Name: Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados en las buenas prácticas agrarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende a construir factores de transcripción artificiales inducibles en levadura mediante transformación con acetato de litio y citometría de flujo. Este método permite la expresión condicional de genes con especificidad deseada.

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RSM reconoce el financiamiento de la NSF Graduate Research Fellowship. MBN reconoce la financiación de un Lewis-Sigler Fellowship y el don dotado de Peter Lewis. DB reconoce la financiación de los NIH (GM046406) del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales Centro de Biología Cuantitativa (GM071508). Reconocemos Christina DeCoste para obtener ayuda con los experimentos de citometría de flujo.

La Figura 2 proporciona un esquema de las secciones de protocolo 1-3. 1. Creación de ATF <ol><li> Crear cebadores para PCR amplificando dominio de unión a ADN de interés. La homología con el receptor de promotor ACT1 y la hormona (tal como se describe en las Figuras 3 y 4) se añade a través de PCR para facilitar la recombinación correcta en la cepa yMN15. </li><li> Amplificar por PCR DBD de interés utilizando una polimerasa de alta fidelidad. </li><li> Transformar&gt; 1 g de producto de PCR purificado en levadura usando el método de acetato de litio 13. </li><li> Después de la transformación, las células de la vuelta a la máxima velocidad durante 15 segundos en microcentrífuga y quite mezcla de transformación. </li><li> Resuspender en ~ 200 l de agua estéril y placa en YPD. </li><li> Al día siguiente, réplica de la placa de YPD en placas 5-FOA (placas 5-FOA se hacen como se describe en el Manual de levadura Cold Spring Harbor) 13. </li><li> Permitir el crecimiento de 2-4 days, y restreak al menos 5-10 colonias en YPD. Realizar una PCR de colonias usando los cebadores de la Tabla 1 y la secuencia para verificar la inclusión. </li></ol> 2. Creación de ATF plásmido reportero <ol><li> Determinar el sitio de unión de la ATF (más probable que provenga de la literatura). </li><li> Orden deseado región de unión como los oligos (o Ultramers, si es necesario). Ordene como superior e inferior con hebras salientes correctas para NotI y XbaI como se muestra en la Tabla 2. </li><li> Diluir oligos a concentraciones equimolares (100 micras). </li><li> Fosforilan utilizando T4 polinucleótido quinasa y luego recocido en un termociclador. Las condiciones de reacción son en la Tabla 3. </li><li> Resumen ~ 1-2 mg de pMN8 con NotI-HF y XbaI durante 1 hora a 37 ° C (condiciones de reacción en la Tabla 4). </li><li> Gel purifican la banda de la columna vertebral. </li><li> Diluir la columna vertebral purificada a 10 ng / l. </li><li> Diluir la doble cadena, fosforiloATED sitio de unión a 5 veces la concentración molar de la columna vertebral por l. </li><li> El uso de ADN ligasa de T4, ligar los sitios de unión en la cadena principal digerido a temperatura ambiente durante 30 min (Tabla 5). </li><li> Para la transformación, agregue la mitad de la reacción de ligación a 50 l de estándar, Escherichia coli químicamente competentes como XL1-Blue o DH5-alfa. </li><li> Células de choque térmico durante 45 segundos en un 42 ° C baño de agua y luego se coloca en hielo durante 2 min. </li><li> Añadir 900 l de medio SOC a una reacción de transformación. </li><li> Crece a 37 ° C durante 1 hora en un tambor de rodillo. </li><li> Corre 100-200 mu l de células por LB + AMP (100 mg / ml) para placas e incubar durante la noche. </li><li> Crece E. coli en LB + AMP ADN plásmido líquido y la cosecha. Secuencia verifique nuevo plásmido reportero de colonias de ligamiento utilizando el cebador 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Transformar nuevo plásmido indicador que contiene en ATF-levadura strAin de la Sección 1 usando transformación con acetato de litio. </li></ol> 3. Cuantificar el efecto de la ATF inducción en la expresión génica utilizando GFP reportero Preparación de las muestras: <ol><li> Hacer 25 mM de stock β-estradiol (10 ml de etanol + 0,0681 g de β-estradiol). Mantener refrigerado. </li><li> Grow ATF + Periodista que contienen la cepa durante la noche en 5 ml SC-URA. </li><li> Obtener nueve 250 ml frascos de agitación y añadir 25 ml SC-URA a cada uno. </li><li> Añadir 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 mM, o 10 mM β-estradiol. Esto se hace más fácilmente al hacer diluciones seriadas de 10 veces de la acción β-estradiol 25 mM. Para obtener una concentración final de 10 mM β-estradiol, añadir 10 l de la población de β-estradiol 25 mM a 25 ml de SC-ura. </li><li> Añadir 125 l de cultivos de una noche a matraces (1:200 dilución). </li><li> Durante los 2 frascos restantes, inocular con una producción de GFP constitutiva strain y una cepa que carece de buenas prácticas agrarias. Estos son necesarios para la calibración del citómetro de flujo. </li><li> Agitar a 200 rpm a 30 º C durante 12-18 horas. Nota: El tiempo óptimo de incubación se determina mediante la identificación de las buenas prácticas agrarias de inducción cuando ya