREX o Corning</td><td></td><td>Cualquier plato limpio y poco profundo funcionará</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Solo recipientes abiertos en campana extractora</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos con tapón de rosca</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos con tapón de rosca</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

recopilación y análisis de<em&gt; arabidopsis</em&gt; floema exudados mediante el método de edta-facilitado

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

El floema de plantas es esencial para el transporte de larga distancia (foto-) asimila, así como de transmitir señales de estrés biótico o abiótico. Contiene azúcares, aminoácidos, proteínas, ARN, lípidos y otros metabolitos. Aunque hay un gran interés en la comprensión de la composición y la función del floema, el papel de muchas de estas moléculas y, por tanto, su importancia en el desarrollo de la planta y la respuesta de estrés aún no se ha determinado. Una barrera para el análisis de floema radica en el hecho de que los propios sellos del floema sobre hiriendo. Como resultado, el número de plantas de las que savia del floema puede obtenerse es limitada. Un método que permite la recogida de exudados del floema a partir de varias especies de plantas sin el equipo añadido es la colección de EDTA facilitado por floema exudado se describe aquí. Si bien es fácil de usar, que hace lugar a las heridas de las células y el cuidado tiene que ser tomado para eliminar contenidos de las células dañadas. Además, varios controles para demostrar la pureza del exudadoson necesarios. Debido a que es una exudación en lugar de una colección directa de la savia del floema (no es posible en muchas especies) sólo cuantificación relativa de sus contenidos puede ocurrir. La ventaja de este método sobre los demás es que puede ser utilizado en muchas especies de plantas herbáceas o leñosas (Perilla, Arabidopsis, álamo, etc) y requiere un mínimo de equipo y la formación. Esto conduce a cantidades razonablemente grandes de exudados que pueden ser utilizados para el análisis posterior de proteínas, azúcares, lípidos, ARN, virus y metabolitos. Es bastante simple que se puede utilizar en una parte de investigación, así como en un laboratorio de enseñanza.

