Name: Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprenda a montar embriones de pez cebra para microscopía de hoja de luz a largo plazo usando tubos FEP y agarosa. Esta técnica permite observar el desarrollo embrionario con alta resolución espacial y temporal.

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Agradecemos a la Sociedad Max Planck, la Human Frontier Science Program (HFSP) y el Boehringer Ingelheim Fonds para su financiación y apoyo.

1. Preparación de materiales <ol><li> Preparación de tubos de FEP <ol><li> Limpie el tubo de FEP (Figura 2 A) por el lavado líquidos (en los pasos indicados a continuación) a través del tubo y usando una jeringa conectada a una cánula de punta roma (Figura 2B) Nota 1:.. Utilizar guantes durante todo el procedimiento Nota 2: Se recomienda cortar el tubo en piezas de aprox. 1 m de longitud y la limpieza de aquellos en paralelo. <ol><li> Primero enjuagar la sonda con NaOH 1 M repetidamente. A continuación, transferir el tubo a un tubo de centrífuga de 50 ml llena con 0,5 M de NaOH y se ultrasonicate durante 10 min. </li><li> Transferir el tubo de polímero a una pequeña cuenca con ddH 2 O. Enjuague bien el tubo primero con ddH 2 O y luego con EtOH al 70%. </li><li> Posteriormente transferir el tubo FEP a un tubo de centrífuga fresco con EtOH al 70%. Una vez más ultrasonicate este tubo de centrífuga durante 10 min. </li></ol></li><li> Corte el tubo FEP limpiado en pedazosde unos 3 cm (una longitud típica para el uso en el montaje de pez cebra y la imagen) y enderezar si es necesario. Guarde los tubos de FEP limpiados en un tubo de centrífuga de 50 ml fresco lleno de ddH2O (Figura 2C). </li></ol></li><li> Preparación de la solución madre tricaína <ol><li> Preparar la solución de stock tricaína 0,4% disolviendo 400 mg tricaína (MS-222) en 97,9 ml ddH 2 O. Después de que el polvo se haya disuelto por completo, ajustar el pH a 7,0 usando 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9,0). Proteja la solución de la luz. Alícuotas Almacenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de 3% de metilcelulosa <ol><li> Preparar solución de metilcelulosa al 3% para el recubrimiento interior de los tubos de FEP tal como se describe a continuación. Calentar E3 11 en una botella de vidrio de aproximadamente 60 a 70 ° C y añadir la cantidad apropiada de polvo de metilcelulosa. Añadir una barra de agitación y se agita a 4 ° C. Tan pronto como la solución se enfría hasta por debajo de 30 ° C, añadir solución tricaína a un final Concentration de 100 mg / L. Mantener la agitación a 4 ° C durante la noche. </li></ol></li><li> Preparación de 1,5% y 0,1% de agarosa en E3 <ol><li> Disolver la cantidad apropiada de bajo punto de fusión en polvo de agarosa en un volumen definido de E3 en un matraz de vidrio. Calentar la mezcla en un horno de microondas y agitar de vez en cuando, hasta que aparezca homogénea la solución de agarosa, sin cristales restantes. </li><li> Preparar alícuotas de 1 ml de solución de agarosa al 0,1% en 1,5 ml de tubos de reacción. Las alícuotas se pueden almacenar a 4 ° C. </li><li> Use la solución del 1,5% para cubrir un plato de plástico Petri. El espesor de la capa de agarosa debe ser ca. 2 mm. Después de que se solidifica la agarosa, se añade medio de E3 en la parte superior de la capa para evitar que se seque. El plato recubierto se puede almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de pez cebra <ol><li> Mantenga pez cebra (Danio rerio) adultos y embriones a 28,5 ° C y manejarlos de acuerdo a los protocolos establecidos 11,12. </li><li> Configure los peces machos y hembras de la tarde y separarlos utilizando un divisor. Retire el separador de la mañana siguiente en cuando el apareamiento de los peces. </li><li> Recoger los embriones en un plato lleno de E3 y examinarlos utilizando un microscopio estereoscópico. </li><li> A las 24 HPF (o la etapa de desarrollo de su interés), seleccionar el embrión de pez cebra para la expresión de fluorescencia y transferencia de los positivos a un nuevo plato con E3 fresco. </li><li> Dechorionate cuidadosamente los embriones utilizando dos pinzas cortantes (Figuras 2D y 2E). Utilice las primeras pinzas para agarrar y sostener el corion y el segundo fórceps rasgarlo abierto y llevarlo a cabo Nota 1:. Realice este paso con la ayuda de un microscopio estereoscópico. </li></ol></li></ol> 2. Multicapa de montaje <ol><li> Revestimiento del tubo de FEP <ol><li> Conecte una cánula extremo romo a una jeringa. Inserte la cánula cuidadosamente durante aproximadamente 3 mm en un extremo de un limpiado y cortar el pedazo de. Tubo de FEP (Figuras 2F y 2G) Nota 1: Usar guantes y evitar cualquier flexión o compresión del tubo. </li><li> Sumergir el extremo libre del tubo de FEP en 3% de metilcelulosa y llenar el tubo con la solución. </li><li> Suelte lentamente el metilcelulosa empujando en la jeringa. Deseche la solución. </li><li> Repetir los pasos 2.1.2 y 2.1.3 usando E3 Nota 1:. Los tubos recubiertos necesitan ser utilizado para el montaje de inmediato. </li></ol></li><li> Transferencia del pez cebra para la agarosa <ol><li> Calentar una alícuota de 0,1% de agarosa a 70 ° C en un bloque de calor. Vórtice brevemente el tubo de reacción y la transfiere a un bloque de calor ajustado a 38 ° C (Figura 2H). </li><li> Tome el tubo de reacción desde el bloque de calor y deje que se enfríe brevemente. Añadir tricaína a una concentración final de 133 a 200 mg / L y de vórtice de nuevo (Figura 2I). </li><li> Seleccione uno de los embriones de pez cebra dechorionated y transfe. r al tubo de reacción con el precalentado 0,1% de agarosa utilizando una pipeta Pasteur de vidrio (Figuras 2J y 2K) Nota 1: Trate de transferir el menor E3 adicional posible. </li></ol></li><li> Montaje del pez cebra <ol><li> Recoger el embrión con el tubo FEP jeringa adjunta (Figura 2L). . El tubo debe ser llenado completamente con un 0,1% de