Recopilación y análisis de Arabidopsis Floema exudados mediante el método de EDTA-facilitado

El objetivo general de este procedimiento es recolectar exudado de Arabidopsis u otras plantas para analizar su contenido o confirmar la presencia de compuestos dentro de la corriente de flom. Esto se logra cortando e incubando primero el pétalo en EDTA de potasio para evitar el sellado del elemento marino. El segundo paso es lavar a fondo el pétalo para eliminar cualquier resto de EDTA que pueda interferir con el análisis posterior y también dañar las células durante la exposición a largo plazo.

A continuación, los exudados EM de flujo se recogen en agua. El paso final es preparar las muestras para su posterior análisis mediante gel L-C-M-S-G-C-M-S, electroforesis y cromatografía en capa fina. En última instancia, la exudación de phem facilitada por EDTA se puede utilizar para analizar y confirmar el contenido de phem como metabolitos y lípidos, proteínas o ARN.

Las plantas no pueden escapar de las condiciones adversas. Como resultado, requieren sistemas muy eficientes y rápidos para transmitir señales ambientales a través de las plantas y responder cambiando el desarrollo. Una de estas vías de señalización es el flujo de la planta, cuya composición es bastante compleja de entender.

Utilizamos la sedación de flujo facilitada por EDTA para la recolección y el análisis del contenido del flujo. Fue desarrollado originalmente en Perilla por el rey y puede ser fácilmente modificado para otras especies. Determinando el procedimiento estarán Elena y EE. UU., ambos estudiantes de pregrado de mi laboratorio, antes de comenzar este procedimiento.

Grow Arabidopsis planea de cuatro a seis semanas en cámaras de crecimiento con un período fotográfico de 12 horas el día de la recolección. Diluido previamente preparado 100 milimolar solución de EDTA potásico con agua para dar una concentración final de 20 milimolares. A continuación, llene dos platos de vidrio de siete a 15 centímetros de diámetro hasta la mitad con la solución de EDTA de potasio de 20 milimolares.

Cuando termine, llene los tubos de reacción de 1,7 mililitros con 1,4 mililitros de la solución de EDTA de potasio de 20 milimolares. A continuación, llene un número igual de tubos de reacción con 1,4 mililitros de agua miliporosa. Después de retirar las plantas de cuatro a seis semanas de edad de las cámaras de crecimiento, coseche las hojas de la roseta cortándolas con una cuchilla de afeitar en la base del pétalo cerca del centro de la roseta.

Coloque inmediatamente las hojas en los platos que contienen 20 milimolares de EDTA de potasio con el extremo cortado de la pérola sumergido en la solución. Una vez que se hayan recolectado 15 hojas de tres o cuatro plantas, apílelas suavemente una encima de la otra de modo que los pétalos cortados estén alineados entre sí. Vuelva a cortar la base de los pétalos y enrolle suavemente las hojas.

Después de esto, inserte suavemente las hojas enrolladas en uno de los tubos de reacción que contienen 20 milimolares de EDTA de potasio para la recolección del exudado. En la oscuridad, cubra el fondo de un plato grande y poco profundo con toallas de papel húmedas. Coloque la rejilla con los tubos de reacción llenos de hojas en el plato y colóquela en una bolsa de plástico negra con ranuras para aireación.

A continuación, coloque toda la configuración en un armario para la recogida del exudado. En la luz, cubra el fondo de un recipiente de plexiglás transparente con toallas de papel húmedas. Coloque la rejilla con los tubos de reacción llenos de hojas en el recipiente y ciérrelo.

Después de retirar la rejilla del recipiente, una hora después, saque las hojas de los tubos de reacción. Lave bien las hojas con agua destilada para eliminar todo el EDTA. Transfiera inmediatamente las hojas a los tubos de reacción que contienen agua de miliporos y devuélvalas a los recipientes humidificados para la recolección de exudados después de retirar la rejilla del recipiente humidificado.

De cinco a ocho horas después, saque las hojas de los tubos, luego congele los exudados del flujo en nitrógeno líquido y guárdelos en un congelador a menos 80 grados centígrados. Para un análisis adicional al día siguiente, descongele las muestras en preparación para el análisis de lípidos. A continuación, extraiga dos o tres muestras y añada una cantidad igual de cloroformo y metanol a la solución combinada.

Agita la mezcla durante unos segundos. A continuación, centrifugar la muestra durante cuatro minutos a 400 gs. Cuando termine, recoja la fase orgánica inferior en un tubo de vidrio después de repetir la partición con la fase superior, tres veces más, seque las fases orgánicas combinadas bajo una corriente de nitrógeno y sométalas a cromatografía en capa fina y análisis LCMS.