Se ha hecho evidente en los últimos años que la complejidad de la savia del floema puede ser la respuesta a la pregunta de cómo las plantas envían señales que varían en el desarrollo y el estrés de respuesta óptima. El uso de EDTA facilitado exudación floema puede proporcionar la oportunidad de analizar los exudados del floema de las plantas que no son adecuadas para otros enfoques, pero puede ser de interés económico o fisiológico. Este método permite la cosecha de floema exudados suficiente para identificar las proteínas floema-localizados y detectar cambios en su nivel en respuesta al desarrollo o el estrés (Figura 3). Como muestra la figura, las proteínas se encuentran en muy baja abundancia, sin embargo, su nivel es lo suficientemente alto como para proteómica experimentos posteriores utilizando LC-MS/MS o para el análisis de Western blot. Los hallazgos en cucurbitáceas sugieren que el corte del vástago conduce a una ruptura del equilibrio potencial de agua y una afluencia posterior de agua yposibles contaminantes desde el apoplasto 41. Sin embargo, para los tiempos de recogida que van desde una a ocho horas no afecta el perfil floema proteína / composición en Arabidopsis (. Sólo la cantidad absoluta varía Guelette et al), la cantidad de proteína recogida y el patrón de proteínas que se encuentran varía entre las especies (Arabidopsis: A, Perilla, carril I y NI) y tratamientos (Perilla cultiva en diferentes longitudes de día, carril I y NI). Como resultado, las señales proteicas se pueden visualizar, identificados y seguidos. ARNm y micro ARN también se pueden identificar en los exudados del floema por este método. Sin embargo, el tratamiento con inhibidor de ARNasa es necesario para prevenir la degradación del ARNm durante el tiempo exudación extendida. Puesto que los elementos de tamiz no contienen cloroplastos funcionales, pequeña de Rubisco o subunidad grande (glóbulos rojos o rbcL, respectivamente) los ARNm pueden utilizarse como controles negativos, mientras que conocida floema-Localizada ARNm como enzima de conjugación de ubiquitina puede ser utilizado como un control positivo (Figura 4). Del mismo modo, azúcares o pequeñas metabolitos pueden ser analizados utilizando GC-MS o LC-MS. Aquí se debe mencionar que los exudados del floema contienen un gran número de enzimas funcionales, incluyendo casi la totalidad de la vía glucolítica 12. Por lo tanto, el uso de varios puntos de tiempo puede revelar procesos metabólicos durante la recogida de exudado. Un ejemplo se muestra en la Figura 5: En todos los exudados, la sacarosa es el metabolito más abundante, lo que es más evidente después de una colección durante 1 hora. Sin embargo, después de cinco horas, la relación de sacarosa a fructosa se reduce ligeramente. Si el exudado de la misma se recoge durante una hora y se dejó en el banco para los siguientes cuatro horas, la relación de sacarosa a fructosa se reduce en un grado mucho mayor, lo que sugiere que las enzimas activas en el floema exudados conducen a una degradación de la sacarosa a temperatura ambientetura (para más interpretaciones pico ver 14). Esto es consistente con los hallazgos que floema carga y el transporte de moléculas a partir de células acompañantes en los elementos de tamiz pueden continuar durante exudación hasta que el sistema pierde su vitalidad 34. Los lípidos en los exudados del floema y, por extensión, de señalización de lípidos de larga distancia son un campo relativamente reciente de interés en la ciencia de las plantas. Debido a sus lípidos naturaleza hidrófoba sólo están presentes en bajas concentraciones y se puede unir a otras moléculas para la solubilización. Sin embargo, la exudación de EDTA-facilitado permite la colección de material suficiente para visualizar (TLC; Figura 6) e identificar (LC-MS; Figura 7) los lípidos del floema de varias especies de plantas. Como muestra la figura, es posible identificar y separar varias especies de lípidos. LC-MS permite identificar las diferentes especies de lípidos y para monitorear los cambios en el perfil lipídico de diferegenotipos nt o tratamientos. Esto permite el estudio del papel de los lípidos durante el desarrollo de la planta y la respuesta al estrés. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Diagrama de flujo de la colección de floema exudados de Arabidopsis o Perilla. Diferentes caminos conducen a diferentes productos finales, que se indican en azul. Para la preparación de ARN, inhibidor de ARNasa (100 U / ml, Roche) se añade al agua en la que se recoge el exudado floema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Configuración de los materiales de floema exudado recogerde iones. La instalación muestra todos los materiales necesarios para los pasos del protocolo 3.1 a 3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 Proteínas que se encuentran en el floema exudados de dos especies diferentes de plantas de Arabidopsis, (A) y (I Perilla y NI; diferentes longitudes días); MW: marcador de peso molecular (carril 2). Las proteínas se separaron usando un gradiente de 10-20% de SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Análisisde la presencia de ARNm para la pequeña de Rubisco y la subunidad grande (los glóbulos rojos y rbcL, respectivamente) y la enzima de conjugación de ubiquitina (UBC). ARNm se recogió a partir de hojas de Arabidopsis (L), pecíolos (P), y los exudados del floema (Ph), revertir transcripciones transcritas y específica visualizaron utilizando PCR. La figura fue modificado a partir Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Perfil de GC-MS del floema exudados recogidos para diversa cantidad de veces. Tenga en cuenta cómo la cantidad relativa de los cambios de sacarosa a partir de 1 hora de recogida (A) a 5 horas de tiempo de recogida (B). Exudado perfil después de la recolección durante 1 hora seguido de &quot;incubación&quot; en la sala<html> temperatura (RT) durante cuatro horas (C). Hoja perfil de metabolito (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Cromatograma en capa fina comparando los lípidos de Perilla (izquierda) y hojas de Arabidopsis (derecha) y exudados del floema. Los asteriscos indican los lípidos específicos para exudados del floema. DGDG: digalactosildiacilglicerol; PG: fosfatidilglicerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; La parte de la figura mostrando lípidos Arabidopsis ha sido modificado desde Guelette et al 14.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. Perfil lipídico de floema exudados de Arabidopsis (cloroformo fase) utilizando LC-MS / modo de iones negativos. Los gráficos en la parte superior (mutante, A) y la parte inferior (de tipo salvaje, B) muestran las diferencias en los perfiles de lípidos entre los dos genotipos diferentes (indicadas por flechas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado.