no cambia tras la adición de β-estradiol. </li><li> Tomar 500 l de cada cultura y de girar en tubos de 1,7 ml de microcentrífuga separados. </li><li> Aspirar SC-URA. </li><li> Lavar una vez en 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 y aspirado. </li><li> Añadir 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 y resuspender. </li><li> Añadir 1 ml de PBS 0,1% de Tween-20 a tubos Falcon. </li><li> Añadir las células resuspendidas a tubos de 5 ml (volumen final = 2 ml) (se puede almacenar a 4 ° C durante varios días). </li><li> Opcional: células Sonicar ligeramente para cualquier ruptura de células agrupadas. La citometría de flujo análisis: Información general: La fluorescencia de 10.000-100.000 células se analiza normalmente por muestra. Los datos pueden ser procesados ​​ni en FlowJo o utilizar scripts personalizados en MATLAB oR. Asegúrese de calibrar el voltaje del canal GFP GFP utilizando controles positivos y negativos. Una vez que los archivos de FCS se exportan, un guión como el de la Figura 6, junto con los fca_readfcs función ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> ) se puede utilizar para procesar el datos. </li><li> Lleve a cabo la citometría de flujo. <ol><li> Uso dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para identificar las células de levadura. </li><li> Ajuste el caudal de ~ 3.000 células / seg. </li><li> Mida GFP (canal FITC). </li><li> Una vez que se recopilan los datos, archivos de exportación. FCS </li></ol></li><li> Cargue MATLAB. </li><li> Mueva los archivos. FCS, fcs_readfcs.m y un guión similar al de la Figura 6 en la misma carpeta. </li><li> Cambie el directorio de trabajo actual a la carpeta que contiene los datos y scripts. </li><li> Ejecute el script de la Figura 6 (nota: laleyenda ha sido introducida manualmente para producir lo que se ve en la figura 7). </li></ol> 4. Cuantificar el efecto de la ATF inducción sobre el crecimiento celular <ol><li> Desde existencias congeladas, veta a cabo tanto (1) una cepa que contiene ATF-y (2) una cepa ATF-faltando (tal como yMN15) en placas de YPD separadas. </li><li> Después de 2 días de crecimiento, inocular tubos de cultivo separados que contienen 5 ml de líquido YPD con cada cepa y crecer durante la noche a 30 ° C. </li><li> Lleve a cabo 10 veces diluciones seriadas de un mM β-estradiol solución 0,25 abastecerse de 10.000 veces (0.025 M β-estradiol) en etanol al 100%. </li><li> Añadir 40 l de cultivos durante la noche a 10 ml de líquido YPD (1-250 dilución). </li><li> Para cada cepa, añadir 96 l de células diluidas a 18 pocillos de una placa de 96 pocillos. </li><li> Añadir 4 l de β-estradiol a las células. Un punto esencial es asegurarse de que cada pozo tiene la misma cantidad de etanol total. (Como alternativa, un mo<html> re madre concentrada de β-estradiol se puede utilizar y se diluyó posteriormente hasta el punto el efecto del etanol sobre el crecimiento no es medible). </li><li> Lleve a cabo por triplicado. Tres de los pozos para cada cepa debe ser de sólo etanol controles. </li><li> Cubrir la placa de 96 pocillos de gas permeable. </li><li> Controle atentamente el crecimiento (OD 600) en un lector de placas. </li><li> Cuantificar las tasas de crecimiento utilizando cualquier número de métodos estándar tales como encontrar la pendiente máxima. Nota: Hemos tenido buen éxito con el código abierto del paquete de software Grofit 14, que se ejecuta en el entorno de programación R Vale la pena mencionar que, si bien las tasas de crecimiento calculadas a partir de los ensayos de placa de 96 pocillos en comparación con matraces de agitación (25 ml culturas). no son necesariamente los mismos (debido tanto a las diferencias en la fisiología y en la instrumentación), que hemos observado que las tasas relativas de crecimiento son similares (aunque esto puede no ser siempre el caso). </li></ol>tle &quot;&gt; 5. Crear inducibles Genomic alelos <ol><li> Obtener pMN10, un plásmido noncentromeric con el promotor-ATF sensible de pMN8 fusionado a KanMX (en la orientación opuesta). </li><li> Digestión de restricción de la cadena principal del vector y el extracto de gel como en la Sección 2. </li><li> Recocido, fosforilar y oligos ligar contienen sitios de unión apropiadas como se describe en la Sección 2. </li><li> Secuencia de verificar. Este plásmido ahora servirá como un molde de ADN para crear el alelo inducible. </li><li> Obtener la cepa de levadura que expresa la ATF correspondiente de intereses. </li><li> Amplificar por PCR el casete KanMX-Promotor (~ 2 kb) usando los cebadores de la Tabla 6. </li><li> Transformar el producto de la PCR en la cepa de ATF-expresar utilizando el método de acetato de litio. </li><li> Placa en YPD y réplica placa en YPD + G418 al día siguiente. </li><li> Confirmar la inserción apropiada del promotor utilizando el cebador directo (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) y un cebador inverso interno a the gen cuyo promotor ha sido sustituido. El cebador inverso está típicamente diseñado para ser de entre 200-300 pb aguas abajo de la primera ATG de 15. El producto final de la PCR es de ~ 1,2 kb. </li></ol>

