Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es montar un embrión de pez cebra para la microscopía de lámina óptica in vivo a largo plazo. Esto se logra limpiando primero un tubo fluorado, de etileno propileno o FEP y recubriéndolo con metilcelulosa. A continuación, se recubre un embrión de pez cebra de interés.

Luego, el embrión se transfiere primero a la agarosa derretida y luego al tubo FEP recubierto. Finalmente, se cierra la parte inferior del tubo con un tapón aros y se comprueba cuidadosamente la orientación del embrión montado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el desarrollo inalterado de los embriones de pez cebra durante varios días con alta resolución espacial y temporal a través de la microscopía de lámina de luz in vivo.

Pues bien, la principal ventaja sobre las técnicas existentes es que ahora podemos observar embriones de superpeces durante varios días y no sólo unas horas. Este método puede proporcionar información valiosa sobre la embriogénesis a largo plazo del pez cebra mediante microscopía de lámina óptica. También se puede aplicar a otros organismos pequeños como los pequeños organismos marinos.

También se puede utilizar con otras técnicas de microscopía como la tomografía de proyección óptica, la microscopía de campo amplio o la microscopía confocal. Las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque el protocolo implica algunos pasos críticos en cuanto al tiempo y juzgar la posición final del embrión requiere cierta experiencia. Para preparar un tubo FEP Primero, límpialo enjuagándolo repetidamente con un molar de hidróxido de sodio. A continuación, transfiera el tubo a un tubo de centrífuga de 50 mililitros lleno de hidróxido de sodio de 0,5 molares y ocho ultrasónicos durante 10 minutos.

Transfiera el tubo de polímero a un recipiente pequeño con agua destilada desionizada y enjuague. A continuación, siga con un lavado de etanol al 70% antes de transferirlo a un tubo de centrífuga nuevo. Con ultras de etanol.

Sonicar el tubo durante 10 minutos antes de transferirlo a un pequeño recipiente con agua destilada desionizada y enjuagarlo. Otra vez. Corta el tubo FEB limpio en trozos de tres centímetros de largo y alísalos si es necesario. Guarde los tubos limpios en un tubo nuevo de 50 mililitros lleno de agua destilada desionizada.

Prepare la solución madre de Trica. 3% de metilcelulosa y 1,5% y 0,1% de Aros de acuerdo con el protocolo de texto. Derretir el 1,5% de agarro y verterlo en una placa de Petri para formar una capa con un grosor de unos dos milímetros.

Recoja embriones de pez cebra en la etapa deseada que hayan expresado positivamente el gen de fluorescencia de elección y transfiéralos a una placa fresca de E tres bajo un estereoscopio. Con dos pinzas afiladas, cubra cuidadosamente los embriones usando una pinza para sujetar Corion y la segunda pinza para abrirlo y tirar de él para llevar a cabo el montaje de múltiples capas. Con las manos enguantadas, conecte una cánula de extremo romo a una jeringa.

Inserte con cuidado la cánula unos tres milímetros en un extremo de un trozo limpio de tubo FEP. A continuación, sumerja el extremo libre del tubo FEP en metilcelulosa al 3% y llene el tubo con la solución. Luego empuje lentamente la jeringa para liberar la metilcelulosa usando el medio E tres, repita los pasos de inmersión y expulsión.

Mientras tanto, en un bloque de calor, caliente una alícuota de 0,1%aros a 70 grados centígrados. Agite brevemente el tubo de reacción antes de transferirlo a un bloque de calor ajustado a 38 grados centígrados. Después de calentar, deje que el tubo se enfríe brevemente y agregue trica hasta una concentración final de 133 a 200 miligramos por litro y vórtice.

De nuevo, utilizando una pipeta de pasta de vidrio. Transfiera un embrión recubierto al tubo de reacción con los aros precalentados transfiriendo la menor cantidad posible de E tres. Con el tubo FEP y la jeringa conectada, tome suavemente una pequeña cantidad de aros antes de tomar el embrión y llene el tubo completamente con aros.

El embrión debe colocarse en cada extremo del tubo con la cabeza apuntando hacia la abertura. Para evitar fugas del contenido, mantenga el tubo en posición horizontal para taponar el tubo. Usa una cuchilla de afeitar para cortarlo de la cánula.

Luego, sosteniendo el tubo perpendicularmente, pegue lentamente el extremo del mismo a través de toda la capa de 1.5%aros y gírelo ligeramente. Para evitar el secado, mantenga la muestra montada en un tubo de reacción de 1,5 mililitros lleno de E tres medios antes de la toma de imágenes. Verifique que el pez dentro del tubo FEP esté colocado recto y luego su cabeza se asiente directamente sobre el tapón para obtener imágenes.

Agregue trica al medio dentro de la cámara de imagen. Aquí se muestra un transgénico un día después de la fertilización. Imagen del embrión de pez cebra K-G-R-L-G-F-P en el transcurso de dos días para observar el desarrollo de la vasculatura.

El pez cebra no está restringido por el medio de montaje y puede desarrollarse normalmente. Por ejemplo, su cabeza se levanta. La cola se extiende y el brote vascular parece sin obstáculos.

Esta técnica se puede realizar en 10 minutos si se realiza correctamente y todo el material está disponible. Recuerde realizar todos los pasos principales sin demora. Mantenga todas las soluciones limpias, ya que la suciedad puede perjudicar la calidad de la imagen final.