agarosa, con el embrión situado cerca de uno de los extremos del tubo y con la cabeza apuntando hacia la abertura del tubo Nota 1: Asegúrese de tomar un poco de agarosa antes de tomar el pescado. Nota 2: Tire muy suavemente en la jeringa para evitar burbujas Nota 3:. Mantener el tubo en una orientación horizontal para evitar la fuga de su contenido (Figuras 2M y 2N). </li></ol></li><li> Al conectar el tubo <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. De múltiples capas de montaje para los embriones de pez cebra. A) de etileno propileno fluorado (FEP) tubos en un tambor de cable antes de la preparación. B) Una jeringa con una cánula de extremo romo adjunto. C) Un limpiado y cortar tubo de FEP. D, E) Dechorionation de 24 HPF embriones de pez cebra. F) Colocación del tubo de la cánula de extremo romo. G) La jeringa con cánula y el tubo adjunto. H) Una alícuota de 0,1% de agarosa en el interior de un tubo de reacción durante la transferencia a un bloque de calor. I) vórtex del fundido de agarosa. J) La captación de un embrión dechorionated usando una pipeta de vidrio. K) de transferencia del embrión en la agarosa fundida. L) de admisión del embrión y la zona de agarosa en el tubo de FEP. M, N) El embrión de pez cebra en el interior del tubo de FEP . <strong&gt; O) Q cortar el tubo entre el espécimen y la cánula. P) Conectar el tubo por el uso de un plato de agarosa-recubierto.) El embrión en el interior del tubo enchufado. R) La preparación de la muestra final en un soporte de metal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <ol><li> Utilice una hoja de afeitar para cortar el tubo de la cánula (Figura 2O). </li><li> Lentamente pegar el extremo del tubo que contiene el pescado a través de toda la capa de 1,5% de agarosa en el plato de plástico para tapar el tubo (Figura 2P) Nota 1:. Evitar la formación de burbujas y tratar de obtener una superficie enchufe recto manteniendo la . tubo exactamente perpendicular a la superficie de agarosa Nota 2: Gire el tubo ligeramente para obtener un tapón agradable. </li><li> Mantenga la muestra montada en un tubo de reacción de 1,5 ml con E3 para evitar la desecación. La muestra es now listo para ser fotografiado. Antes de las imágenes, comprobar si el pescado está sentado a la derecha en la parte superior del tapón (figuras 2Q y 2R). Asegúrese de añadir también tricaína al medio dentro de la cámara de formación de imágenes en la misma concentración como en el medio de montaje. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Técnicas avanzadas de microscopía tales como microscopía de lámina de luz nos permiten grabar datos de imagen con alta resolución temporal y espacial en el transcurso de varios días, pero también requieren técnicas de montaje de la muestra para mejorar. Se presenta un protocolo detallado de montaje para la hoja de microscopía óptica de desarrollo del pez cebra multicapa. El método es sencillo de implementar y la usamos en nuestro laboratorio sobre una base diaria. Los tubos de FEP Los componentes clave de nuestra estrategia de montaje son tubos hechos del etileno fluorado polímero de propileno (FEP). Hemos decidido utilizar la FEP sobre todo debido a su índice de refracción de 1,338, que es similar a la del agua y por lo tanto ideal para la microscopía de lámina de luz con los objetivos de inmersión de agua y muestras que requieren medios acuosos. Los tubos con 0,8 mm de diámetro interior y 0,4 mm de espesor de pared ajustarse el pez cebra en desarrollo muy bien, se pueden utilizar con soportes de muestra típicos adecuados para 1,6 mmcapilares y son nuestra primera opción para el método de montaje presentado. Los probamos a fondo en nuestras configuraciones de fabricación casera, así como en el sistema comercial &quot;Lightsheet Z.1&quot; de Carl Zeiss Microscopía y encontramos que los tubos de FEP ofrecer estabilidad a largo plazo, tienen un impacto mínimo en el rendimiento óptico y son no fluorescente 10. Ellos son, sin embargo, no es adecuado para aplicaciones con muestras que requieren un índice de refracción diferente, por ejemplo, borra espécimen. Tubos así como láminas de FEP están disponibles en una variedad de diámetros y espesores. Además, FEP se puede fundir a 260 ° C y por lo tanto ofrece prácticamente infinitas posibilidades de soportes de montaje de la muestra medida. Los tubos de polímero tienden a ser suministrados sin esterilizar, por lo que el protocolo de limpieza incorpora varias medidas para garantizar la mejor calidad óptica. El recubrimiento con metilcelulosa se asegura de que ninguna parte de la creciente embrión de pez cebra se pega al polímero. La decisión de un 0,1% de agarosa se ​​basa en extensas pruebas de tasa de crecimiento y la inmovilidad en diferentes concentraciones de agarosa y metilcelulosa 10. Concentraciones superiores a 0,1% de agarosa ya mostraban un severo impacto en la tasa de crecimiento de 24 HPF pez cebra. Además utilizamos dosis bajas del fármaco tricaína anestesiante. Potenciales bloques tricaína de acción, por lo tanto, inhibe la transmisión de señales entre el cerebro y los músculos, y suprime las contracciones musculares 16. Una concentración de 133 a 200 mg / l asegura la inmovilización suficiente de pez cebra entre 24-72 HPF. Sin embargo, tricaína y otras drogas anestésicas que probamos espectáculo dosis efectos secundarios dependientes tales como edema cardíaco. Además, la dosis requerida de tricaína varía con la etapa de desarrollo del embrión. Por ello, recomendamos reducir la concentración tricaína a la cantidad necesaria para las etapas de desarrollo que están incluidas en la imagen. Para asegurar el mejor performance y prevenir la formación de subproductos tóxicos, solución madre tricaína preparado fresco o descongelado se debe utilizar, protegido de la luz y no se calienta por encima de 30 ° C. La incrustación en tubos de FEP también permite una fácil modificación del