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</ol>

McIsaac, Noyes y Botstein (con otros) han presentado parte de este sistema en su Descripción de la Patente.

Los conmutadores a base de hormonas descritos aquí tienen numerosas aplicaciones, desde el estudio de la biología celular nativa de ensayo de la capacidad de un dominio de unión de ADN de interés para apuntar a una secuencia de ADN in vivo. El sistema tiene muchas características deseables, incluyendo una respuesta gradual a inductor, de acción rápida, y una regulación estricta (es decir. No leakiness medible, ver Figura 7). Sin embargo, todavía hay margen de mejora y expansión. Trabajos recientes en la biología sintética ha hecho hincapié en los sistemas de síntesis de multiplexación y ampliar el repertorio de bien caracterizados, piezas de ADN programables 16. Expresión independiente, condicional de genes diana distintas requiere tanto múltiples inductores y los dominios de unión al ADN que carecen de especificidad de la superposición. La disponibilidad de los receptores diseñados y de origen natural ofrece un gran conjunto de piezas con las que el desarrollo de nuevos factores de transcripción artificial. La ampliación de larepertorio de interruptores mutuamente ortogonales ha sido ayudado en gran medida por la evolución dirigida enfoques 17,18. Los esfuerzos actuales para reprogramar la especificidad de unión al ligando de nuestros factores de transcripción artificiales se presentarán en el futuro. Anteriormente, las consecuencias fenotípicas de deleción del gen / sobreexpresión han sido ampliamente estudiados en la levadura 19,20. Sin embargo, no ha sido sencillo para estudiar el efecto de la expresión en diferentes fenotipos en un rango de niveles de expresión. Una característica principal del sistema presentado en este documento es su naturaleza gradual (Figura 8). Aunque a menudo asumido, la relación entre la expresión génica y fenotipos de interés puede no ser necesariamente monotónica. Factores de transcripción artificiales como Z3 y Z4 EV EV harán la tarea de ensayar las respuestas fenotípicas a los cambios en la expresión génica directa. Por último, los protocolos de discutired en este manuscrito son para la ingeniería y la caracterización de los factores de transcripción artificiales que den respuesta a β-estradiol, sin embargo, una importante alternativa a los dominios químicamente sensibles es el uso de dominios de luz que responden (como el PhyB/Pif3, LOV, y BLUF), cuyas actividades son reversibles sin necesidad de perturbar el medio de cultivo de crecimiento 21-23. Sistemas basados ​​en la luz facilitar el control espacio-temporal de la expresión génica, las interacciones proteína-proteína, el transporte de iones, y la actividad enzimática, que ya han demostrado ser de gran alcance 21-26. En conclusión, hemos presentado los métodos para la rápida construcción de factores de transcripción inducibles, artificiales en levadura. Este protocolo proporciona una plantilla para su construcción en conjunto con GFP reporteros afines, así como los métodos para el análisis de los datos reportero usando citometría de flujo y analizando el efecto de la activación de ATF en el crecimiento.