Recopilación y análisis de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exudados mediante el método de EDTA-facilitado

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

El objetivo general de este procedimiento es recolectar el exudado floemático de Arabidopsis u otras plantas para analizar su contenido o confirmar la presencia de compuestos dentro del flujo floemático. Esto se logra primero cortando e incubando el pétalo en EDTA potásico para evitar el sellado del elemento criboso. El segundo paso consiste en lavar completamente el pétalo para eliminar cualquier resto de EDTA que pueda interferir con el análisis posterior y también dañar las células durante exposiciones prolongadas.A continuación, los exudados de flujo EM se recogen en agua. Aquí, el paso final consiste en preparar las muestras para su posterior análisis mediante gel L-C-M-S-G-C-M-S, electroforesis y cromatografía en capa fina. En definitiva, la exudación de fém facilitada por EDTA puede utilizarse para analizar y confirmar los contenidos de fém, como metabolitos y lípidos, proteínas o ARN.Las plantas no pueden escapar de las condiciones adversas. Como resultado, necesitan sistemas muy eficientes y rápidos para transmitir señales ambientales a través de toda la planta y responder modificando su desarrollo. Una de estas vías de señalización es el flujo vegetal, cuya composición es bastante compleja de comprender.Utilizamos la sedación con flujo facilitado por EDTA para la recolección y análisis del contenido del flujo. Fue desarrollada originalmente en Perilla por King, pero puede modificarse fácilmente para otras especies. Demostrando el procedimiento estarán Elena y US, ambos estudiantes universitarios de mi laboratorio antes de comenzar este procedimiento.Cultive plantas de Arabidopsis durante cuatro a seis semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperiodo de 12 horas hasta el día de la recolección. Diluya con agua la solución de EDTA potásico 100 milimolar previamente preparada para obtener una concentración final de 20 milimolar. A continuación, llene hasta la mitad dos platos de vidrio de siete a 15 centímetros de diámetro con la solución de EDTA potásico 20 milimolar.Una vez finalizado, llene tubos de reacción de 1,7 mililitros con 1,4 mililitros de la solución de EDTA potásico 20 milimolar. Luego, llene un número igual de tubos de reacción con 1,4 mililitros de agua milipore. Después de retirar las plantas de cuatro a seis semanas de edad de las cámaras de crecimiento, recolecte las hojas de la roseta cortándolas con una hoja de afeitar en la base del pétalo, cerca del centro de la roseta.Coloque inmediatamente las hojas en los recipientes que contienen EDTA de potasio 20 milimolar, con el extremo cortado de los pecíolos sumergido en la solución. Una vez que se hayan recolectado 15 hojas de tres a cuatro plantas, colóquelas cuidadosamente una encima de la otra de modo que los extremos cortados de los pecíolos queden alineados entre sí. Vuelva a cortar la base de los pecíolos y enrolle suavemente las hojas.A continuación, inserte suavemente las hojas enrolladas en uno de los tubos de reacción que contienen EDTA de potasio 20 milimolar para la recolección del exudado. En la oscuridad, forre el fondo de un recipiente amplio y poco profundo con toallas de papel húmedas. Coloque el soporte con los tubos de reacción llenos de hojas en el recipiente y colóquelo dentro de una bolsa de plástico negro con hendiduras para la aireación.Luego, coloque todo el montaje en un gabinete para la recolección de exudado. En condiciones de luz, forre la base de un recipiente transparente de plexiglás con toallas de papel húmedas. Coloque la rejilla con los tubos de reacción llenos de hojas en el recipiente y ciérrelo.Después de retirar el bastidor del recipiente, una hora después, saque las hojas de los tubos de reacción. Lave bien las hojas con agua destilada para eliminar todo el EDTA. Transfiera inmediatamente las hojas a los tubos de reacción que contienen agua Millipore y devuélvalas a los recipientes humedecidos para la recolección de exudados tras la retirada del bastidor del recipiente humedecido.Cinco a ocho horas después, retire las hojas de los tubos, luego congele los exudados de flujo en nitrógeno líquido y almacénelos en un congelador a menos 80 grados Celsius. Para análisis posteriores al día siguiente, descongele las muestras en preparación para el análisis de lípidos. Luego tome dos o tres muestras y agregue una cantidad igual de cloroformo y metanol a la solución combinada.Vortex la mezcla durante unos segundos. A continuación, centrifugue la muestra durante cuatro minutos a 400 gs. Una vez finalizado, recoja la fase orgánica inferior en un tubo de vidrio tras repetir la partición con la fase superior tres veces más, seque las fases orgánicas combinadas bajo un flujo de nitrógeno y sométalas a cromatografía en capa fina y análisis por LCMS.Este método permite la obtención de exudados de floema suficientes para identificar las proteínas localizadas en el floema y los cambios en sus niveles en respuesta al desarrollo o al estrés. En algunos casos, los investigadores pueden desear utilizar inhibidores