medio de montaje para dar cuenta de las necesidades específicas. Para time-lapse del corazón, se recomienda utilizar 3% de metilcelulosa y 100 mg / L tricaína en lugar de 0,1% de agarosa y 200 mg / L para el montaje. Metilcelulosa es más viscoso que el 0,1% de agarosa proporcionando así mayor inmovilidad en su propia y menos tricaína necesita ser utilizado para asegurar el confinamiento del embrión. Tricaína es sensible a temperaturas superiores a 30 ° C y también se puede diluir por el medio en la cámara de formación de imágenes, que conduce a una disminución del rendimiento y la posible contracciones del embrión. Por lo tanto, asegúrese de usar tricaína también en el medio de la imagen en la que se encuentra inmersa la muestra montada. Si sus experimentos requieren el uso de más altotemperaturas, se recomienda el intercambio de medio en la cámara de formación de imágenes, ya sea constantemente mediante el uso de un sistema de perfusión o de forma manual con un tubo y una jeringa entre dos puntos de tiempo. Los pasos críticos Los pasos críticos durante el proceso de montaje de la muestra son la ingesta de la muestra en el tubo y la inserción de la clavija de agarosa. La ingesta define la posición inicial del embrión, que es engorroso para cambiar después. Múltiples muestras deben estar a disposición de montar y la calidad de montaje deben ser vigilados con un microscopio estereoscópico. Si la orientación de la muestra no es satisfactoria, la alteración de la velocidad de la elaboración de la muestra y evitando movimientos posteriores del émbolo puede ayudar, ya que con frecuencia se tuerce el embrión. El tapón de agarosa al 1,5% es necesario para evitar fugas de la agarosa 0,1%. La superficie de la clavija en el interior del tubo debe ser plana para no influir en la orientación de la muestra durante el desarrollo. Para lograr un buen surfas, diferentes espesores de las capas de agarosa necesitan ser probado y el tubo tiene que ser puesto en la agarosa normal a la superficie. Al girar el tubo un poco y sacar el tubo libera cuidadosamente el enchufe de la antena. La calidad del montaje se debe comprobar con un microscopio estereoscópico antes de exponer. Imágenes Multiview Una de las principales ventajas de la microscopía de lámina de luz es la imagen Multiview, la capacidad de rotar la muestra, adquirir z-pilas desde múltiples ángulos y, posteriormente, registrar y fusionarlas. Un método establecido para registrar los z-pilas en el espacio 3D es el registro basado en perlas utilizando cuentas fluorescentes que rodean la muestra como marcadores fiduciarios 17. Este método, sin embargo depende de un medio de montaje sólido, tal como 1,5% de agarosa y por lo tanto parece ser incompatible con el montaje de múltiples capas presenta aquí. Pero varias soluciones alternativas funcionan dependiendo de la aplicación. En primer lugar, las perlas fluorescentes puedeser incorporado en el tapón de agarosa, que tiene que estar en el campo de visión durante la adquisición. En segundo lugar, las posiciones de la etapa pueden ser calibrados antes de los experimentos reales utilizando una columna de agarosa al 1,5% con perlas fluorescentes. En tercer lugar, los marcadores alternativos, tales como núcleos fluorescentes se pueden utilizar para identificar la posición de los z-pilas respecto a la otra. Evaporación Típicas configuraciones de microscopía de lámina de luz utilizan una cámara de muestra abierta, lo que conduce inevitablemente a la evaporación del medio. Puesto que el medio es esencial para la supervivencia de la muestra, para restringir la evaporación del medio de montaje y para el índice de refracción correcta entre la óptica y la muestra, se recomienda tomar una o más de las siguientes medidas para evitar la evaporación. En primer lugar, el medio en la cámara puede ser intercambiada constantemente por un sistema de perfusión. En segundo lugar, el medio se puede rellenar manualmente. En tercer lugar, la cámara se puede cubrir con una tapa o una lámina flexible. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; El suministro de oxígeno El FEP polímero fue desarrollado para soportar una gran variedad de productos químicos y es por lo tanto robusto, químicamente inerte y no permeable al gas. En el caso del oxígeno montaje multicapa sólo puede penetrar a través del tapón de agarosa y la interfaz de agarosa al aire, pero aún no se ha demostrado si el suministro de oxígeno en el montaje de múltiples capas está muy inferior en comparación con el montaje en el 1,5% de agarosa sin apoyar tubo de polímero. Sin embargo, como el montaje en 1,5% de agarosa sólo se puede utilizar durante aproximadamente dos horas antes de la morfología de pez cebra se ve afectada montaje de múltiples capas parece ser la solución superior en general para la formación de imágenes a largo plazo. Imaging etapas tempranas del desarrollo Multicapa de montaje se ha convertido en nuestra técnica de incrustación estándar para microscopía de lámina de luz lapso de tiempo de pez cebra mayores de 24 HPF. Además de eso, también utilizamos los tubos de polímeros para obtener imágenes de los embriones en etapas más tempranas. El correombryos permanecen en sus corion y están montados en un tubo FEP con un diámetro interior de 1 mm y se llenan con E3. El pez cebra puede desarrollar libremente dentro del corion y todavía se pueden obtener imágenes bien mediante microscopía de lámina de luz. Perspectiva El montaje de la muestra multicapa presentado desata todo el potencial de la microscopía de lámina de luz de la biología del desarrollo en tiempo real con el pez cebra. Puede ser fácilmente adoptado para otras técnicas de microscopía tales como la tomografía óptica de proyección (OPT) y otros organismos. Creemos que los tubos de FEP de tamaño estándar son sólo los primeros pasos hacia técnicas de montaje de la muestra a medida para necesidades específicas.

