Name: El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar Chlamydia Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la dinámica de crecimiento de inclusiones de Chlamydia en células vivas mediante proteínas fluorescentes. Este método permite analizar infecciones en tiempo real con mayor eficiencia que las técnicas tradicionales basadas en anticuerpos.

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Los autores agradecen a Ian Clarke y P. Scott Hefty por los plásmidos pGFP-SW2 y pASK-GFP-mKate2-L2, respectivamente. Agradecemos a Paul Miller por su asistencia técnica y a Richard Stephens por otros recursos. Este trabajo fue financiado por el AI095603 de subvenciones de los NIH (KH).

1. Generación de host fluorescente Líneas Celulares <ol><li> Día 1. Las células 293T Plate (u otra línea de envasado retroviral) en placas de 6 pocillos a 2 x 10 6 células / Bueno, para ser ~ 75% confluentes al día siguiente. Si se desea, la placa de pocillos duplicados para cada uno de retrovirus a utilizar. </li><li> Día 2. células Aspirar y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamina). Transfectar células con 5-8 g cada uno de vector retroviral (que contiene GFP) y envasado vector (por ejemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 o reactivo similar y siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Se incuban las células con el ADN durante 4-6 horas en un incubador de CO2 C 37 °, y posteriormente sustituir medio con medio de crecimiento 1 ml. </li><li> Se incuban las células durante 48 horas en 37 ° C incubadora de CO 2. </li><li> Día de las células 3. Placa de destino (por ejemplo., HeLa) en placas de 6 pocillos a una densidad aproximada de 10 5 células / pocillo, para ser ~ 50% de confluencia deldía siguiente. Verificar la transfección positiva en células 293T mediante el control de la fluorescencia de GFP en un microscopio invertido. </li><li> Día 4. Recoger sobrenadantes fuera de las células 293T con una pipeta y filtrar el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de acetato de 0,45 micras de celulosa que contienen retrovirus. </li><li> Retire medio a partir de células HeLa y añadir medio de crecimiento de 0,5 ml contiene 16 mg / ml de polibreno. Añadir ~ 0,5 ml de retrovirus filtrada a las células gota a gota e incubar las células en una incubadora de CO 2 C 37 ° durante 24 horas. Almacenar cualquier retrovirus restantes (es decir, desde el duplicar pocillo) a 4 ° C. </li><li> Día 5. Si se hicieron pocillos duplicados para generar retrovirus adicional, repita el paso 1.7 para infectar serie con las partículas retrovirales restantes. </li><li> Día 6. Passage células HeLa transfectadas 1: 1 en una placa de 10 cm que contiene la selección de antibióticos (por ejemplo, 500 mg / ml de neomicina). </li><li> Espere el tiempo suficiente para que las células transducidas a crecer de nuevo en presencia de la selección antibiotic, después de lo cual las células se pueden propagar mediante técnicas estándar con una concentración más baja de antibiótico de selección (por ejemplo., 200 mg / ml de neomicina). Nota: Las células también se pueden seleccionar clonalmente para el brillo ideales en este momento, si es necesario. </li></ol> 2. Generación de GFP-expresión de Chlamydia trachomatis <ol><li> Preparar 2x CaCl 2 tampón (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl 2) y tampón 4SP (0,4 M sacarosa, 16 mM Na 2 HPO 4). </li><li> Día 1. Descongele congelada C. trachomatis disponible el hielo e inmediatamente diluir 10 l bacterias en 50 l 2x CaCl tampón 2. Añadir 3 ADN plásmido mg (por ejemplo., PASK-GFP-mKate2-L2), mezclar bien e incubar durante 30 minutos a 25 ° C. </li><li> Durante este paso, preparar células huésped mediante tripsinización un matraz T-75 de células McCoy en un tubo de centrífuga. Centrifugar la suspensión celular a 50 xg durante 5 min y descartar el sobrenadante. Resuspend celular pellet en volumen apropiado de tampón 1x CaCl 2 para dar una concentración final de 4 x 10 7 células / ml. </li><li> Después de la incubación de 30 min (de la etapa 2.2), añadir 100 l preparados células McCoy para tubo de mezcla de transformación (volumen total 200 l) y se incuba un 20 min adicionales a 25 ° C. Añadir 100 l de esta mezcla de células transformadas a un solo pocillo de una placa de 6 pocillos y superposición con medio 2 ml crecimiento. