Name: La disección de Xenopus laevis Neural Crest para In vitro Explante cultura o In vivo Trasplante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a disecar la cresta neural de Xenopus laevis para estudios in vitro e in vivo. Este método permite investigar la migración celular y la diferenciación en biología del desarrollo.

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Los autores agradecen a Adeline Dolly por las fotos de explante de fibronectina, Eric Theveneau útil para los debates y el Fondo para los Animales del Instituto Curie. CM es un becario postdoctoral de la Región Ile de France (Domaine d&#39;Interet Majeur vástago Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d&#39;Enseignement et de Recherche) y la Agence Nationale de la Recherche. Este trabajo fue financiado por la Universite Paris Sud (Attractivite 2011), el Centre National de la Recherche Scientifique (Programa de Acción Thematique et incitativo sur), la Asociación pour la Recherche contre le cáncer de Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cáncer, y la Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programa Blanc).

Los experimentos cumplen con la reglamentación nacional y europea relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos y con los principios establecidos a nivel internacional de sustitución, reducción y refinamiento. 1. Preparación de platos recubiertos con fibronectina 14 <ol><li> Pipetear 500 ml de 10 mg / ml de fibronectina de grado cultivo diluido en 1x tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri estándar de plástico (Ø 40 x 11 mm). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Nota: si usa platos de cristal o cubreobjetos de vidrio para la imagen posterior, utilice una solución de fibronectina 100 mg / ml. </li><li> Enjuague tres veces con PBS 1x. </li><li> Reemplazar PBS con 500 ml de 1x PBS/0.1% albúmina de suero bovino (BSA). Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Enjuague tres veces con PBS 1x. </li><li> Llenar con 1x PBS y se mantenga a 4 ° C hasta su uso (por lo general de 24 a 48 h). </li></ol> 2. La disección de los explantes NC &lt;ol&gt; <li> Preparar 3/4 normal Anfibio Medio (NAM) (NaCl 110 mM, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM de NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamicina 10,15). No guardar más de 1 semana para la disección, se almacenan a 4 ° C. NAM Mayor se puede utilizar para la preparación de platos de disección de agarosa recubiertas con (abajo). </li><li> Preparar 60 mm placas de Petri para la disección, recubiertas con 10 ml de agarosa al 2% en 3/4 de NAM. </li><li> Recoger herramientas de disección: pipetas Pasteur de plástico, una mejor pasador de insecto montado sobre soporte de pasador (ver tabla materiales para la referencia), un &quot;cuchillo de la ceja&quot; (hecho con pelo de las cejas incrustado en parafina en la punta de una pipeta Pasteur de vidrio 16), dos fina pinza de disección, pipeta P1000 y consejos, un estereoscopio binocular con aumento de 8-40X y 50, una fuente de luz brillante con fibras ópticas guías. Todas las herramientas de disección deben mantenerse limpios, después de cada experimento, enjuagarlos dos veces con agua destilada, una vez with etanol al 100% y dejar secar. Almacene lejos del polvo. </li><li> Llene el plato de disección con NAM fresca casi hasta la cima. </li><li> Obtener X. laevis embriones de acuerdo con los procedimientos estándar 10 y ellos envejecer hasta que alcanzan Néurula etapa 16 (de acuerdo con Nieuwkoop y Faber mesa de desarrollo 17). </li><li> Coloque etapa 16 embriones en el plato de disección utilizando la pipeta Pasteur de plástico. </li><li> Llevar a cabo todos los pasos subsiguientes en el marco del alcance binocular. Retire la membrana vitelina con dos pares de pinzas. Tenga cuidado de no dañar la parte dorsal de los embriones. </li><li> Espere hasta que los embriones han llegado a la etapa 17 para iniciar la disección. Etapa 17 es apropiado, ya que la cresta neural está claramente separado del tubo neural, en contraste con las etapas anteriores. Después de la etapa 17, se inicia la migración de Carolina del Norte y mezclándose con el mesénquima circundante. </li><li> Cavar un agujero pequeño en la agarosa con pinzas para hacer un hueco para los embriones con el fin de mantenerdurante la disección. Coloque un embrión dorsal hacia arriba. Nota: el modelado de la arcilla puede ser usado para mantener los embriones en lugar de excavación de un agujero en la agarosa. </li><li> Hacer una incisión en la parte lateral del pliegue neural anterior con el cuchillo de la ceja y el pasador de insectos. Tenga cuidado de no ir demasiado