El desarrollo de interruptores genéticos en levaduras es de gran interés en la investigación tanto a nivel académico e industrial. En el caso ideal, interruptores genéticos pueden ser utilizados para activar un gen particular (o conjunto de genes) sólo cuando se desee por el experimentador. Secuencia de codificación de un gen situado aguas abajo de un promotor sintético no se expresa en la ausencia de una molécula de la inducción de: después de la adición del inductor del gen debe expresarse rápidamente. Se ha demostrado recientemente que un interruptor de este tipo puede ser diseñado en la levadura, donde en ausencia de inductor, la cepa muestra un fenotipo de supresión, pero en presencia de inductor, la expresión se activa en proporción al nivel de inductor en todas las células 1,2. Históricamente, los sistemas de expresión condicional en la levadura se han basado en gran medida en las secuencias de ADN que responden a nutrientes, incluyendo la MET, FO, y promotores GAL (cuyas actividades son sensibles a los niveles extracelulares de metionina, fosfato, ygalactosa, respectivamente). Mientras que la expresión condicional se puede lograr, se trata en el coste de los efectos pleiotrópicos significativos. Los receptores de hormonas tales como los receptores de estrógenos humanos han demostrado ser eficaces interruptores en eucariotas 3,4. En ausencia de hormona, una proteína fusionada a un receptor de la hormona puede ser secuestrado en el citoplasma donde interactúa con el complejo chaperona Hsp90. Tras la unión del ligando apropiado, el receptor experimenta un cambio conformacional, haciendo que se libera del complejo chaperona Hsp90 y revelando una señal de localización nuclear. Para observar la dinámica de localización de una proteína que contiene al receptor de hormona en particular, hemos creado una fusión C-terminal de Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, un factor de transcripción sintética que contiene el dominio de unión de ADN Gal4p, el dominio de unión a ligando del receptor de estrógeno humano , y VP16) con GFP 2. Localización nuclear se observó dentro de 8 min después de la adición decantidades saturantes del inductor, ß-estradiol, a la que levadura de tipo salvaje es completamente inerte. En ese momento, la mayoría de las células tienen sitios de transcripción activos claramente visibles para los genes diana GEV (ensayadas mediante hibridación in situ fluorescente), así como los ARNm completamente maduros 2,5. Genes diana GEV aumentaron en la expresión de&gt; 2 veces en 2,5 min 2,6 (medido utilizando microarrays), lo que demuestra que se tarda &lt;2,5 min para el activador quimérico para trasladar al núcleo, unirse al ADN, y activar la transcripción. Mientras que varios otros mecanismos de activación que se han aplicado en la levadura que utilizan diversas pequeñas moléculas o fármacos (incluidos los conmutadores basados ​​en doxiciclina clásicos de Escherichia coli 7,8 y un interruptor basado en el añil 9 de Arabidopsis thaliana), ninguno ha alcanzado la velocidad, especificidad, o rigidez de la regulación que presentan los switches basados ​​en hormonas. Vale la pena mencionar tsombrero rápida fuera de los interruptores también se han desarrollado en la levadura, y típicamente trabajar por la fusión de un gen para una proteasa o ubiquitina ligasa secuencia dirigida 2,10,11,12. La capacidad de eliminar rápidamente una proteína diana de la célula facilita el estudio de los genes esenciales, así como los genes que son propensos a la supresión genética cuando se suprime 10. Los métodos descritos en este protocolo son para la construcción y caracterización sintética en los interruptores en la levadura. En primer lugar, se muestra cómo generar rápidamente las proteínas de fusión genómicamente integradas-que consisten en un dominio de unión al ADN de interés, el ligando vinculante de dominio del receptor de estrógeno humano y VP16 (DBD-EV). Después de nuestro protocolo, la proteína de fusión se expresa a partir de un promotor ACT1. Luego mostramos cómo crear un plásmido indicador análogo para la ATF y probar su funcionalidad mediante citometría de flujo. Aunque prevemos estos plásmidos indicadores que se utilizan con nuevos CATs (Figura 1), que pueden be utilizado como reporteros de un activador transcripcional nativa así. Finalmente, se proporcionan detalles para probar el efecto de la activación de ATF sobre el crecimiento celular en placas de 96 pocillos y para la ingeniería de alelos genómicas inducibles.

<table><tbody><tr><td>Nombre de la empresa de reactivos Número de</td><td></td><td>catálogo</td><td>Observaciones&nbsp;</td></tr><tr><td>Ampliar Sistema de PCR de alta fidelidad</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Competente E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleótido quinasa</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorios de descontaminación</td><td>de etanol 100%</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de litio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Plásmidos pMN8 y pMN10; cepa de levadura yMN15</td><td>Noyes o Botstein labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPO:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Címetro de flujo LSRII &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Varios modelos</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB o FlowJo</td><td>MATLAB o FlowJo</td><td></td><td>Software para el análisis . Archivos FCS de experimentos de citometría de flujo</td></tr><tr><td>R</td><td>Open Source</td><td></td><td>Para analizar datos de tasa de crecimiento del lector de placas.</td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Eppendorf&nbsp; Tubos</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Matraces de agitación</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano de 96 pocillos Lector de</td> placas <td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>(Lector de placas multimodo Synergy H1)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Membranas Breathe-Easy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>varias empresas</td><td>Varios modelos</td><td></td></tr><tr><td>SC-Ura polvo</td><td>MP Biomedicals 114410622</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis rápida y detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