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2 días. </li><li> Día 3. células Lyse McCoy infectadas con C. trachomatis mediante la sustitución de medio con 1 ml de dH 2 O y raspado de células con una punta de pipeta de 1.000 l doblada. Añadir 1 ml de tampón 4SP y pasar la suspensión a través de una aguja de 27,5 G ~ 5 veces para la lisis celular eficiente y liberación de C. trachomatis. </li><li> Transferencia de 2 ml del lisado celular que contiene C. trachomatis a un matraz T-75 que contiene una monocapa confluente de recién chapado McCcélulas oy; añadir 8 ml de DMEM (sin FBS) y se incuba durante 2 horas a 25 ° C para permitir C. trachomatis a que se adhieran a las células. </li><li> Células Aspirar y añadir medio de crecimiento fresco suplementado con 10 U / ml de penicilina G y 1 mg / ml de cicloheximida. Incubar matraz durante 48 h en una incubadora de 37 ° C CO 2. </li><li> Día 4. Verifique por microscopía de luz que las células están infectadas y inclusiones contienen Chlamydia aberrante. Identificar inclusiones como vacuolas brillantes en un microscopio óptico estándar, y los organismos de Chlamydia aberrantes como objetos de anillo dentro de inclusiones que son mayores de 2 m de diámetro. </li><li> Día 5. cultura Lyse reemplazando medio con 2 ml dH2O y raspar las células en una suspensión. Añadir 2 ml de tampón 4SP y pasar la suspensión a través de una aguja de 27,5 G ~ 5 veces. </li><li> Utilice 2 ml de lisado de células para infectar una monocapa fresca de células McCoy en un solo pocillo en una placa de 6 pocillos. Se incuban las células con lisado durante 2 horas a 25 ° C, y añadir aspirado de crecimiento frescomedio que contiene penicilina G y cicloheximida. </li><li> Se incuban las células en una incubadora a 37 ° C CO 2 durante 3-5 días, dependiendo de la salud general de las células. </li><li> Repita los pasos 2.9-2.10 una o más veces, según sea necesario, culturas pases en pozos frescas en una placa de 6 pocillos hasta inclusiones buscan normales (desprovistos de cuerpos aberrantes) han surgido. En este momento utilizar un microscopio de fluorescencia invertida para comprobar que C. trachomatis expresar mKate2 (rojo). </li><li> Ampliar los cultivos infectados para la generación de las poblaciones de clamidias alto título, por ejemplo, mediante la recolección de transformantes Chlamydia de células McCoy o HeLa infectadas cultivadas en matraces T-150. </li></ol> 3. La infección de células con Chlamydia <ol><li> Placa células GFP-HeLa en recipiente de cultivo deseada, por ejemplo, platos de vidrio de fondo o la cámara de diapositivas de imágenes de alta resolución, o placas de 24 pocillos para la determinación IFU y la detección de múltiples pocillos. </li><li> Descongele frotubo de zen que contiene C. trachomatis, C. muridarum, o C. pneumoniae en hielo y diluido en HBSS a la multiplicidad deseada de infección (MOI), por ejemplo MOI = 1. </li><li> Realizar infecciones ya sea estáticas o centrifugación asistido basado en la cepa particular Chlamydia que se utilizará. <ol><li> Para las infecciones con C. trachomatis LGV serovar L2 o C. muridarum, lavar las células GFP-HeLa con HBSS y se incuba con bacterias diluidas durante 2 horas a 25 ° C. Aspirar y lavar las células con HBSS, e incubar las células en medio de crecimiento en 37 ° C incubadora de CO 2. </li><li> Para las infecciones con C. trachomatis serovar D o C. pneumoniae, lavar las células GFP-HeLa con HBSS y añadir bacterias diluidas a las células. Coloque la placa de múltiples pocillos o plato de fondo de cristal (garantizado por la cinta en una tapa de placa de múltiples pocillos) en un soporte de la placa de múltiples pocillos de un accesorio de rotor basculante en una centrífuga de mesa. </li><li> Células centrifugar a 900 xg a 25 ° C durante 1 hora. </li&gt; <li> Retire recipientes de cultivo de centrífuga y el lugar en una incubadora a 37 ° C CO 2 durante 1 hora. </li><li> Aspirar las células en un gabinete de bioseguridad, se lavan las células dos veces con HBSS, y añadir medio de cultivo fresco. Coloque las células en un incubador de CO2 C 37 °. </li></ol></li></ol> 