Para entender los eventos y de las interacciones complejas durante la embriogénesis, la investigación en biología del desarrollo es más móvil y más de microscopía de células individuales y órganos para formación de imágenes in vivo de organismos enteros. Técnicas de microscopía tradicionales normalmente no ofrecen una resolución espacial y temporal de seguir los eventos rápidos durante un largo período de tiempo y, a menudo causan efectos de blanqueo o fototóxicas en la muestra 1. Nosotros y otros encontramos hoja microscopía de luz (Figura 1) que sea la técnica ideal para imágenes in vivo del pez cebra 2-4. La iluminación de la muestra con una fina lámina de luz láser, ortogonal al eje de detección, ofrece seccionamiento óptico rápido con alta resolución espacial, así como reducir al mínimo la foto-toxicidad 5. Al mismo tiempo, debido a esta disposición óptica única, técnicas de montaje tradicionales de muestra utilizando placas de Petri o cámaras de cultivo no son adecuados. En una luz típicamicroscopio hoja de tres motores de traslación y un motor de rotación tienen la muestra, de tal manera que puede ser colocado con precisión, se volvieron y vieron desde cualquier dirección. En los últimos especímenes para microscopía de lámina de luz con frecuencia se han incrustado en el 1-2% de agarosa al interior de un capilar de vidrio de 6,7. En este caso el cilindro de agarosa solidificada con la muestra incrustados se extruye fuera del capilar de vidrio en la cámara de muestra lleno con medio-como el agua para la formación de imágenes. La agarosa tiene un índice de refracción cerca del agua y por lo tanto es ideal para microscopía in vivo de lámina de luz que facilita la óptica de iluminación y detección corregida con el agua. La muestra se limita en la agarosa rígido y se pueden obtener imágenes bien por un corto período de tiempo, pero los cambios morfogenéticos y el crecimiento del embrión se vean afectados fuertemente cuando Imaging para varias horas 7,8. Aunque las soluciones para otras aplicaciones se han desarrollado 9, el pez cebra no invasiva de lapso de tiempo a largo plazo<html> potencial de obtención de imágenes de microscopía de lámina de luz no puede ser explotada mediante el 1,5% de incorporación de agarosa convencional. Por lo tanto, hemos desarrollado una nueva estrategia para el montaje de lámina de luz de microscopía in vivo de embriones de pez cebra 10. La muestra se monta en 0,1% de agarosa con 200 mg / L de tricaína dentro de un tubo hecho de la de polímeros fluorados ópticamente claro de etileno propileno (FEP). El embrión embebido se desarrolla normalmente debido a la baja viscosidad del medio. Al mismo tiempo, el tubo de FEP confina el medio y la muestra para la duración del experimento. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado de la nueva técnica de montaje y presentar datos que refleja sus ventajas sobre el protocolo convencional. Demostramos que con nuestro método de desarrollo del pez cebra se puede asociar de forma continua con una alta resolución espacial y temporal durante un período de más de dos días. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. El principio de la microscopía de lámina de luz. Un pez cebra montado en un tubo hecho de propileno de etileno fluorado (FEP) puede ser traducido y se hace girar a través del plano focal del objetivo de detección. Una fina lámina de luz láser (hoja de luz) es proyectada por el objetivo de iluminación en el plano focal del objetivo de detección e ilumina sólo una sección óptica delgada de la muestra. La señal de fluorescencia emitida es recogida por el objetivo de detección y grabado en un chip de la cámara.