profundo en el embrión: tratar de cortar a través de 2-3 capas de células (nunca llegar tan profundo como el archenteron!). Durante todo el proceso de disección, nunca permitir que los tejidos disecados para entrar en contacto con la interfaz aire-líquido desde X. tejidos embrionarios laevis se lisan por la tensión superficial. </li><li> Haga una segunda incisión paralela en la parte más dorsal del pliegue neural utilizando los mismos instrumentos. </li><li> Si es necesario, gire el plato alrededor de 90 °. Hacer tercera incisión perpendicular con el cuchillo de la ceja y la clavija de insecto, en el lado posterior de las dos primera incisiones. La NC es una gruesa masa de células por debajo de la capa externa pigmentada del ectodermo, lateralpara el tubo neural. </li><li> Utilice la punta de la cuchilla de cejas para separar la capa de ectodermo pigmentada de la NC subyacente, a partir de la tercera borde de la incisión. </li><li> Utilice el lado de la cuchilla de cejas para separar el tejido NC a partir de la tercera incisión. El tejido NC es más bien gris, mientras que el mesodermo cefálico subyacente es blanco. Separe con cuidado la Carolina del Norte a partir del mesodermo. </li><li> Separe el tejido NC anterior de la vesícula óptica, y cortar en este nivel para liberar el explante. Como control para la primera experimentos, comprobando la expresión Snail2 (un marcador canónica Carolina del Norte) en algunos explantes por hibridación in situ se recomienda. </li></ol> 3. Plating explantes de fibronectina <ol><li> Rellena el plato fibronectina recubierto con Modificada Danilchick Medio (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K Gluconato 4,5 mM, Na Gluconato 32 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA al 0,1%, se ajusta el pH a 8.3 con 1 M Bicina <sup&gt; 18). </li><li> La transferencia de los explantes en el plato fibronectina recubierto con una pipeta P1000. Nunca permita que los explantes para tocar la interfase aire-líquido. En primer lugar, la pipeta un poco de líquido en la punta, a continuación, los explantes, a continuación, algunos de nuevo líquido. No permita que el aire en la punta durante la transferencia de los explantes en el plato recubiertos de fibronectina. Una vez que la punta está dentro del líquido del plato fibronectina recubiertos, dejar que los explantes lentamente bajan por gravedad, o empujar con mucha suavidad. Evitar la expulsión de los explantes demasiado rápido. </li><li> Coloque 10-30 explantes en el plato con el cuchillo de la ceja. Evitar los lados del plato, que no son adecuados para la formación de imágenes posterior. </li><li> Trate de no mover el plato hasta que los explantes se han unido a la fibronectina (se tarda unos 15-30 minutos). Si es necesario, mueva el plato con mucho cuidado. </li><li> Coloque el plato en un incubador refrigerado (entre 15-20 º C, para la tabla de temperaturas ver 17). Cuando se coloca a 15 ° C, las células are suele migrar de manera eficiente y dispersando después de 6 horas de incubación (el tiempo puede variar entre los experimentos). </li></ol> 4. Injerto explantes en embriones de acogida <ol><li> Cortar un cubreobjetos de vidrio fina en piezas muy pequeñas utilizando fórceps gruesas. El tamaño de las piezas debe ser de aproximadamente 1,5 mm 2. Sumergir los trozos en una placa de Petri que contiene de 3/4 NAM o PBS usando fórceps. </li><li> Preparación del embrión de acogida: diseccionar la NC anfitrión en 3/4 NAM como se describe en 3) con especial cuidado de no dañar el embrión de acogida mientras se quita la membrana vitelina y la disección de la NC. La tensión del tejido tiende a aumentar el tamaño de la ablación: dejar que el embrión de acogida curar parcialmente, mientras que la disección de la embrión donante. </li><li> En otro plato de agarosa recubiertas con o en otra parte del mismo plato, diseccionar el explante NC del embrión donante como se describe en el Protocolo 3. Transferir el injerto de Carolina del Norte en el plato que contiene el host con cuidado, como se describe enProtocolo 3. </li><li> Colocar inmediatamente el explante NC a la zona de ablación host utilizando fórceps. El explante debe adjuntar parcialmente. Ponga un pedazo de cubreobjetos de vidrio sobre el embrión injertado para mantener el injerto en su lugar. Elige un pedazo de vidrio más grande que el embrión para evitar dañarla. El embrión será un poco aplanada. </li><li> Espere por lo menos 15 a 20 minutos, luego retire suavemente el cubreobjetos. Deje que el embrión se recuperan durante otros 10 minutos y la pipeta con cuidado en un plato limpio lleno de 3/4 NAM, utilizando la pipeta Pasteur de plástico. </li></ol>