4. Visualización de células vivas de Chlamydia Inclusiones <ol><li> Retire Chlamydia infectadas células GFP-HeLa de CO 2 incubadora y reemplazar medio con RPMI sin rojo fenol + 5% de SFB. </li><li> Células de montaje en un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse Ti-E o similar) usando un objetivo 20X o superior petróleo. </li><li> El uso de software de imagen (Volocity 6 o similar), se centran en identificar y clamidia infecta células GFP-HeLa: células verdes que contienen grandes agujeros negros (inclusiones de Chlamydia). </li><li> Marque las ubicaciones xyz de las regiones que contienen las células infectadas por clamidia de interés utilizando software de imagen (Volocity 6 o similar). Realizar esto manualmente &quot;Añadir puntos &#39;, mientras que en el modo de vista XY escenario. De esta manera, las coordenadas xyz se guardan para cada ubicación marcada. </li><li> En el cuadro de diálogo Configuración de Adquisición, configurar el software para adquirir verde (GFP, HeLa citosol) y rojo (mKate2, C. trachomatis) canales, ya una tasa de nuevos cuadros por canal cada 5 min. </li><li> Adquirir la secuencia de imágenes mediante la adquisición de protocolo entró anterior haciendo clic en el botón &quot;Capture / Record&quot;. </li></ol> 5. La cuantificación de los parámetros de crecimiento de inclusión en células vivas <ol><li> En tiempos deseados después de la infección (por ejemplo., 24, 48 hpi) eliminar clamidia infecta células GFP-HeLa de la incubadora y montar en un microscopio de fluorescencia invertida. Nota: Un objetivo 20X o 40X aire con un alto NA es más adecuado para las placas de 24 pocillos, y se recomienda un objetivo de aceite de 40X para la cámara de diapositivas. Crecer células a cada sustrato para este culoay. </li><li> Concéntrese en planos medios de las células, donde las inclusiones están en su diámetro máximo y producir bordes nítidos. </li><li> Adquirir imágenes de muchos campos en cada pocillo (por lo menos 10 por pocillo); pozos normalmente representan réplicas o variables experimentales. </li><li> Enumerar el número de inclusiones de forma manual, por el ojo (inclusiones son compartimentos negros en células GFP-HeLa) o utilizar algoritmos de software de formación de imágenes para identificar y contar automáticamente las inclusiones. <ol><li> Encuentra células GFP-HeLa por la intensidad de fluorescencia (&#39;Encuentra Objetos&#39; comando) y ajustar la intensidad umbral de fluorescencia basada en intensidades relativas de las células. </li><li> Filtrar objetos seleccionados utilizando directrices de tamaño de mantener sólo aquellos mayores de 5 micras 2. Se trata de &#39;población 1&#39;. </li><li> Aplicar &#39;Rellenar agujeros en objetos&#39; comando utilizando &#39;población 1&#39; como entrada. Este paso genera &#39;población 2&#39;. </li><li> Reste &#39;población 1&#39; de &#39;población 2 &#39;para dar marcó positivamente inclusiones de Chlamydia, designados como &quot;población 3&#39;. </li><li> Aplicar filtro de tamaño de &quot;población 3 &#39;(comando&#39; Filtro Población &#39;), por ejemplo, los objetos de mantenimiento mayor que 25 m 2 para inclusiones en células infectadas durante 24 horas o más. Para tiempos de infección temprana, como antes de la 18 horas, filtro de tamaño ajustado para mantener los objetos de más de 4 m 2, ya que estas inclusiones son mucho más pequeños. Resultados de filtrado Tamaño de una población de objetos designados como &quot;inclusiones&quot;. </li><li> Calcular datos cuantitativos a partir de imágenes, por ejemplo, número de la inclusión, el tamaño de la inclusión, y la circunferencia de la inclusión, utilizando software de imágenes. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aquí se describe la estrategia experimental para la generación de células huésped fluorescentes para visualización en tiempo real y análisis de inclusiones de Chlamydia. Este enfoque visualización vacuola confiere la poderosa capacidad de iluminar, rastrear y cuantitativamente medir las propiedades dinámicas de inclusiones clamidias través de las poblaciones de células o en células individuales en el tiempo. Inclusiones de Chlamydia en las células de proteínas etiquetados fluorescentes están sorprenden...