Este método permite la recolección de suficientes exudados de phem para identificar las proteínas localizadas en phem y los cambios en su nivel en respuesta al desarrollo o al estrés. En algunos casos, los investigadores pueden querer usar inhibidores de la proteinasa para prevenir la degradación de las proteínas. Como se muestra aquí, las proteínas son en muy baja abundancia, pero su nivel es lo suficientemente alto para experimentos proteómicos posteriores.

El uso de LCMS o para el análisis de Western blot en cucurbitáceas sugiere que el corte del STEM conduce a una interrupción del equilibrio del potencial hídrico y una posterior afluencia de agua y posibles contaminantes del alast. Sin embargo, la recolección durante tiempos que oscilan entre una y ocho horas no afecta el perfil y la composición de la proteína M del flujo. La cantidad de proteína recolectada y el patrón de proteínas encontradas varía según la especie y los tratamientos.

Como resultado, las señales de las proteínas pueden ser visualizadas, identificadas y seguidas, y los ARNm y microARN también pueden ser identificados en los exudados de flom por este método. Sin embargo, el tratamiento con inhibidores de ARN es necesario para prevenir la degradación de la RM. NA durante el tiempo de exudación prolongado.

Dado que los elementos C no contienen cloroplastos funcionales, los ARNm de subunidades pequeñas o grandes de rubis se pueden usar como controles negativos, mientras que los ARNm localizados de pH m, como la enzima conjugadora de ubiquitina, se pueden usar como control positivo. Del mismo modo, los azúcares o metabolitos pequeños se pueden analizar mediante GCMS o LCMS. Cabe mencionar que los exudados de phem contienen una gran cantidad de enzimas funcionales, incluida casi toda la vía glucolítica.

Por lo tanto, el uso de varios puntos de tiempo puede revelar procesos metabólicos durante la recolección de exudado. En todos los exudados, la sacarosa es el metabolito más abundante. Esto es más obvio después de una recolección durante una hora.

Sin embargo, después de cinco horas, la proporción de sacarosa a fructosa se reduce ligeramente. Si se recoge el mismo exudado durante una hora y luego se deja en el banco durante cuatro horas adicionales, la proporción de sacarosa a fructosa se reduce en una medida mucho mayor. Lo que sugiere que las enzimas activas en los exudados de phem conducen a la degradación de la sacarosa a temperatura ambiente.

Además, el hecho de que la recolección continua durante cinco horas muestre solo una ligera reducción en la proporción de sacarosa a fructosa es consistente con los hallazgos de que la carga de fema y el transporte de moléculas desde las células asociadas a los elementos marinos pueden continuar durante la exudación hasta que el sistema pierda su vitalidad. Los lípidos en los exudados de phem y, por extensión, la señalización lipídica a larga distancia son un campo de interés bastante reciente en la ciencia de las plantas. Debido a su naturaleza hidrofóbica, los lípidos solo están presentes en bajas concentraciones y pueden unirse a otras moléculas para su solubilización.

Sin embargo, la exudación facilitada por el EDTA permite la recolección de material suficiente para visualizar e identificar el flujo y los lípidos de varias especies de plantas. Como se muestra aquí, es posible separar varias especies de lípidos mediante cromatografía en capa fina. El LCMS permite identificar diferentes especies de lípidos y controlar los cambios en los perfiles lipídicos de diferentes genotipos o tratamientos.

Esto permite estudiar el papel de los lípidos durante el desarrollo de las plantas y la respuesta al estrés. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tan solo tres horas si se realiza correctamente. Sin embargo, para la mayoría de las muestras, sugeriríamos un tiempo de recolección de cinco a ocho horas.

En este caso, se recomienda comenzar la cosecha de hojas temprano en la mañana. Este procedimiento puede modificarse para otras plantas y puede conducir al descubrimiento o la confirmación de nuevos compuestos de flujo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar vigilar minuciosamente las PDL después de la primera hora para eliminar el EDTA y no apretar las hojas para evitar la contaminación con el contenido de otras células.

Además, el uso de guantes también protege sus muestras de los contaminantes que podría introducir desde su piel Para evitar la contaminación, utilice los controles adecuados para muestras de proteínas de ARN o metabolitos. Los controles sugeridos se enumeran en el protocolo de texto. Este método nos ha permitido obtener nuevos conocimientos sobre la composición del flujo de las plantas.

Pudimos identificar varios lípidos dentro del exudado de la forma, que no se esperaban en el ambiente acuoso del suelo. Esto nos llevó a nosotros y a otros a introducir el concepto de señalización lipídica a larga distancia, que ahora se ha convertido en una nueva y emocionante investigación de implantes en el campo.