<ol><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+from+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+of+the+signaling+pathways+directing+neural+crest+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction.</a> Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+at+the+neural+plate+border+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates.</a> Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).</li>
<li>Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+transcriptional+regulation+in+neural+crest+specification+and+migration%3A+lessons+from+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).</li>
<li>Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Bases+of+Human+Neurocristopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Crest+Induct.+Different%22%5BJournal%5D)">Molecular Bases of Human Neurocristopathies.</a> Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians.+Part+II.+Differentiation+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+organization+of+the+central+nervous+system+in+amphibians+Part+I.+Induction+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation.</a> J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).</li>
<li>Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeobox-containing+marker+of+posterior+neural+differentiation+shows+the+importance+of+predetermination+in+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction.</a> Cell. 50 (5), 749-758 (1987).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+a+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+induction+by+paraxial+mesoderm+in+Xenopus+embryos+requires+FGF+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals.</a> Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).</li>
<li>Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax3+and+Zic1+drive+induction+and+differentiation+of+multipotent%2C+migratory%2C+and+functional+neural+crest+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).</li>
<li>Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+in+the+Xenopus+laevis+embryo%2C+studied+by+interspecific+transplantation+and+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy.</a> Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).</li>
<li>Theveneau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+chemotaxis+requires+contact-dependent+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity.</a> Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).</li>
<li>Slack, J. M., Forman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interaction+between+dorsal+and+ventral+regions+of+the+marginal+zone+in+early+amphibian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis.</a> , Garland Pub. New York. (1994).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beads+on+the+run%3A+beads+as+alternative+tools+for+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays.</a> Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).</li>
<li>Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+neural+crest%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the neural crest: An overview.</a> Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+%CE%B15%CE%B21+supports+the+migration+of+Xenopus+cranial+neural+crest+on+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin.</a> Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).</li>
<li>Fort, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+the+RhoU%2FWrch1+GTPase+is+critical+for+cranial+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration.</a> Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-11+regulates+protrusive+activity+in+Xenopus+cranial+neural+crest+cells+upstream+of+Trio+and+the+small+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases.</a> Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).</li>
<li>Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-X+is+required+for+cranial+neural+crest+cell+migration+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li>
<li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Neural+Crest+Induction%2C+Melanocyte+Specification%2C+and+Disease-Related+Pigmentation+Defects+in+hESCs+and+Patient-Specific+iPSCs.%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs.</a> Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li>
<li>Shnitsar, I., Borchers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTK7+recruits+dsh+to+regulate+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration.</a> Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+migration+of+neural+crest+cells+in+vivo+is+regulated+by+Syndecan-4%2FRac1+and+non-canonical+Wnt+signaling%2FRhoA%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA.</a> Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).</li>
<li>Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt11r+is+required+for+cranial+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Wnt11r is required for cranial neural crest migration.</a> Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+of+locomotion+in+vivo+controls+neural+crest+directional+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration.</a> Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).</li>
<li>Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration+requires+the+activity+of+the+extracellular+sulphatases+XtSulf1+and+XtSulf2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2.</a> Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).</li>
<li>Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+the+Cytoplasmic+Domain+of+ADAM13+to+the+Nucleus+Is+Essential+for+Calpain8-a+Expression+and+Cranial+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration.</a> Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).</li>
<li>Borchers, A., David, R., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cadherin-11+restrains+cranial+neural+crest+migration+and+influences+neural+crest+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification.</a> Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).</li>
<li>Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+to+study+migratory+behavior+of+cranial+neural+crest+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus.</a> Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx2+is+essential+for+larval+hyobranchial+cartilage+formation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis.</a> Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).</li>
<li>Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Xenopus+hnRNP+expressed+in+neural+and+neural+crest+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues.</a> Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).</li>
<li>Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+the+importance+of+changing+cell+state+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe una técnica fácil de explante premigratorio craneal NC en embriones de X. laevis. Los embriones utilizados para dichos experimentos deben ser robustos y sanar bien. Deseche cualquier lote de embriones saludables. Además, crecer los embriones a diferentes temperaturas (de 12 a 18-20 ° C), con el fin de escindir la cresta neural en la etapa 17 y no más tarde. Después de la etapa 17, la cresta neural se puede mezclar con mesodermo cefálico y no se puede eliminar completamente. Tejidos d...