de proteinasas para prevenir la degradación de las proteínas. Como se muestra aquí, las proteínas se encuentran en muy baja abundancia, sin embargo sus niveles son lo suficientemente altos para experimentos proteómicos posteriores.El uso de LCMS o los hallazgos en análisis por inmunotransferencia en cucurbitáceas sugieren que el corte del TALLO conduce a una alteración del equilibrio del potencial hídrico y a una subsiguiente entrada de agua y posibles contaminantes desde el alast. Sin embargo, la recolección durante periodos que van desde una hasta ocho horas no afecta el perfil y la composición del flujo de proteína M en InOpSys. La cantidad de proteína recolectada y el patrón de proteínas encontradas varían entre especies y tratamientos.Como resultado, se pueden visualizar, identificar y seguir las señales proteicas. El ARNm y los microARN también pueden identificarse en los exudados flom mediante este método. Sin embargo, es necesario un tratamiento con inhibidores de ARN para prevenir la degradación del ARNm durante el tiempo prolongado de exudación.Dado que los elementos C no contienen cloroplastos funcionales, los ARNm de rubis, o de la subunidad pequeña o grande, pueden utilizarse como controles negativos, mientras que un ARNm localizado en el floema conocido, como el de la enzima conjugadora de ubiquitina, puede utilizarse como control positivo. De manera similar, los azúcares o metabolitos pequeños pueden analizarse mediante GCMS o LCMS. Cabe mencionar que los exudados del floema contienen un gran número de enzimas funcionales, incluyendo casi toda la vía glucolítica completa.Por lo tanto, el uso de varios puntos temporales puede revelar procesos metabólicos durante la recolección del exudado. En todos los exudados, la sacarosa es el metabolito más abundante. Esto es más evidente tras una recolección de una hora.Sin embargo, después de cinco horas, la relación entre sacarosa y fructosa se reduce ligeramente. Si se recoge el mismo exudado durante una hora y luego se deja sobre la bancada durante cuatro horas adicionales, la relación entre sacarosa y fructosa se reduce en una proporción mucho mayor, lo que sugiere que las enzimas activas en los exudados del floema provocan la degradación de la sacarosa a temperatura ambiente.Además, el hecho de que la recolección continua durante cinco horas muestre solo una ligera reducción en la relación sacarosa a fructosa es consistente con hallazgos que indican que la carga del floema y el transporte de moléculas desde las células acompañantes hacia los elementos del tubo criboso pueden continuar durante la exudación hasta que el sistema pierda su vitalidad. Los lípidos en los exudados del floema y, por extensión, la señalización lipídica de larga distancia, constituyen un campo de interés bastante reciente en la ciencia de plantas. Debido a su naturaleza hidrofóbica, los lípidos solo están presentes en bajas concentraciones y pueden estar unidos a otras moléculas para su solubilización.Sin embargo, la exudación facilitada por el EDTA permite la recolección de material suficiente para visualizar e identificar el flujo y los lípidos de varias especies vegetales. Como se muestra aquí, es posible separar varias especies de lípidos mediante cromatografía en capa fina. La LCMS permite identificar diferentes especies de lípidos y monitorear los cambios dentro de los perfiles de lípidos de distintos genotipos o tratamientos.Esto permite estudiar el papel de los lípidos durante el desarrollo vegetal y la respuesta al estrés. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tan solo tres horas si se lleva a cabo correctamente. Sin embargo, para la mayoría de las muestras, sugerimos un tiempo de recolección de cinco a ocho horas.En este caso, se recomienda comenzar temprano en la mañana con la cosecha de las hojas. Este procedimiento puede modificarse para otras plantas y puede conducir al descubrimiento o confirmación de compuestos de savia novedosos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar observar cuidadosamente los PDL después de la primera hora para eliminar el EDTA y no exprimir las hojas para evitar la contaminación con el contenido de otras células.Además, el uso de guantes también protege sus muestras frente a contaminantes que usted podría introducir desde su piel. Para prevenir la contaminación, utilice los controles apropiados para muestras de proteínas, ARN o metabolitos. Los controles sugeridos se enumeran en el protocolo escrito. Este método nos ha permitido obtener nuevas perspectivas sobre la composición del flujo vegetal.Fuimos capaces de identificar varios lípidos dentro del exudado de la forma, los cuales no se esperaban en el ambiente acuoso del suelo. Esto nos llevó a nosotros y a otros a introducir el concepto de señalización de larga distancia mediante lípidos, que ahora se ha desarrollado en un campo nuevo y prometedor de investigación de implantes.

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Investigación

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Biology

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Recopilación y análisis de

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