La biología sintética tiene como objetivo diseñar racionalmente y construir circuitos sintéticos con propiedades cuantitativas deseadas, así como proporcionar herramientas para interrogar la estructura de circuitos de control nativas. En ambos casos, la capacidad de programar la expresión génica de una manera rápida y sintonizable, sin efectos fuera de objetivo, puede ser útil. Hemos construido cepas de levadura que contienen el ACT1 promotor aguas arriba de un casete URA3 seguido por el dominio de unión a ligando del receptor de estrógeno humano y VP16. Mediante la transformación de esta cepa con un producto de la PCR lineal que contiene un dominio de unión de ADN y la selección en contra de la presencia de URA3, un factor de transcripción artificial expresado constitutivamente (ATF) puede ser generado por recombinación homóloga. ATF diseñados de esta manera se puede activar un gen diana única en presencia de inductor, eliminando así tanto la activación fuera del objetivo y las condiciones de crecimiento no fisiológicas encontradas con conditi comúnmente utilizadoonal sistemas de expresión de genes. También se proporciona un método simple para la rápida construcción de plásmidos indicadores de GFP que responden específicamente a un factor de transcripción nativo o artificial de interés.

<html> La Figura 5 muestra la inducción de la GFP por Z 3 EV, Z 4 EV, o GEV con el tiempo. Tenga en cuenta el aumento de la producción de GFP en respuesta a los ATF que contienen dominios de unión a ADN nonyeast. Recientemente hemos especulado que esto resulta de estos factores que han alcanzado la especificidad de un solo gen en el genoma de la levadura 1. Inducción GEV solo conduce a la activación / represión de cientos de genes, mientras que Z y Z 3 EV 4 EV sólo activar la expresión de un gen diana colocado aguas abajo de un promotor sintético que contiene sitios de unión apropiados (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;y 5&#39;- GCGGCGGAGGAG, 3 &#39;, respectivamente) 1. Figura 7 demuestra la estrecha regulación del sistema (no hay resultados inductor en ninguna de GFP detectable) y se que todas las células se inducen en respuesta a inductor La capacidad de Z 3 EV para inducir GFP a través de una gama de concentraciones de β-estradiol se muestran en la Figura 8. <html> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Figura 1. Factores de transcripción artificiales interactúan con Hsp90 en ausencia de β-estradiol. Cuando β-estradiol se une a la ATF, la Hsp90 se disocia, permitiendo que el ATF para entrar en el núcleo y activar la expresión del reportero plásmido. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema del protocolo para las cepas de ingeniería que contienen factores de transcripción artificiales y construcción / prueba GFP reporteros afines. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La secuencia ACT1pr-URA3-EV en la cepa yMN15 en el locus LEU2. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> Figura 4. Diseño de cebadores de PCR para la amplificación de un dominio de unión de ADN de interés con una homología de secuencia adicional para generar una nueva proteína de fusión cuando transformado con éxito en yMN15. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> Figura 5. Inducción GFP por tres diferentes pares de ATF-promotor en respuesta a 1 mM β-estradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Figura 6. Una secuencia de comandos de MATLAB para el flujo de procesamiento de datos de citometría. Este guión fue adaptado de <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Figura 7. Inducción de GFP por Z 3 EV en respuesta a 0 μ M β-estradiol y 1 mM β-estradiol siguientes 18 h de inducción. Fluorescencia era también MEASured de células que carecen de buenas prácticas agrarias para ilustrar la regulación estricta del sistema EV Z 3. Esta cifra se ha generado utilizando el código de la figura 6. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figura 8. La relación entre la concentración de inductor y de salida expresión se clasifica con un coeficiente de Hill de ~ 1. (A) Distribución de la expresión de GFP como una función de la concentración de β-estradiol. (B) La fluorescencia media de las distribuciones de (A). Los datos se ajustaron a la función G (D) = G + min (G max-G min) D n / (n + D K n), donde D es la dosis-β estradiol, G y G min max son los valores mínimo y máximos valores de las buenas prácticas agrarias, respectivamente, n es el coeficiente de Hill, y K es la dosis-β estradiol que produce ½ (G máx + G min). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Secuencia de oligonucleótidos </td><td> Nombre </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Compruebe Forward </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD descubre la inversa </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Los cebadores para confirmar la correcta fusión de DBD de interés para el receptor de estrógeno. El cebador directo es homóloga del promotor ACT1 y el cebador inverso es homóloga al receptor de estrógeno. Para DBDs típicos (~ 300 pb), el producto de la PCR es &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Secuencia de oligonucleótidos </td><td> Nombre </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD sitio atracones ... t-3 &#39; </td><td> Top oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... ADN sitio de unión revertir ... gc-3 &#39; </td><td> Oligo Bottom </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG T GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top oligo + 6x Zif268 Sitios de Unión </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Oligo Bottom + 6x Zif268 Sitios de Unión </td></tr></tbody></table> Tabla 2. S tructura de cebadores para la creación de ADN de doble cadena que contiene los sitios de unión de intereses. Para crear el Z3 promotor-EV sensible, + 6x Zif268 se utilizaron los oligonucleótidos Binding Top oligo + 6x Zif268 sitios de unión y oligo Bottom.Secuencias para la creación de los voladizos de ADN correctas son en minúsculas. El sitio de unión consenso Zif268, GCGTGGGCG, se subraya en el oligo superior. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> T4 polinucleótido quinasa de búfer </td><td> 5 l </td></tr><tr><td> T4 polinucleótido quinasa (@ 10 000 unidades / ml) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Top oligo (100 M) </td><td> 1.5 l </td></tr><tr><td> Oligo Bottom (100 M) </td><td> 1.5 l </td></tr><tr><td> Agua </td><td> 41 l </td></tr></tbody></table> Tabla 3. Fosforilar y cebadores de recocido en un termociclador con 50 l de reacción descrita anteriormente. Hay dos pasos del termociclador. Paso 1: 37 º C 30 min (fosforilar), y el paso 2: 95 º C 30 seg (dimitir 1 ° C cada 30 segundos hasta que a 4 ° C; Recocido). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> XbaI </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> NotI-HF </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> El ADN del plásmido </td><td> 5 l (2.1 microgramos) </td></tr><tr><td> 10x Cut inteligente Buffer </td><td> 5 l </td></tr><tr><td> Agua </td><td> 38 l </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Digestión de restricción del plásmido pMN8 con XbaI y NotI. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reactivo </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Cantidad </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Ligasa T4 Buffer </td><td> 2 l </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Ligasa T4 </td><td> 0.2 l </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / l </td><td> 1 l </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Secuencias de unión @ 5x concentración molar / l </td><td> 1 l </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Agua </td><td> 15,8 l </td></tr></tbody></table> Tabla 5. Ligar sitios de unión en el ADN plásmido. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Cartilla </td><td> Descripción </td></tr><tr><td> ~ 40 pb aguas arriba del ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Cebador directo para amplificar KanMX-Promotor </td></tr><tr><td> 5&#39;-inverso del complemento (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Pri inversamer para amplificar KanMX-Promotor </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Cebador directo para hacer intercambio promotor GCN4. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Cebador inverso para hacer intercambio promotor GCN4. </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Amplificar por PCR KanMX-Promotora para hacer alelo titratible.