La cresta neural (NC) es una población de células embrionarias transitoria que emerge del tubo neural en el extremo del tubo neural en embriones de vertebrados. Los eventos de señalización y genéticos que controlan la especificación NC comenzar tan pronto como la gastrulación. La NC se especifica en la frontera entre el ectodermo neural y no neural por las señales de los tejidos que rodean dorsales. Al final de la neurulación, NC células se someten a una transición epitelio-mesénquima (EMT) y migran extensamente en el embrión siguientes rutas estereotipadas de responder a las señales de guía circundante. Una vez que han llegado a su destino final, se diferencian en una amplia gama de derivados, por ejemplo, neuronas, células gliales, huesos, cartílagos y células pigmentadas 1-5. Debido a su contribución a muchos tipos de células y tejidos embrionarios, defectos en cualquier trámite del desarrollo de células NC, desde la inducción de la diferenciación final, puede causar síndromes congénitos con nombre neurocristopathies 6. Emanipulación Xperimental del NC en desarrollo en diferentes etapas - de especificación, EMT, migración y diferenciación - mejorará nuestra comprensión de neurocristopathies y permitir el diseño de estrategias terapéuticas potenciales. El embrión de Xenopus laevis es un modelo de elección para estudiar el desarrollo de NC. Un gran número de embriones son fáciles de obtener, y la fertilización externa da acceso a las primeras etapas de desarrollo. Muchas herramientas están disponibles para manipular experimentalmente X. laevis desarrollo embrionario. Ganancia de función y derribo Gene son fáciles de realizar mediante la microinyección de células individuales de primeros blástulas. Tejidos embrionarios pueden ser cortados para la reasociación in vitro o ensayos de 7-11 back-injerto 12,13. En este protocolo, se describe cómo diseccionar premigratorio NC craneal en X. laevis neurulas tarde, antes de la migración. Estos explantes se pueden cultivar en fibronectina-Coated placas para estudiar la migración y la diferenciación en controladas en condiciones experimentales in vitro. Explantes NC también se pueden injertar en embriones normales o manipuladas de acogida para estudiar su migración y diferenciación in vivo.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F4759-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción V</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-C</td><td>El grado de calidad inferior puede ser adecuado para esta aplicación</td></tr><tr><td>Alfileres de insectos de acero inoxidable, tamaño 000</td><td>FST</td><td>26001</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5 0,05 mm x 0,02 mm</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr></tbody></table>

la disección de<em&gt; xenopus laevis</em&gt; neural crest para<em&gt; in vitro</em&gt; explante cultura o<em&gt; in vivo</em&gt; trasplante

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

La cresta neural (NC) es una población de células dorsal del tubo neural transitoria que sufre una transición epitelio-mesénquima (EMT) al final de la neurulación, migra ampliamente hacia diversos órganos, y se diferencia en muchos tipos de derivados (neuronas, neuroglia, cartílago y hueso, células pigmentadas y endocrinos). En este protocolo, se describe la forma de diseccionar la premigratorio craneal NC a partir de embriones de Xenopus laevis, con el fin de estudiar el desarrollo de NC in vivo e in vitro. El modelo de la rana ofrece muchas ventajas para estudiar el desarrollo temprano; abundantes lotes están disponibles, los embriones se desarrollan rápidamente, ganancia in vivo y la pérdida de las estrategias de función permiten la manipulación de la expresión génica antes de la disección NC en donante y / o embriones de acogida. Los explantes de NC se pueden sembrar en fibronectina y utilizados para estudios in vitro. Ellos pueden cultivarse durante varios días en un medio definido libre de suero. También describe cómo injertar explantes NC espaldaen embriones de acogida para el estudio de NC migración y diferenciación in vivo.