Las enfermedades infecciosas causadas por especies de la bacteria Chlamydia intracelular provocan una carga importante en la salud global, incluyendo enfermedades de transmisión sexual, enfermedad inflamatoria pélvica, la ceguera, neumonía y posiblemente aterosclerosis 1.4. La capacidad de Chlamydia para interactuar con la célula huésped, desde dentro de una vacuola (denominada la inclusión), es un determinante crítico para su éxito de la infección de las células y el anfitrión. La inclusión es una novela compartimento patógeno que permite el crecimiento por clamidias y se modifica dinámicamente durante todo el ciclo de desarrollo de 2-3 días de Chlamydia 5. La naturaleza intracelular obligado de clamidias presenta numerosos retos para la comunidad de investigación, en particular para estudiar directamente de la biología única de la inclusión. Un obstáculo importante ha sido la incapacidad de visualizar de manera eficiente ya sea Chlamydia intracelular o su inclusión por el enfoque fluorescenteES en células vivas. Un descubrimiento reciente ha revelado por fin los medios para generar GFP expresando C. trachomatis 6; Sin embargo, este hallazgo aún no ha dado lugar a un etiquetado específico de la inclusión. Algunas técnicas se han descrito para el etiquetado de las bacterias y las inclusiones 7,8, pero adolecen de deficiencias tales como la no especificidad, la transitoriedad y la susceptibilidad a photobleaching. Un descubrimiento clave de nuestro grupo estableció una nueva estrategia para la iluminación de la inclusión mediante las buenas prácticas agrarias que expresan las células anfitrionas 9. Esta estrategia explota racionalmente la impermeabilidad intrínseca de la inclusión de membrana a las moléculas de mayor que 520 Da 10. Cuando las células están diseñados para expresar de forma estable una proteína fluorescente citosólica particular (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias o mCherry), inclusiones de Chlamydia son visibles con notable claridad por su exclusión completa de fluorescencia. Esta estrategia de inversión de imágenes permite la visualización inmediata de inclusiones para todos Chlespecies amydia y que se pueden adaptar fácilmente para la mayoría de las células huésped de interés. Como demostración de su utilidad, este método fue utilizado anteriormente para revelar y definir las vías de salida celulares para Chlamydia spp 9. Aquí, una vez más demostrar cómo se realiza este procedimiento, y puede ser explotado para obtener datos cuantitativos clave acerca de la dinámica de crecimiento de inclusión. Además, se puede sustituir con eficacia de costosos métodos de enumeración basadas en anticuerpos y se puede utilizar en conjunto con otras etiquetas fluorescentes, tales como mKate2-expresión de Chlamydia 11. Esta poderosa combinación de herramientas permite la exploración de las propiedades físicas de la membrana inclusión clamidia dentro de las células anfitrionas de estar.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m filtros</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 sin rojo fenol</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cámara, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; chlamydia</em&gt; vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

La bacteria intracelular obligada Chlamydia provoca una gran carga para la salud pública mundial. C. trachomatis es la principal causa bacteriana de infecciones de transmisión sexual y también la principal causa de ceguera prevenible en el mundo. Un determinante esencial para el éxito de la infección de las células huésped por Chlamydia es la capacidad de la bacteria para manipular la señalización de la célula huésped desde el interior de un nuevo compartimento vacuolar llamado inclusión. Desde dentro de la inclusión, la clamidia adquiere los nutrientes necesarios para su crecimiento de desarrollo de 2-3 días y, además, segrega un panel de proteínas efectoras en la cara citosólica de la membrana de la vacuola y en el citosol del huésped. Sin embargo, las brechas en nuestra comprensión de la biología de la clamidia presentan desafíos significativos para visualizar y analizar este compartimento intracelular. Recientemente, se describió una estrategia de imagen inversa para visualizar la inclusión utilizando células huésped que expresan GFP. Este enfoque explota racionalmente la impermeabilidad intrínseca de la membrana de inclusión a moléculas grandes como la GFP. En este trabajo, describimos cómo se generan células huésped que expresan GFP o mCherry para la posterior visualización de inclusiones de clamidia. Además, se ha demostrado que este método sustituye eficazmente a los costosos métodos de enumeración basados en anticuerpos, se puede utilizar junto con otras etiquetas fluorescentes, como la clamidia que expresa GFP, y se puede explotar para obtener datos cuantitativos clave sobre el crecimiento de la membrana de inclusión a partir de una serie de especies y cepas de Chlamydia.