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la construcción rápida de factores de transcripción artificiales (ATFS) con GFP reporteros afines y cuantificación de la capacidad de los ATF para estimular la expresión de GFP mediante citometría de flujo.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

El objetivo general de este procedimiento es crear, probar y validar factores de transcripción artificiales inducibles codificados genéticamente, o ATF, con especificidad deseada. Esto se logra primero creando el ATF mediante una transformación sencilla de levadura en la que la inclusión de un producto de PCR de un dominio de unión al ADN da como resultado una fusión en el mismo marco de lectura con un receptor de estrógeno humano y VP16. El segundo paso del procedimiento consiste en crear un plásmido reportero GFP para el ATF reemplazando los sitios de unión en el plásmido PMN ocho con secuencias diana del factor de transcripción.El tercer paso del procedimiento consiste en ensayar la capacidad de los ATF para activar el reportero GFP y evaluar también su efecto sobre la fisiología de la levadura mediante la medición de la tasa de crecimiento. El paso final del procedimiento es utilizar un TF validado para expresar condicionalmente un objetivo genómico nativo. En última instancia, cualquier gen diana de interés puede hacerse condicionalmente activo.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inducción mediada por galactosa de la expresión génica es que se puede lograr una inducción selectiva en diversas condiciones nutricionales y fisiológicas sin efectos pleiotrópicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de la levadura mediante la introducción rápida y reversible de productos génicos deseados, permitiendo el estudio tanto de la ganancia como de la pérdida de función. Para comenzar, amplifique por PCR el dominio de unión al ADN o DVD de interés utilizando una polimerasa de alta fidelidad.Transforme más de un microgramo del producto de PCR purificado en levadura utilizando el método de acetato de litio. Después de la transformación, centrifugue las células a velocidad máxima durante 15 segundos en una microcentrífuga, elimine la mezcla de transformación y resuspenda las células en aproximadamente 200 microlitros de agua estéril antes de sembrarlas en extracto de levadura. Al día siguiente, realice una placa de replica desde YPD hasta cinco placas de ácido fluororacético en medio peptona-dextrosa o YPD.Después de crecer durante dos a cuatro días, repicar al menos cinco a 10 colonias en YPD. Luego, realizar una PCR de colonia utilizando los cebadores descritos en el protocolo del texto y secuenciar para verificar la inclusión. Diluir los oligonucleótidos de la región de unión deseada a concentraciones equimolares.Fosforile la región de unión utilizando la cinasa de polinucleótidos T cuatro y, a continuación, un termociclador neo según las condiciones de reacción descritas en el protocolo del texto. A continuación, digiera aproximadamente uno a dos microgramos de PMN ocho con not uno HF y xb. Uno durante una hora a 37 grados Celsius en gel.Purifique la banda del armazón y diluya el armazón purificado a 10 nanogramos por microlitro. Luego, diluya el sitio de unión fosforilado de doble cadena a cinco veces la concentración molar del armazón por microlitro. Utilizando la ligasa de ADN T4, ligue los sitios de unión al armazón digerido a temperatura ambiente durante 30 minutos.Realice la transformación añadiendo la mitad de la reacción de ligación a 50 microlitros de células de EIA coli químicamente competentes estándar, y siga el procedimiento indicado en el protocolo escrito. Después de recuperar las células, añada de 100 a 200 microlitros de células por placa de luria berti o lb más ampicilina, e incube durante la noche. Al día siguiente, cultive el e coli en medio líquido lb más ampicilina y purifique el ADN plasmídico según se describe en el protocolo escrito.Luego, secuencie y verifique el nuevo plásmido reportero a partir de colonias de ligación. Finalmente, transforme el nuevo plásmido reportero en la cepa E que contiene el A TF utilizando la transformación con acetato de litio. Para comenzar, cultive una cepa que contenga el TF más el reportero durante la noche en cinco mililitros de medio sintético completo sin uracilo.Obtenga 9 frascos de 250 mililitros y agregue 25 mililitros de SC sin URA a cada uno. Luego prepare siete de los frascos con diferentes diluciones de beta-estradiol según se indica en el protocolo del texto, a partir de diluciones seriadas diez veces de un stock de beta-estradiol de 25 milimolar, añadiendo 125 microlitros de cultivos nocturnos a estos siete frascos. Para