Diseño y aplicación de un continuo

El objetivo general de este procedimiento es producir material vegetal altamente enriquecido en carbono 13 y nitrógeno 15 de manera uniforme en toda la planta o de forma diferencial en los tejidos estructurales y metabólicos. Esto se logra primero construyendo una cámara hermética para el crecimiento de plantas. El segundo paso consiste en controlar la temperatura, la humedad y los niveles de dióxido de carbono dentro de la cámara para mantener condiciones adecuadas de crecimiento para las plantas.

A continuación, las plantas se cultivan en una cámara sellada con aire que contiene 13 C, dióxido de carbono y riego y fertilización que contienen nitrógeno 15. El paso final consiste en interrumpir la marcación extrayendo las plantas marcadas diferencialmente de la cámara varias semanas antes de la cosecha, de modo que su material metabólico se enriquezca menos en carbono 13 y nitrógeno 15. En comparación con los componentes estructurales de la planta tras la cosecha del material vegetal, se utiliza la extracción con agua caliente y la espectrometría de masas con relación isotópica para medir la marcación isotópica global y las diferencias en la intensidad de la marcación.

La principal ventaja del marcado continuo frente a otros métodos, como la aplicación foliar o el marcado repetido en pulsos, es que produce material vegetal uniformemente marcado que puede ser diferencialmente marcado en sus componentes metabólicos o estructurales. Para comenzar este procedimiento, construya la cámara de marcado según se describe en el protocolo de texto adjunto, montando paredes de acrílico transparente de 3,18 milímetros de espesor y un techo de acrílico transparente de 6,35 milímetros de espesor sobre un marco de aluminio con un suelo de acero pintado de blanco; las dimensiones de la cámara pueden adaptarse para satisfacer necesidades específicas de crecimiento de plantas. La cámara mostrada aquí mide 1,2 por 2,4 por 3,6 metros y contiene 40 macetas de 15 litros; asegúrese de que la cámara sea hermética cubriendo todas las uniones con sellador de silicona adecuado.

Coloque la puerta sobre tornillos de máquina, que pueden atornillarse y desatornillarse utilizando tuercas mariposa extraíbles. Selle la puerta con cinta aislante para evitar fugas de aire en una zona directamente adyacente a la cámara de etiquetado. Monte el centro de control en el monitor y ajuste la temperatura, la humedad y el dióxido de carbono dentro de la cámara.

Asegúrese de que los cables eléctricos y las tuberías de gas que pasan al interior de la cámara estén bien sellados con silicona para evitar fugas de aire. Opcionalmente, agregue luces a la cámara para aumentar la penetración de luz y controlar la duración del día. Para regular la temperatura de la cámara, instale un acondicionador de aire comercial de tipo split, con las serpentinas del evaporador ubicadas dentro de la cámara y el compresor y las serpentinas del condensador ubicados fuera de la cámara para disipar el calor.

A continuación, instale un deshumidificador pequeño en la cámara. Perfore un orificio en el piso junto al deshumidificador, y pase el tubo de drenaje del deshumidificador a través del orificio y dentro de un frasco preparado con agua. Esto crea un sello hermético para el drenaje y permite la equilibración de presión E, regulando la humedad en la cámara mediante la conexión de un controlador programable, como una serie omega eye con un sensor de humedad, al fuego del deshumidificador.

Luego, instale un analizador de gases infrarrojos o ERA con una bomba de diafragma que extraiga continuamente aire de la cámara a través del ERA y lo devuelva a la cámara. Esto mantiene un sistema cerrado mientras se monitorea continuamente la concentración de dióxido de carbono en la cámara. A continuación, conecte dos tanques de gas de dióxido de carbono puro al sistema de control de dióxido de carbono.

Uno de los tanques debe contener dióxido de carbono con un 10 por ciento atómico de 13C o superior, y el otro debe contener dióxido de carbono con abundancia natural de 13C. Ajuste los reguladores de los tanques a 20 PSI después de insertar las válvulas solenoide en las líneas de gas para controlar las inyecciones de dióxido de carbono mediante el software Ergo.

Controle la apertura y cierre de las válvulas solenoides conectándolas al ER rga mediante un programa de relé de estado sólido, utilizando una alarma baja en el software ergas para activar la apertura de las válvulas solenoides cuando la concentración de dióxido de carbono en la cámara descienda por debajo de un valor determinado, y una banda muerta para cerrar las válvulas una vez que la concentración de dióxido de carbono alcance un punto de ajuste superior. Después de instalar las válvulas solenoides, coloque una válvula dosificadora en cada una de las líneas del tanque de gas y ajústelas cuidadosamente al nivel deseado de enriquecimiento con carbono 13 en la atmósfera.

Aquí utilizamos un enriquecimiento de carbono 13 al 4,4 por ciento atómico. Conecte las salidas juntas y finalmente dirija la tubería al centro de la cámara entre los ventiladores, lo que ayuda a distribuir el dióxido de carbono marcado de manera uniforme por toda la cámara para instalar el sistema de riego. Primero, cree un anillo de riego por goteo por maceta y pase el tubo de riego a través de un pequeño orificio hecho en la pared de la cámara hacia el exterior.