<table><tbody><tr><td>Tubos de etileno propileno fluorado (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0,8/1,6 mm diámetro interior/exterior, otros tamaños disponibles</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo 1 ml Jeringa</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Cánula de un solo uso, romo</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0,8 mm x 22 mm, otros tamaños disponibles, el diámetro exterior de la cánula debe ajustarse al diámetro interior del tubo</td></tr> <tr><td>FEP50 ml Tubo de centrífuga de polipropileno</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>suministrado en polvo</td></tr><tr><td>E3 medio (para embriones de pez cebra)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo de reacción</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, baja temperatura de gelificación</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>suministrado como</td></tr><tr><td>polvo Placa</td> <td>de PetriPlástico Greiner</td><td>633180</td><td>, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>sinónimos:&nbsp; 3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato, MS-222, TS 222, metanosulfonato de tricaína&nbsp;</td></tr><tr><td>Lente de objetivo de microscopio 10X/0.3 W Cámara</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Tecnología Andor</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multicapa de montaje para microscopía de luz hoja de largo plazo del pez cebra

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Microscopía Calderería ligera es la técnica ideal para estudiar el desarrollo embrionario del pez cebra. Debido a la mínima fototoxicidad y blanqueo, es particularmente adecuado para time-lapse a largo plazo durante muchas horas hasta varios días. Sin embargo, se necesita una estrategia adecuada de montaje de la muestra que ofrece tanto el parto y el desarrollo normal de la muestra. Multicapa de montaje, una nueva técnica de incrustación utilizando agarosa de baja concentración en tubos ópticamente transparentes, ahora supera esta limitación y da rienda suelta a todo el potencial de la microscopía de lámina de luz de la biología del desarrollo en tiempo real.

