Recopilación y análisis de

El objetivo general de este procedimiento es recolectar el exudado floemático de Arabidopsis u otras plantas para analizar su contenido o confirmar la presencia de compuestos dentro del flujo floemático. Esto se logra primero cortando e incubando el pétalo en EDTA potásico para evitar el sellado del elemento criboso. El segundo paso consiste en lavar completamente el pétalo para eliminar cualquier resto de EDTA que pueda interferir con el análisis posterior y también dañar las células durante exposiciones prolongadas.

A continuación, los exudados de flujo EM se recogen en agua. Aquí, el paso final consiste en preparar las muestras para su posterior análisis mediante gel L-C-M-S-G-C-M-S, electroforesis y cromatografía en capa fina. En definitiva, la exudación de fém facilitada por EDTA puede utilizarse para analizar y confirmar los contenidos de fém, como metabolitos y lípidos, proteínas o ARN.

Las plantas no pueden escapar de las condiciones adversas. Como resultado, necesitan sistemas muy eficientes y rápidos para transmitir señales ambientales a través de toda la planta y responder modificando su desarrollo. Una de estas vías de señalización es el flujo vegetal, cuya composición es bastante compleja de comprender.

Utilizamos la sedación con flujo facilitado por EDTA para la recolección y análisis del contenido del flujo. Fue desarrollada originalmente en Perilla por King, pero puede modificarse fácilmente para otras especies. Demostrando el procedimiento estarán Elena y US, ambos estudiantes universitarios de mi laboratorio antes de comenzar este procedimiento.

Cultive plantas de Arabidopsis durante cuatro a seis semanas en cámaras de crecimiento con un fotoperiodo de 12 horas hasta el día de la recolección. Diluya con agua la solución de EDTA potásico 100 milimolar previamente preparada para obtener una concentración final de 20 milimolar. A continuación, llene hasta la mitad dos platos de vidrio de siete a 15 centímetros de diámetro con la solución de EDTA potásico 20 milimolar.

Una vez finalizado, llene tubos de reacción de 1,7 mililitros con 1,4 mililitros de la solución de EDTA potásico 20 milimolar. Luego, llene un número igual de tubos de reacción con 1,4 mililitros de agua milipore. Después de retirar las plantas de cuatro a seis semanas de edad de las cámaras de crecimiento, recolecte las hojas de la roseta cortándolas con una hoja de afeitar en la base del pétalo, cerca del centro de la roseta.

Coloque inmediatamente las hojas en los recipientes que contienen EDTA de potasio 20 milimolar, con el extremo cortado de los pecíolos sumergido en la solución. Una vez que se hayan recolectado 15 hojas de tres a cuatro plantas, colóquelas cuidadosamente una encima de la otra de modo que los extremos cortados de los pecíolos queden alineados entre sí. Vuelva a cortar la base de los pecíolos y enrolle suavemente las hojas.

A continuación, inserte suavemente las hojas enrolladas en uno de los tubos de reacción que contienen EDTA de potasio 20 milimolar para la recolección del exudado. En la oscuridad, forre el fondo de un recipiente amplio y poco profundo con toallas de papel húmedas. Coloque el soporte con los tubos de reacción llenos de hojas en el recipiente y colóquelo dentro de una bolsa de plástico negro con hendiduras para la aireación.

Luego, coloque todo el montaje en un gabinete para la recolección de exudado. En condiciones de luz, forre la base de un recipiente transparente de plexiglás con toallas de papel húmedas. Coloque la rejilla con los tubos de reacción llenos de hojas en el recipiente y ciérrelo.

Después de retirar el bastidor del recipiente, una hora después, saque las hojas de los tubos de reacción. Lave bien las hojas con agua destilada para eliminar todo el EDTA. Transfiera inmediatamente las hojas a los tubos de reacción que contienen agua Millipore y devuélvalas a los recipientes humedecidos para la recolección de exudados tras la retirada del bastidor del recipiente humedecido.

Cinco a ocho horas después, retire las hojas de los tubos, luego congele los exudados de flujo en nitrógeno líquido y almacénelos en un congelador a menos 80 grados Celsius. Para análisis posteriores al día siguiente, descongele las muestras en preparación para el análisis de lípidos. Luego tome dos o tres muestras y agregue una cantidad igual de cloroformo y metanol a la solución combinada.

Vortex la mezcla durante unos segundos. A continuación, centrifugue la muestra durante cuatro minutos a 400 gs. Una vez finalizado, recoja la fase orgánica inferior en un tubo de vidrio tras repetir la partición con la fase superior tres veces más, seque las fases orgánicas combinadas bajo un flujo de nitrógeno y sométalas a cromatografía en capa fina y análisis por LCMS.

