Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es montar un embrión de pez cebra para microscopía de hoja de luz in vivo a largo plazo. Esto se logra primero limpiando un tubo de politetrafluoroetileno, etileno propileno o FEP y recubriéndolo con metilcelulosa. A continuación, se recubre un embrión de pez cebra de interés.

Luego, el embrión se transfiere primero a agarosa fundida y después al tubo FEP recubierto. Finalmente, el fondo del tubo se cierra con un tapón de aros y se verifica cuidadosamente la orientación del embrión montado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el desarrollo no perturbado de embriones de pez cebra durante varios días con alta resolución espacial y temporal mediante microscopía de hoja de luz in vivo.

Bueno, la principal ventaja frente a las técnicas existentes es que ahora podemos observar embriones de pez super durante varios días y no solo unas pocas horas. Este método puede proporcionar información valiosa sobre la embriogénesis a largo plazo del pez cebra mediante microscopía de hoja de luz. También puede aplicarse a otros organismos pequeños, como organismos marinos diminutos.

También puede utilizarse junto con otras técnicas de microscopía, como la tomografía de proyección óptica, la microscopía de campo amplio o la microscopía confocal. Las personas no familiarizadas con este método podrían tener dificultades, ya que el protocolo incluye pasos críticos respecto al tiempo y requiere cierta experiencia para juzgar la posición final del embrión. Para preparar un tubo de FEP, primero límpielo pasando repetidamente hidróxido de sodio uno molar. Luego transfiera el tubo a un tubo cónico de 50 mililitros lleno con hidróxido de sodio 0,5 molar y sométalo a ultrasonido durante 10 minutos.

Transfiera el tubo de polímero a un recipiente pequeño con agua destilada desionizada y enjuáguelo. Luego, realice un enjuague con etanol al 70% antes de transferirlo a un tubo centrífugo nuevo. Con etanol ultras.

Sonicar el tubo durante 10 minutos antes de transferirlo a un pequeño recipiente con agua destilada desionizada y enjuagarlo nuevamente. Cortar el tubo FEB limpio en trozos de tres centímetros de longitud y enderezarlos si es necesario. Almacenar los tubos limpios en un tubo nuevo de 50 mililitros lleno con agua destilada desionizada.

Preparar la solución stock de Trica. 3% de metilcelulosa y ambos Aros al 1.5% y al 0.1% según el protocolo del texto. Fundir el agarro al 1.5% y verterlo en una placa de Petri para formar una capa con un espesor de aproximadamente dos milímetros.

Recoger embriones de pez cebra en la etapa deseada que hayan expresado positivamente el gen fluorescente de elección y transferirlos a una placa fresca con E tres bajo un estereoscopio. Utilizando dos pinzas finas, revestir cuidadosamente los embriones usando una pinza para sostener la coriona y la segunda pinza para rasgarla y retirarla, con el fin de realizar el montaje multicapa. Con las manos enguantadas, sujetar una cánula de extremo romo a una jeringa.

Inserte cuidadosamente la cánula aproximadamente tres milímetros dentro de uno de los extremos de un trozo limpio de tubo FEP. A continuación, sumerja el extremo libre del tubo FEP en metilcelulosa al 3% y llene el tubo con la solución. Luego, empuje lentamente la jeringa para liberar la metilcelulosa utilizando el medio E tres, repita los pasos de inmersión y expulsión.

Mientras tanto, en un bloque térmico, caliente un alícuota de 0,1 %aros a 70 grados Celsius. Vortexe brevemente el tubo de reacción antes de transferirlo a un bloque térmico ajustado a 38 grados Celsius. Después del calentamiento, deje que el tubo se enfríe brevemente y agregue trica hasta una concentración final de 133 a 200 miligramos por litro y vortexe.

Nuevamente, utilizando una pipeta de vidrio Pasteur, transfiera un embrión recubierto al tubo de reacción con AROS, transfiriendo la menor cantidad posible de E3. Con el tubo FEP y la jeringa acoplada, aspire suavemente una pequeña cantidad de AROS antes de aspirar el embrión y llene completamente el tubo con AROS.

El embrión debe colocarse en cualquiera de los extremos del tubo, con la cabeza orientada hacia la abertura. Para evitar que se derrame el contenido, mantenga el tubo en posición horizontal para taparlo. Utilice una cuchilla de afeitar para cortarlo de la cánula.

Luego, sosteniendo el tubo perpendicular, introduzca lentamente su extremo a través de toda la capa de agaros al 1,5 % y gírelo ligeramente. Para evitar el secado, mantenga la muestra montada en un tubo de reacción de 1,5 mililitros lleno con medio E tres antes de la adquisición de imágenes. Verifique que el pez dentro del tubo FEP esté posicionado recto y que su cabeza esté directamente encima del tapón para la adquisición de imágenes.

Añada trica al medio dentro de la cámara de imagen. Se muestra aquí un embrión transgénico de pez cebra K-G-R-L-G-F-P, un día después de la fertilización, imagenado durante el transcurso de dos días para observar el desarrollo de la vasculatura.

El pez cebra no está restringido por el medio de montaje y puede desarrollarse normalmente. Por ejemplo, levanta la cabeza. La cola se extiende y la formación de brotes vasculares aparece sin impedimentos.

Esta técnica puede realizarse en 10 minutos si se lleva a cabo correctamente y todos los materiales están fácilmente disponibles. Recuerde realizar todos los pasos principales sin ninguna demora. Mantenga todas las soluciones limpias, ya que la suciedad puede afectar la calidad final de la imagen.