Imaging Multiday de pez cebra Vasculatura Desarrollo Utilizamos 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 pez cebra para demostrar las ventajas de la estrategia de fijación de múltiples capas para la luz de microscopía hoja a largo plazo. El objetivo es la imagen el desarrollo de la vasculatura en todo el pez cebra durante un transcurso de 2 días. El embrión de pez cebra se montó en 0,1% de agarosa en el interior de un tubo de polímero recubierto de metilcelulosa. Aquí, el pez cebra no está restringido por el medio de montaje y puede desarrollarse normalmente. Su cabeza levanta, la cola se extiende y brotación vascular aparece sin obstáculos (Figura 3). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> Figura 3. Multidía de formación de imágenes de la vasculatura el desarrollo de pez cebra. La vasculatura de un Multilayer montado 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 pez cebra se desarrolla sin obstáculos en un microscopio de lámina de luz a lo largo de dos días. Una lámina de luz láser de 488 nm excita la fluorescencia y la señal se detectó utilizando 10X/0.3 W objetiva y una cámara EMCCD. Z-pilas fueron adquiridas en cuatro posiciones adyacentes cada 10 min y posteriormente se cosen con Fiji 15. Se muestran las proyecciones de máxima intensidad de un subconjunto de los puntos de tiempo. Barra de escala:. 500 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> Imaging of Early pez cebra Embriogénesis Este sentido, demuestran la capacidad de los tubos de FEP como un soporte de montaje para la hoja de microscopía de luz de principios de la embriogénesis del pez cebra en el primer día después de la fertilización. El 8 HPF Tg (H2A: GFP) 14 embriones de pez cebra se montó con su corion intacta dentro de un tubo lleno de E3 con una idiámetro nner de 1 mm. Eso da lugar a una ligera sujeción del corion. Todos los procesos de desarrollo durante la embriogénesis se ven afectados por el montaje y se pueden visualizar de forma óptima mediante microscopía de lámina de luz. En este ejemplo, se tomó imágenes de la muestra sobre un curso de 12 horas (Figura 4). Cambios en la forma típicos durante la embriogénesis temprana, tales como el aumento de la elongación de la yema y engrosamiento del tejido a lo largo de la línea media, serían oprimidos cuando se utiliza el montaje tradicional sin corion en 1,5% de agarosa. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Figura 4 imágenes de principios de la embriogénesis del pez cebra Una Tg (H2A: GFP). 14 pez cebra pasa a través de la embriogénesis temprana. Se detectó una GFP emocionada 488 nm lámina de luz láser y la señal de fluorescenciacon un objetivo 10X/0.3 W y una cámara EMCCD. Z-pilas de dos ángulos fueron adquiridas cada 3 minutos durante un curso de 12 horas. Se muestran las proyecciones de intensidad máxima normalizada de un subconjunto del time-lapse. El desenfoque de movimiento visible a las 19 HPF resultados de la contracción del embrión durante la adquisición, ya que se utilizaron sin anestesia. Barra de escala:. 150 m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