Este método permite la obtención de exudados de floema suficientes para identificar las proteínas localizadas en el floema y los cambios en sus niveles en respuesta al desarrollo o al estrés. En algunos casos, los investigadores pueden desear utilizar inhibidores de proteinasas para prevenir la degradación de las proteínas. Como se muestra aquí, las proteínas se encuentran en muy baja abundancia, sin embargo sus niveles son lo suficientemente altos para experimentos proteómicos posteriores.

El uso de LCMS o los hallazgos en análisis por inmunotransferencia en cucurbitáceas sugieren que el corte del TALLO conduce a una alteración del equilibrio del potencial hídrico y a una subsiguiente entrada de agua y posibles contaminantes desde el alast. Sin embargo, la recolección durante periodos que van desde una hasta ocho horas no afecta el perfil y la composición del flujo de proteína M en InOpSys. La cantidad de proteína recolectada y el patrón de proteínas encontradas varían entre especies y tratamientos.

Como resultado, se pueden visualizar, identificar y seguir las señales proteicas. El ARNm y los microARN también pueden identificarse en los exudados flom mediante este método. Sin embargo, es necesario un tratamiento con inhibidores de ARN para prevenir la degradación del ARNm durante el tiempo prolongado de exudación.

Dado que los elementos C no contienen cloroplastos funcionales, los ARNm de rubis, o de la subunidad pequeña o grande, pueden utilizarse como controles negativos, mientras que un ARNm localizado en el floema conocido, como el de la enzima conjugadora de ubiquitina, puede utilizarse como control positivo. De manera similar, los azúcares o metabolitos pequeños pueden analizarse mediante GCMS o LCMS. Cabe mencionar que los exudados del floema contienen un gran número de enzimas funcionales, incluyendo casi toda la vía glucolítica completa.

Por lo tanto, el uso de varios puntos temporales puede revelar procesos metabólicos durante la recolección del exudado. En todos los exudados, la sacarosa es el metabolito más abundante. Esto es más evidente tras una recolección de una hora.

Sin embargo, después de cinco horas, la relación entre sacarosa y fructosa se reduce ligeramente. Si se recoge el mismo exudado durante una hora y luego se deja sobre la bancada durante cuatro horas adicionales, la relación entre sacarosa y fructosa se reduce en una proporción mucho mayor, lo que sugiere que las enzimas activas en los exudados del floema provocan la degradación de la sacarosa a temperatura ambiente.

Además, el hecho de que la recolección continua durante cinco horas muestre solo una ligera reducción en la relación sacarosa a fructosa es consistente con hallazgos que indican que la carga del floema y el transporte de moléculas desde las células acompañantes hacia los elementos del tubo criboso pueden continuar durante la exudación hasta que el sistema pierda su vitalidad. Los lípidos en los exudados del floema y, por extensión, la señalización lipídica de larga distancia, constituyen un campo de interés bastante reciente en la ciencia de plantas. Debido a su naturaleza hidrofóbica, los lípidos solo están presentes en bajas concentraciones y pueden estar unidos a otras moléculas para su solubilización.

Sin embargo, la exudación facilitada por el EDTA permite la recolección de material suficiente para visualizar e identificar el flujo y los lípidos de varias especies vegetales. Como se muestra aquí, es posible separar varias especies de lípidos mediante cromatografía en capa fina. La LCMS permite identificar diferentes especies de lípidos y monitorear los cambios dentro de los perfiles de lípidos de distintos genotipos o tratamientos.

Esto permite estudiar el papel de los lípidos durante el desarrollo vegetal y la respuesta al estrés. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tan solo tres horas si se lleva a cabo correctamente. Sin embargo, para la mayoría de las muestras, sugerimos un tiempo de recolección de cinco a ocho horas.

En este caso, se recomienda comenzar temprano en la mañana con la cosecha de las hojas. Este procedimiento puede modificarse para otras plantas y puede conducir al descubrimiento o confirmación de compuestos de savia novedosos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar observar cuidadosamente los PDL después de la primera hora para eliminar el EDTA y no exprimir las hojas para evitar la contaminación con el contenido de otras células.

Además, el uso de guantes también protege sus muestras frente a contaminantes que usted podría introducir desde su piel. Para prevenir la contaminación, utilice los controles apropiados para muestras de proteínas, ARN o metabolitos. Los controles sugeridos se enumeran en el protocolo escrito. Este método nos ha permitido obtener nuevas perspectivas sobre la composición del flujo vegetal.

Fuimos capaces de identificar varios lípidos dentro del exudado de la forma, los cuales no se esperaban en el ambiente acuoso del suelo. Esto nos llevó a nosotros y a otros a introducir el concepto de señalización de larga distancia mediante lípidos, que ahora se ha desarrollado en un campo nuevo y prometedor de investigación de implantes.