Las células de mamífero que expresan proteínas fluorescentes citosólicas (por ejemplo, GFP) pueden ser diseñados para permitir la iluminación de inclusiones de Chlamydia en cultivos de células en vivo, infectados. Tras la infección con Chlamydia, las inclusiones son fácilmente visibles como puntos negros en las células huésped (Figura 1). La claridad de las inclusiones de fluorescencia de carecer puede ser explotado para la identificación automática de las inclusiones a través...

Se describe un método basado en proteínas fluorescentes de células vivas para iluminar vacuolas celulares (inclusiones) que contienen Chlamydia. Esta estrategia permite la determinación rápida y automatizada de la infectividad de Chlamydia en muestras y se puede utilizar para investigar cuantitativamente la dinámica de crecimiento de la inclusión.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la dinámica del crecimiento de inclusiones clamidiales en células vivas. Esto se logra primero generando células huésped fluorescentes que expresan de manera estable una proteína fluorescente, como GFP, en su citoplasma. A continuación, las células huésped se infectan con clamidia y se dejan incubar.Luego, las células infectadas se visualizan mediante microscopía de fluorescencia en vivo. Finalmente, las características de las inclusiones de clamidia se cuantifican mediante software de análisis microscópico; en última instancia, la microscopía de fluorescencia en vivo se utiliza para visualizar las inclusiones clamidiales dentro de la célula huésped y para medir parámetros biológicos de las inclusiones, obteniendo así resultados cuantitativos. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes, como la enumeración basada en anticuerpos, son que esta estrategia de imagen inversa puede emplearse en células vivas y también en combinación con otras etiquetas fluorescentes para cuantificar la dinámica de inclusiones de todas las especies clamidiales.Además, a diferencia de los métodos rutinarios que etiquetan bacterias en las células, este enfoque ilumina la membrana de inclusión en células vivas y, por lo tanto, puede revelar propiedades dinámicas importantes de este compartimento que contiene el patógeno. Después de generar células HeLa fluorescentes, según el protocolo descrito en el texto, sembrar las células HeLa GFP en un recipiente de cultivo deseado, como placas con fondo de vidrio para imágenes de alta resolución, placas de 24 pozos para la determinación de UFIs y placas multipozo para cribado, descongelar un tubo congelado que contiene Crich Cotus, o cualquier otra cepa de clamidia deseada, sobre hielo y diluirlo en HBSS hasta la multiplicidad de infección deseada. Para realizar una infección estática con Crich Cotus, LGV serovar L2, aspirar el medio de los pozos y usar HBSS para lavar las células HeLa GFP.Añada bacterias diluidas a los pocillos e incube a 25 grados Celsius durante dos horas, aspire las células y lávelas con HBSS. Luego, tras añadir el medio de crecimiento, incube las células a 37 grados Celsius en un incubador de dióxido de carbono para realizar una infección asistida por centrifugación con crich a la serovar D o cualquier otra cepa de Chlamydia. Use HBSS para lavar las células HeLa GFP y añada bacterias diluidas a las células.Luego, coloque el recipiente con las células infectadas en un soporte de placa multipozo de un rotor de cubeta oscilante en una centrífuga de banco. Centre las células a 900 veces G y 25 grados Celsius durante una hora. A continuación, coloque los recipientes de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora dentro de una cabina de seguridad biológica, aspire el medio, lave las células dos veces con HBSS y agregue el medio de crecimiento.Incube el recipiente con células infectadas a 37 grados Celsius. Para visualizar las inclusiones de clamidia, retire las células HeLa GFP infectadas con clamidia del incubador de dióxido de carbono y utilice RPMI sin rojo de fenol y con 5 % de FBS para reemplazar el medio. Coloque el recipiente o la placa de múltiples pocillos sobre un microscopio invertido de fluorescencia con un objetivo de inmersión en aceite de 20x o mayor. Mediante el uso de software de