Luego, selle los orificios alrededor del tubo de irrigación con masilla de silicona para evitar fugas de aire en el exterior de la cámara. Conecte el tubo de irrigación al tubo de la bomba peristáltica y coloque una abrazadera de manguera pequeña para evitar fugas de aire entre riegos. Germe las semillas antes de plantarlas en macetas para asegurar su viabilidad e inocule las plántulas con una suspensión fresca de suelo. Para introducir microorganismos beneficiosos, llene las macetas con una mezcla de siembra libre de suelo para eliminar la introducción de carbono y nitrógeno no etiquetados provenientes del suelo.

Aquí utilizamos una mezcla de arena, vermiculita y una cerámica porosa de perfil. Una vez que las semillas han germinado, trasplante cuidadosamente las plántulas a las macetas con una cantidad mínima de sustrato. Luego, coloque las macetas en la cámara y conecte cada maceta a una manguera de riego individual.

Finalmente, cierre herméticamente la puerta de la cámara y elimine el dióxido de carbono externo conectando un depurador de cal sodada a la bomba de aire hasta que la concentración de dióxido de carbono disminuya al menos a 200-250 partes por millón. Antes de volver a llenar la cámara hasta 400 partes por millón, utilizando la mezcla del tanque de dióxido de carbono 13 C, intente mantener la cámara cerrada durante toda la duración de la temporada de crecimiento para minimizar la contaminación con dióxido de carbono de abundancia natural.

Primero etiquete una solución de fertilizante del tipo Hyland con nitrógeno 15 mezclando nitrato de potasio con 98 por ciento de átomos de nitrógeno 15 y nitrato de potasio con abundancia natural de nitrógeno 15, y luego agréguelo al resto de la solución Hookin. Aquí utilizamos una solución con siete por ciento de átomos de nitrógeno 15 para fertilizar. Use una bomba peristáltica para suministrar la solución de fertilizante marcada con nitrógeno 15 a través de los tubos de riego.

UNC sujete las mangueras de riego y aplique cantidades variables de fertilizante a las plantas individuales según la demanda y el diseño experimental. Luego, bombee agua a través de las mangueras para enjuagar el fertilizante de las mismas. La cantidad total de líquido agregado no debe superar la capacidad de retención de agua de las macetas, con el fin de minimizar el desperdicio de fertilizante.

Cierre la abrazadera, todas las mangueras después de la fertilización y el riego para eliminar fugas de aire en la cámara. Para la marcación diferencial de componentes estructurales y metabólicos, retire las plantas de la cámara de marcación de una a tres semanas antes de la cosecha. Mantenga las plantas que deben marcarse de manera uniforme dentro de la cámara hasta la cosecha.

Para inducir la senescencia, simplemente suspenda el riego cuando esté listo. Recolecte las plantas cortando primero la biomasa aérea.

Después de cosechar la biomasa aérea, vierta la mezcla de sustrato y las raíces sobre un tamiz de malla de seis milímetros para separar las raíces del sustrato. Luego, enjuague las raíces sobre un tamiz de dos milímetros para eliminar cualquier material de sustrato residual. Utilice pinzas según sea necesario para retirar cualquier resto de sustrato que pudiera haberse adherido a las raíces, y posteriormente permita que las raíces se sequen al aire en preparación para experimentos futuros.

Durante tres temporadas de crecimiento de funcionamiento, la cámara ha mantenido con éxito la temperatura entre 26 y 29 grados Celsius, la humedad entre 36 y 56 % y las concentraciones de dióxido de carbono entre 360 y 400 partes por millón, tal como se establecieron en el centro de control. Aquí se muestran resultados representativos de la temporada de crecimiento 2011 de Andra Pogon Girard di. El aumento de dióxido de carbono durante la respiración nocturna no parece dañar las plantas en crecimiento y se absorbe rápidamente después del amanecer.

La marcación con nitrógeno 15 mediante la solución Hogland al 7 % de nitrógeno 15 produjo material vegetal altamente marcado con un 6,7 % atómico de nitrógeno 15; una ligera dilución respecto a la marcación objetivo de nitrógeno 15 podría deberse a algo de nitrógeno de abundancia natural presente en la mezcla de macrolado o procedente de la inoculación con suelo nativo. La marcación con carbono 13 utilizando dióxido de carbono al 4,4 % atómico objetivo de 13C resultó en un 4,46 % atómico de carbono 13. A lo largo de toda la hojarasca del material vegetal uniformemente marcado, las plantas diferencialmente marcadas, que se retiraron de la cámara 7, 14 o 22 días antes de la cosecha, mostraron una diferencia significativa en carbono 13 y nitrógeno 15.

Contenido en componentes metabólicos obtenidos como extractos con agua caliente y componentes estructurales obtenidos como residuos del extracto con agua caliente, lo que indica una marcación diferencial de materiales vegetales metabólicos y estructurales. Tras su desarrollo, la marcación continua con doble isótopo ha allanado el camino para que investigadores en biogeoquímica exploren el destino y la transformación de componentes vegetales en el ambiente a escala macro y nano.