los dos frascos restantes, inocule con una cepa productora constitutiva de GFP y con una cepa que carece de GFP. Estos son necesarios para calibrar el citómetro de flujo.Agite el matraz a 200 RPM y 30 grados Celsius durante 12 a 18 horas. Luego, retire 500 microlitros de cada cultivo y centrifugue en tubos eppendorf separados de 1,7 mililitros. Después de aspirar el sobrenadante, enjuague las células sedimentadas una vez con tampón para citometría de flujo, y luego resuspenda las células en un mililitro del mismo tampón.A continuación, agregue un mililitro de tampón para citometría de flujo a nueve tubos cónicos de dos mililitros. Añada las células re-suspendidas al tampón que contiene los tubos cónicos para obtener un volumen final igual a dos mililitros. Por último, realice la citometría de flujo.Utilice la dispersión directa y la dispersión lateral para identificar las células de levadura. Establezca la velocidad de flujo en aproximadamente 3000 células por segundo. Mida la GFP a través del canal 50 y continúe según el protocolo descrito en el texto: a partir de stocks congelados, realice siembra por estría tanto una cepa que contenga como una cepa que carezca del factor de transcripción A en YPD. Después de dos días de crecimiento, inocule tubos de cultivo separados que contengan cinco mililitros de medio líquido YPD y cultive cada cepa durante la noche a 30 grados Celsius.Realice diluciones seriadas de diez veces de una solución stock de beta-estradiol 0,25 milimolar hasta 10 000 veces en etanol al 100 %. Añada 40 microlitros de cada cultivo nocturno a 10 mililitros de caldo YPD. Para cada cepa, añada 96 microlitros de las células diluidas a 18 pocillos de una placa de 96 pocillos.Luego agregue cuatro microlitros de beta-estradiol a las células. Un punto esencial es asegurarse de que cada pocillo tenga la misma cantidad total de etanol. Realice un ensayo por triplicado utilizando tres pocillos para cada cepa, conteniendo solo etanol.Los controles cubren la placa de 96 pocillos con una membrana permeable al gas. Supervise el crecimiento a una densidad óptica de 600 nanómetros en un lector de placas. Cuantifique las tasas de crecimiento utilizando cualquiera de varios métodos, como hallar la pendiente máxima.Después de preparar el plásmido según se indica en el protocolo de texto de PCR, amplifique el casete del promotor can MX. Transforme el producto de PCR en una cepa que exprese A TF utilizando el método de acetato de litio, plaque las células transformadas en YPD y realice un replica-plaqueo en YPD más antibiótico G cuatro 18 al día siguiente. Finalmente, confirme la inserción adecuada del promotor utilizando un cebador directo y un cebador inverso interno al gen cuyo promotor ha sido reemplazado.El producto final de la PCR tiene aproximadamente 1,2 KB; aquí se muestra la inducción de GFP mediante tres pares diferentes de promotores de TF: Z cuatro EVZ, tres EV o GEV, a lo largo del tiempo en respuesta a un micromolar de beta-estradiol. Obsérvese el aumento en la producción de GFP en respuesta a los ATF que contienen dominios de unión al ADN no derivados de levadura. Esto podría deberse a que estos factores logran una especificidad para un solo gen en el genoma de levadura.La inducción mediante GEV conduce por sí sola a la activación o represión de cientos de genes, mientras que Z tres EV y Z cuatro EV solo activan la expresión de un gen diana colocado aguas abajo de un promotor sintético que contiene sitios de unión apropiados. Aquí se muestra la inducción de GFP por Z tres EV en respuesta a cero nanomoles por litro de betaestradiol y un micromol por litro de betaestradiol tras 18 horas de inducción. También se midió la fluorescencia en células que carecían de GFP para ilustrar la regulación estricta del sistema Z tres EV. Se muestra aquí la capacidad de Z tres EV para inducir la expresión de GFP en un rango de concentraciones de betaestradiol.La fluorescencia media de las distribuciones revela que la relación entre la concentración del inductor y la producción de expresión es gradual, con un coeficiente de Hill de aproximadamente uno, lo que indica unión independiente de Z tres EV. Tras seguir este procedimiento, se podrían realizar otros métodos como microarreglos de expresión génica para responder preguntas adicionales, como cómo el cambio en la expresión de un solo gen afecta los patrones genómicos de expresión génica. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo diseñar, probar y validar la eficacia de factores de transcripción artificiales. Estos factores de transcripción artificiales controlan condicionalmente la expresión de genes colocados aguas abajo de secuencias diana de ADN apropiadas.