imagen, identifique las células HeLa GFP infectadas con clamidia que aparecen como células verdes que contienen grandes huecos negros.En el cuadro de diálogo de configuración de adquisición, configure el software para adquirir el canal verde y cualquier otro canal añadido en la muestra. Utilice el botón de captura o grabación para adquirir la imagen en los momentos deseados posteriores a la infección. Retire las células HeLa GFP infectadas con chlamydia del incubador y coloque el recipiente en un microscopio de fluorescencia invertido.Enfóquese en las regiones medias de los planos celulares donde las inclusiones presentan su diámetro y rendimiento máximos. Capture imágenes con bordes nítidos en al menos 10 campos por pocillo. Por lo general, los pocillos representan réplicas o variables experimentales.Para encontrar las células GFP hela dentro de la pestaña de mediciones, utilice el comando encontrar objetos y seleccione el canal verde. Ajuste la intensidad umbral según las intensidades relativas de las células. Cuente manualmente el número de inclusiones o compartimentos negros y las células GFP hela a simple vista, o utilice algoritmos de software de imagen para identificar y contar automáticamente las inclusiones.Filtre los objetos seleccionados conservando solo aquellos mayores de cinco micrómetros cuadrados. Denomine esta población como población uno. Utilizando esta población, aplique el comando de rellenar huecos en objetos como entrada; este paso genera la población dos.Reste la población uno de la población dos para obtener inclusiones de clamidia marcadas positivamente, designadas como población tres. Utilice el comando filtrar población para aplicar un filtro de tamaño a la población tres. Por ejemplo, para mantener objetos mayores a 25 micrómetros cuadrados en inclusiones en células infectadas durante 24 horas o más, en tiempos tempranos de infección, configure el filtro de tamaño para conservar objetos mayores a cuatro micrómetros cuadrados.Dado que estas inclusiones son mucho más pequeñas, el filtro de tamaño da como resultado una población de objetos designados como inclusiones. Utilice el software de imagen para calcular datos cuantitativos a partir de las imágenes, como el número de inclusiones, el tamaño de las inclusiones y la circunferencia de las inclusiones. Tras la infección con clamidia, las inclusiones son fácilmente visibles como puntos negros y las células huésped o la proteína fluorescente expresada por la clamidia dentro de las células huésped, y su nitidez puede aprovecharse para la identificación automatizada en múltiples campos de visión y/o tratamientos.Como se demuestra en este gráfico, una aplicación importante es la determinación de unidades formadoras de inclusiones de clamidia en células infectadas vivas, lo que elimina la necesidad de procedimientos de inmunofluorescencia, que son tanto lentos como costosos. Otra característica clave de este enfoque de imagen es que puede aplicarse fácilmente a cualquier especie o cepa de clamidia. En este ejemplo, se realizó un análisis de curso temporal de células HeLa GFP infectadas con una de cuatro especies o cepas de clamidia para cada una de estas especies y cepas.Las inclusiones fueron marcadas y analizadas para calcular su área promedio, longitud del perímetro y número por célula en los tiempos indicados. Estos atributos proporcionan información importante sobre la biología de las inclusiones clamidiales, incluyendo cómo interactúan con la célula huésped. Aquí se muestra un video de células HeLa mCherry infectadas con GFPC, Tracom L2, compuesto por imágenes de lapso de tiempo tomadas a intervalos de cinco minutos durante 125 minutos, comenzando a las 48 horas posteriores a la infección.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar esta técnica de imagen inversa no solo para visualizar inclusiones de Chlamydia, sino también para cuantificar la dinámica de las inclusiones, como el área de la inclusión, el perímetro y el número de inclusiones por célula. Esta técnica es rentable en comparación con técnicas de visualización más tradicionales y funciona con todas las especies y cepas de Chlamydia.

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