El objetivo general de este procedimiento es montar un embrión de pez cebra para microscopía de hoja de luz in vivo a largo plazo. Esto se logra primero limpiando un tubo de politetrafluoroetileno, etileno propileno o FEP y recubriéndolo con metilcelulosa. A continuación, se recubre un embrión de pez cebra de interés.Luego, el embrión se transfiere primero a agarosa fundida y después al tubo FEP recubierto. Finalmente, el fondo del tubo se cierra con un tapón de aros y se verifica cuidadosamente la orientación del embrión montado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el desarrollo no perturbado de embriones de pez cebra durante varios días con alta resolución espacial y temporal mediante microscopía de hoja de luz in vivo.Bueno, la principal ventaja frente a las técnicas existentes es que ahora podemos observar embriones de pez super durante varios días y no solo unas pocas horas. Este método puede proporcionar información valiosa sobre la embriogénesis a largo plazo del pez cebra mediante microscopía de hoja de luz. También puede aplicarse a otros organismos pequeños, como organismos marinos diminutos.También puede utilizarse junto con otras técnicas de microscopía, como la tomografía de proyección óptica, la microscopía de campo amplio o la microscopía confocal. Las personas no familiarizadas con este método podrían tener dificultades, ya que el protocolo incluye pasos críticos respecto al tiempo y requiere cierta experiencia para juzgar la posición final del embrión. Para preparar un tubo de FEP, primero límpielo pasando repetidamente hidróxido de sodio uno molar. Luego transfiera el tubo a un tubo cónico de 50 mililitros lleno con hidróxido de sodio 0,5 molar y sométalo a ultrasonido durante 10 minutos.Transfiera el tubo de polímero a un recipiente pequeño con agua destilada desionizada y enjuáguelo. Luego, realice un enjuague con etanol al 70% antes de transferirlo a un tubo centrífugo nuevo. Con etanol ultras.Sonicar el tubo durante 10 minutos antes de transferirlo a un pequeño recipiente con agua destilada desionizada y enjuagarlo nuevamente. Cortar el tubo FEB limpio en trozos de tres centímetros de longitud y enderezarlos si es necesario. Almacenar los tubos limpios en un tubo nuevo de 50 mililitros lleno con agua destilada desionizada.Preparar la solución stock de Trica. 3% de metilcelulosa y ambos Aros al 1.5% y al 0.1% según el protocolo del texto. Fundir el agarro al 1.5% y verterlo en una placa de Petri para formar una capa con un espesor de aproximadamente dos milímetros.Recoger embriones de pez cebra en la etapa deseada que hayan expresado positivamente el gen fluorescente de elección y transferirlos a una placa fresca con E tres bajo un estereoscopio. Utilizando dos pinzas finas, revestir cuidadosamente los embriones usando una pinza para sostener la coriona y la segunda pinza para rasgarla y retirarla, con el fin de realizar el montaje multicapa. Con las manos enguantadas, sujetar una cánula de extremo romo a una jeringa.Inserte cuidadosamente la cánula aproximadamente tres milímetros dentro de uno de los extremos de un trozo limpio de tubo FEP. A continuación, sumerja el extremo libre del tubo FEP en metilcelulosa al 3% y llene el tubo con la solución. Luego, empuje lentamente la jeringa para liberar la metilcelulosa utilizando el medio E tres, repita los pasos de inmersión y expulsión.Mientras tanto, en un bloque térmico, caliente un alícuota de 0,1 %aros a 70 grados Celsius. Vortexe brevemente el tubo de reacción antes de transferirlo a un bloque térmico ajustado a 38 grados Celsius. Después del calentamiento, deje que el tubo se enfríe brevemente y agregue trica hasta una concentración final de 133 a 200 miligramos por litro y vortexe.Nuevamente, utilizando una pipeta de vidrio Pasteur, transfiera un embrión recubierto al tubo de reacción con AROS, transfiriendo la menor cantidad posible de E3. Con el tubo FEP y la jeringa acoplada, aspire suavemente una pequeña cantidad de AROS antes de aspirar el embrión y llene completamente el tubo con AROS.El embrión debe colocarse en cualquiera de los extremos del tubo, con la cabeza orientada hacia la abertura. Para evitar que se derrame el contenido, mantenga el tubo en posición horizontal para taparlo. Utilice una cuchilla de afeitar para cortarlo de la cánula.Luego, sosteniendo el tubo perpendicular, introduzca lentamente su extremo a través de toda la capa de agaros al 1,5 % y gírelo ligeramente. Para evitar el secado, mantenga la muestra montada en un tubo de reacción de 1,5 mililitros lleno con medio E tres antes de la adquisición de imágenes. Verifique que el pez dentro del tubo FEP esté posicionado recto y que su cabeza esté directamente encima del tapón para la adquisición de imágenes.Añada trica al medio dentro de la cámara de imagen. Se muestra aquí un embrión transgénico de pez cebra K-G-R-L-G-F-P, un día después de la fertilización, imagenado durante el transcurso de dos días para observar el desarrollo de la vasculatura.El pez cebra no está restringido por el medio de montaje y puede desarrollarse normalmente. Por ejemplo, levanta la cabeza. La cola se extiende y la formación de brotes vasculares aparece sin impedimentos.Esta técnica puede realizarse en 10 minutos si se lleva a cabo correctamente y todos los materiales están fácilmente disponibles. Recuerde realizar todos los pasos principales sin ninguna demora. Mantenga todas las soluciones limpias, ya que la suciedad puede afectar la calidad final de la imagen.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este artículo describe la preparación de muestras para la microscopía de fluorescencia de lámina de luz. También demuestra un método para montar embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo, que permite la grabación de películas de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas.

