El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la dinámica del crecimiento de inclusiones clamidiales en células vivas. Esto se logra primero generando células huésped fluorescentes que expresan de manera estable una proteína fluorescente, como GFP, en su citoplasma. A continuación, las células huésped se infectan con clamidia y se dejan incubar.

Luego, las células infectadas se visualizan mediante microscopía de fluorescencia en vivo. Finalmente, las características de las inclusiones de clamidia se cuantifican mediante software de análisis microscópico; en última instancia, la microscopía de fluorescencia en vivo se utiliza para visualizar las inclusiones clamidiales dentro de la célula huésped y para medir parámetros biológicos de las inclusiones, obteniendo así resultados cuantitativos. Las principales ventajas de esta técnica frente a métodos existentes, como la enumeración basada en anticuerpos, son que esta estrategia de imagen inversa puede emplearse en células vivas y también en combinación con otras etiquetas fluorescentes para cuantificar la dinámica de inclusiones de todas las especies clamidiales.

Además, a diferencia de los métodos rutinarios que etiquetan bacterias en las células, este enfoque ilumina la membrana de inclusión en células vivas y, por lo tanto, puede revelar propiedades dinámicas importantes de este compartimento que contiene el patógeno. Después de generar células HeLa fluorescentes, según el protocolo descrito en el texto, sembrar las células HeLa GFP en un recipiente de cultivo deseado, como placas con fondo de vidrio para imágenes de alta resolución, placas de 24 pozos para la determinación de UFIs y placas multipozo para cribado, descongelar un tubo congelado que contiene Crich Cotus, o cualquier otra cepa de clamidia deseada, sobre hielo y diluirlo en HBSS hasta la multiplicidad de infección deseada. Para realizar una infección estática con Crich Cotus, LGV serovar L2, aspirar el medio de los pozos y usar HBSS para lavar las células HeLa GFP.

Añada bacterias diluidas a los pocillos e incube a 25 grados Celsius durante dos horas, aspire las células y lávelas con HBSS. Luego, tras añadir el medio de crecimiento, incube las células a 37 grados Celsius en un incubador de dióxido de carbono para realizar una infección asistida por centrifugación con crich a la serovar D o cualquier otra cepa de Chlamydia. Use HBSS para lavar las células HeLa GFP y añada bacterias diluidas a las células.

Luego, coloque el recipiente con las células infectadas en un soporte de placa multipozo de un rotor de cubeta oscilante en una centrífuga de banco. Centre las células a 900 veces G y 25 grados Celsius durante una hora. A continuación, coloque los recipientes de cultivo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora dentro de una cabina de seguridad biológica, aspire el medio, lave las células dos veces con HBSS y agregue el medio de crecimiento.

Incube el recipiente con células infectadas a 37 grados Celsius. Para visualizar las inclusiones de clamidia, retire las células HeLa GFP infectadas con clamidia del incubador de dióxido de carbono y utilice RPMI sin rojo de fenol y con 5 % de FBS para reemplazar el medio. Coloque el recipiente o la placa de múltiples pocillos sobre un microscopio invertido de fluorescencia con un objetivo de inmersión en aceite de 20x o mayor. Mediante el uso de software de imagen, identifique las células HeLa GFP infectadas con clamidia que aparecen como células verdes que contienen grandes huecos negros.

En el cuadro de diálogo de configuración de adquisición, configure el software para adquirir el canal verde y cualquier otro canal añadido en la muestra. Utilice el botón de captura o grabación para adquirir la imagen en los momentos deseados posteriores a la infección. Retire las células HeLa GFP infectadas con chlamydia del incubador y coloque el recipiente en un microscopio de fluorescencia invertido.

Enfóquese en las regiones medias de los planos celulares donde las inclusiones presentan su diámetro y rendimiento máximos. Capture imágenes con bordes nítidos en al menos 10 campos por pocillo. Por lo general, los pocillos representan réplicas o variables experimentales.

Para encontrar las células GFP hela dentro de la pestaña de mediciones, utilice el comando encontrar objetos y seleccione el canal verde. Ajuste la intensidad umbral según las intensidades relativas de las células. Cuente manualmente el número de inclusiones o compartimentos negros y las células GFP hela a simple vista, o utilice algoritmos de software de imagen para identificar y contar automáticamente las inclusiones.

Filtre los objetos seleccionados conservando solo aquellos mayores de cinco micrómetros cuadrados. Denomine esta población como población uno. Utilizando esta población, aplique el comando de rellenar huecos en objetos como entrada; este paso genera la población dos.

Reste la población uno de la población dos para obtener inclusiones de clamidia marcadas positivamente, designadas como población tres. Utilice el comando filtrar población para aplicar un filtro de tamaño a la población tres. Por ejemplo, para mantener objetos mayores a 25 micrómetros cuadrados en inclusiones en células infectadas durante 24 horas o más, en tiempos tempranos de infección, configure el filtro de tamaño para conservar objetos mayores a cuatro micrómetros cuadrados.

Dado que estas inclusiones son mucho más pequeñas, el filtro de tamaño da como resultado una población de objetos designados como inclusiones. Utilice el software de imagen para calcular datos cuantitativos a partir de las imágenes, como el número de inclusiones, el tamaño de las inclusiones y la circunferencia de las inclusiones. Tras la infección con clamidia, las inclusiones son fácilmente visibles como puntos negros y las células huésped o la proteína fluorescente expresada por la clamidia dentro de las células huésped, y su nitidez puede aprovecharse para la identificación automatizada en múltiples campos de visión y/o tratamientos.

Como se demuestra en este gráfico, una aplicación importante es la determinación de unidades formadoras de inclusiones de clamidia en células infectadas vivas, lo que elimina la necesidad de procedimientos de inmunofluorescencia, que son tanto lentos como costosos. Otra característica clave de este enfoque de imagen es que puede aplicarse fácilmente a cualquier especie o cepa de clamidia. En este ejemplo, se realizó un análisis de curso temporal de células HeLa GFP infectadas con una de cuatro especies o cepas de clamidia para cada una de estas especies y cepas.

Las inclusiones fueron marcadas y analizadas para calcular su área promedio, longitud del perímetro y número por célula en los tiempos indicados. Estos atributos proporcionan información importante sobre la biología de las inclusiones clamidiales, incluyendo cómo interactúan con la célula huésped. Aquí se muestra un video de células HeLa mCherry infectadas con GFPC, Tracom L2, compuesto por imágenes de lapso de tiempo tomadas a intervalos de cinco minutos durante 125 minutos, comenzando a las 48 horas posteriores a la infección.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar esta técnica de imagen inversa no solo para visualizar inclusiones de Chlamydia, sino también para cuantificar la dinámica de las inclusiones, como el área de la inclusión, el perímetro y el número de inclusiones por célula. Esta técnica es rentable en comparación con técnicas de visualización más tradicionales y funciona con todas las especies y cepas de Chlamydia.