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Investigación

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Biología

Se presenta un método de diagnóstico rápido y de bajo costo para la identificación de los reguladores transcripcionales utilizando alto rendimiento transfecciones robóticos y un ensayo de luciferasa dual brillo casero. Este protocolo genera rápidamente datos funcionales directos de lado a lado para miles de genes y es fácilmente modificable para apuntar cualquier gen de interés.

Selección de alto rendimiento funcional utilizando un doble resplandor de ensayo de luciferasa Homemade

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Aquí describimos un ensayo de genes reporteros basado en células como una herramienta valiosa para examinar bibliotecas químicas en busca de compuestos que modulan los mecanismos de control postranscripcional ejercidos a través de 3' UTR.

Selección de alto rendimiento para moduladores químicos de genes post-transcripcionalmente regulados

Con el murino transportador ABC BCRP1 (Abcg2) como un ejemplo, en-silico protocolos se presentan para detectar el uso de promotor alternativo en los genes expresados ​​en tejidos de ratón, y para evaluar la funcionalidad de los promotores alternativos identificados mediante los ensayos de reportero.

Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Aquí, presentamos una levadura mejorada Detección protocolo para identificar los factores de transcripción (TFs) que se pueden unir a una región de ADN humana de interés de uno híbrido. Este método utiliza una tubería de proyección de alto rendimiento que puede interrogar el atascamiento de &gt; 1.000 TFs en un solo experimento.

Pantallas de un híbrido levadura mejorada para identificar el Factor de transcripción atar a las secuencias de ADN humano

Para identificar nuevos reguladores de los factores de transcripción, desarrollamos un enfoque para las bibliotecas de ARN lentivirales o retrovirales arrayed utilizando un ensayo de reportero transcripcional basado en doble luciferasa. Este enfoque ofrece una forma rápida y relativamente económica de examinar a cientos de candidatos en un solo experimento.

Identificación de reguladores de factores de transcripción mediante la proyección de rendimiento medio de bibliotecas de matriz y un reportero basado en la doble luciferasa

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Generación de humanos CD40 activado por células B

Aprende a construir factores de transcripción artificiales inducibles en levadura mediante transformación con acetato de litio y citometría de flujo. Este método permite la expresión condicional de genes con especificidad deseada.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias (Video) | JoVE Journal

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

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