Preparación de muestras de microscopía de lámina ligera: montaje de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo

Este artículo describe un método para montar embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo. Este método es rentable y fácil de realizar utilizando placas de microscopía regulares con fondo de vidrio para obtener imágenes en un microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Montaje en agar en capas: preparación de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo con un microscopio invertido

Presentamos un protocolo para capturar la dinámica de la regeneración de la aleta caudal de las larvas de pez cebra a escala de tejido completo utilizando estereomicroscopía basada en campo claro. Esta técnica permite capturar la dinámica de regeneración con resolución de una sola célula. Esta metodología se puede adaptar a cualquier microscopio estereoscópico equipado con una cámara CCD y software de lapso de tiempo.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz es una excelente herramienta para obtener imágenes del desarrollo embrionario. Permite la grabación de vídeos de largo lapso de tiempo de embriones vivos en condiciones casi fisiológicas. Demostramos su aplicación para obtener imágenes del desarrollo del ojo del pez cebra a través de amplias escalas espacio-temporales y presentamos una línea para la fusión y deconvolución de conjuntos de datos multivista.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Aquí, presentamos un método de montaje versátil que permite la obtención de imágenes a largo plazo del desarrollo posterior del cuerpo de embriones vivos de pez cebra sin perturbar el desarrollo normal.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.

Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

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En este informe, proponemos una nueva aplicación de la luz de curado de resinas dentales base de montaje de los electrodos o sondas de microdiálisis en experimentos crónicos. Este material permite contacto directo con el cráneo.

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

Aprenda a montar embriones de pez cebra para microscopía de hoja de luz a largo plazo usando tubos FEP y agarosa. Esta técnica permite observar el desarrollo embrionario con alta resolución espacial y temporal.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

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