Cuando chapada en fibronectina, los explantes de la cresta neural se adhieren rápidamente (15-30 min) y el explante se extiende plana dentro de 2 horas (Figura 1A). Después de 3-6 células hr comienzan a dispersarse. En 24 horas a 15 ° C, muchas células han comenzado a migrar fuera del explante (figuras 1B y 1C). Yema hace que las células muy brillante bajo contraste de fase (Figura 1B). Protuberancias celulares (filopodes y lamellipodes) son claramente ...

Este protocolo describe cómo diseccionar la cresta neural craneal premigratorio (NC) de neurulas Xenopus laevis. Estos explantes se pueden sembrar en fibronectina y cultivadas in vitro, o injertados en embriones de acogida. Esta técnica permite el estudio de los mecanismos de la NC transición epitelio-mesénquima, la migración y la diferenciación.

La disección de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest para<em&gt; In vitro</em&gt; Explante cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trasplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

El objetivo general del siguiente procedimiento es rastrear la migración de las células de la cresta neural del opus Lavis. Esto se logra primero mediante la disección de las crestas neurales de embriones en la etapa neural. En el segundo paso, los explantes se siembran en una placa recubierta con fibronectina para estudiar su migración celular in vitro.Alternativamente, tras la eliminación de la cresta neural de un embrión huésped, los explantes pueden ser injertados nuevamente para rastrear su migración in vivo. En última instancia, se puede investigar la contribución de la migración de las células de la cresta neural embrionaria en el desarrollo del opus lavis. En general, las personas nuevas en este método pueden encontrarlo difícil porque los embriones tempranos son frágiles.La cresta neural es una población celular bastante pequeña, y usted debe fabricar sus propias herramientas de disección. La demostración visual de este protocolo es fundamental. Cada elemento del proceso de disección se ha optimizado para garantizar una eliminación limpia de la cresta neural.El día del experimento, tome un recipiente de disección de 60 milímetros recubierto con aproximadamente 10 mililitro

dissection-xenopus-laevis-neural-crest-for-vitro-explant-culture-or

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

El mesénquima craneal experimenta movimientos dramáticos morfogénicas probable que proporciona una fuerza motriz para la elevación de los pliegues...

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Este video ilustra una técnica para aislar los pliegues neurales craneales de la región del mesencéfalo de embriones de pollo. Presenta un proceso de disección detallado de los pliegues neurales, su colocación y fijación en cubreobjetos recubiertos de fibronectina, seguido de la observación de la migración de las células de la cresta neural desde los pliegues neurales.

Aislamiento de pliegues neurales craneales de un embrión de pollo para un cultivo de células de cresta neural

Este protocolo describe un procedimiento de explante mejorada que...

Ex utero electroporación y explantes enteros hemisferio: un método simple Experimental de Estudios del Desarrollo Cortical Temprana

Una técnica para el trasplante "Extreme anterior Dominio" tejido facial entre Xenopus laevis embriones se ha desarrollado. Los tejidos pueden moverse de un fondo de la expresión génica en otro, lo que permite el estudio de las necesidades locales para el desarrollo craneofacial y de señalización interacciones entre las regiones faciales.

Los trasplantes faciales en<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los embriones

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

La transición epitelial a mesenquimal (EMT) permite que los cánceres se vuelvan invasivos. Para investigar la EMT, se describe un modelo in vitro basado en células madre neurales (NSC) desprovisto de suero y enzimas. Este sistema estandarizado permite la evaluación cuantitativa y cualitativa de la migración celular, la expresión génica y proteica. El modelo es adecuado para el descubrimiento de fármacos.

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

Este protocolo describe la disección y el cultivo de células de la cresta neural craneal a partir de modelos de ratón, principalmente para el estudio de la migración celular. Describimos las técnicas de imagen en vivo utilizadas y el análisis de la velocidad y los cambios en la forma celular.

Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Aprende a disecar la cresta neural de Xenopus laevis para estudios in vitro e in vivo. Este método permite investigar la migración celular y la diferenciación en biología del desarrollo.

La disección de

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