El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar Chlamydia Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la dinámica de crecimiento de la inclusión de clamidia en células vivas. Esto se logra generando primero células huésped fluorescentes que expresan de manera estable una proteína fluorescente como GFP en su citoplasma. A continuación, las células huésped se infectan con clamidia y se les permite incubar.

A continuación, las células infectadas se visualizan mediante microscopía de fluorescencia en vivo. Finalmente, las características de inclusión de clamidia se cuantifican a través de un software de análisis de microscopio, en última instancia, se utiliza la microscopía de fluorescencia en vivo para visualizar las inclusiones de clamidia dentro de la célula huésped y para medir los parámetros biológicos de las inclusiones para obtener resultados cuantitativos. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la enumeración basada en anticuerpos, son que esta estrategia de imagen inversa se puede utilizar en células vivas y también en colaboración con otras marcas fluorescentes para cuantificar la dinámica de inclusión de todas las especies de clamidia.

Además, a diferencia de los métodos rutinarios que etiquetan las bacterias en las células, este enfoque ilumina la membrana de inclusión en las células vivas y, por lo tanto, puede revelar importantes propiedades dinámicas del compartimento que contiene este patógeno. Después de generar células hela fluorescentes, de acuerdo con la placa de protocolo de texto, las células Hela GFP en un recipiente de cultivo deseado, como placas con fondo de vidrio para imágenes de alta resolución, 4 placas de 24 pocillos para la determinación de IFU y detección de pocillos múltiples, descongelan un tubo congelado que contiene crichcotus, o cualquier otra cepa de clamidia deseada en hielo y se diluyen en HBSS hasta la multiplicidad deseada de infección. Para realizar una infección estática con Crich Cotus, LGV zero VL dos aspira los medios de los pocillos y utiliza HBSS para lavar las células hela GFP.

Agregue bacterias diluidas a los pocillos e incube a 25 grados centígrados durante dos horas, aspire las células y lave con HBSS. Luego, después de agregar el medio de crecimiento, incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono para realizar una infección asistida por centrifugación con crich a serovar D o cualquier otra cepa de clamidia. Use HBSS para lavar las células hela GFP y agregar bacterias diluidas a las células.

A continuación, coloque la placa de células infectadas en un soporte de placa de pocillos múltiples de un rotor de cubo oscilante en una centrífuga de sobremesa. Centrifugar las células a 900 veces G y 25 grados centígrados durante una hora. Luego coloque los recipientes de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora en un gabinete de bioseguridad, aspire las células, lave dos veces con HBSS y agregue medio de crecimiento.

Incubar la placa de células infectadas a 37 grados centígrados. Para visualizar las inclusiones de clamidia, retire las células hela GFP infectadas con clamidia de la incubadora de dióxido de carbono y use RPMI sin rojo de fenol y 5% FBS Para reemplazar el medio, coloque la placa o la placa de pocillos múltiples en un microscopio de fluorescencia invertida con un objetivo de aceite de 20 x o más. Utilizando un software de imágenes, identifique las células hela GFP infectadas con clamidia que aparecen como células verdes que contienen grandes agujeros negros.

En el cuadro de diálogo de configuración de adquisición, configure el software para adquirir el canal verde y cualquier otro canal agregado en la muestra. Utilice el botón de registro de barra diagonal de captura para adquirir la imagen en los momentos deseados. Post-infección. Retire las células hela GFP infectadas con clamidia de la incubadora y coloque la placa en un microscopio de fluorescencia inversor.

Concéntrese en las llanuras medias de las celdas donde las inclusiones están en su diámetro y rendimiento máximos. Los bordes nítidos adquieren imágenes en al menos 10 campos por pocillo. Los pozos suelen representar réplicas o variables experimentales.

Para encontrar celdas hela GFP en la pestaña de mediciones, utilice el comando buscar objetos y seleccione el canal verde. Ajuste la intensidad del umbral en función de las intensidades relativas de las celdas. Cuente manualmente el número de inclusiones o compartimentos negros y células hela GFP a ojo o utilice algoritmos de software de imágenes para identificar y contar automáticamente las inclusiones.

Filtre los objetos seleccionados manteniendo solo aquellos que tengan más de cinco micrómetros cuadrados. Refiérase a esto como población uno. Con este llenado, aplique el comando rellenar agujeros en objetos como entrada, este paso genera un poblado dos.

Reste la población uno de la población dos para obtener inclusiones de clamidia marcadas positivamente designadas como población tres. Utilice el comando filter population para aplicar un filtro de tamaño a la población tres. Por ejemplo, si se mantienen objetos de más de 25 micrómetros cuadrados para inclusiones en células, infectados durante 24 horas o más para tiempos de infección temprana, se establece el filtro de tamaño para mantener objetos de más de cuatro micrómetros cuadrados.

Como estas inclusiones son mucho más pequeñas, el filtro de tamaño da como resultado una población de objetos designados como inclusiones. Utilice el software de imágenes para calcular datos cuantitativos de las imágenes, como el número de inclusión, la inclusión, el tamaño y la inclusión. La circunferencia tras la infección con las inclusiones de clamidia es fácilmente visible como manchas negras y las células huésped o proteínas fluorescentes que expresan clamidia dentro de las células huésped, y su claridad puede aprovecharse para la identificación automatizada en numerosos campos de visión o tratamientos.

Como se demuestra en este gráfico, una aplicación importante es la determinación de unidades formadoras de inclusión de clamidia en células infectadas vivas, lo que evita la necesidad de procedimientos de inmunofluorescencia, que requieren mucho tiempo y son costosos. Otra característica clave de este enfoque de imagen es que se puede aplicar fácilmente a cualquier especie o cepa de clamidia. En este ejemplo, se realizó un análisis de la evolución temporal de las células hela GFP infectadas con una de las cuatro especies o cepas de clamidia para cada una de estas especies y cepas.

Las inclusiones se marcaron y analizaron para calcular su área promedio, longitud de perímetro y número por celda en los tiempos indicados. Estos atributos proporcionan información importante sobre la biología de las inclusiones de clamidia, incluida la forma en que interactúan con la célula huésped. Aquí se muestra un video de células de hela de cereza m infectadas con GFPC, Tracom L dos compuesto por imágenes de lapso de tiempo tomadas a intervalos de cinco minutos durante 125 minutos, comenzando a las 48 horas después de la infección.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar esta técnica de imagen inversa no solo para visualizar las inclusiones de clamidia, sino también para cuantificar la dinámica de inclusión, como el perímetro del área de inclusión y el número de inclusiones por celda. Esta técnica es rentable en comparación con las técnicas de visualización más tradicionales y funciona con todas las especies y cepas de clamidia.