Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

El objetivo general de este procedimiento es crear, probar y validar factores de transcripción artificiales inducibles codificados genéticamente, o ATF, con especificidad deseada. Esto se logra primero creando el ATF mediante una transformación sencilla de levadura en la que la inclusión de un producto de PCR de un dominio de unión al ADN da como resultado una fusión en el mismo marco de lectura con un receptor de estrógeno humano y VP16. El segundo paso del procedimiento consiste en crear un plásmido reportero GFP para el ATF reemplazando los sitios de unión en el plásmido PMN ocho con secuencias diana del factor de transcripción.

El tercer paso del procedimiento consiste en ensayar la capacidad de los ATF para activar el reportero GFP y evaluar también su efecto sobre la fisiología de la levadura mediante la medición de la tasa de crecimiento. El paso final del procedimiento es utilizar un TF validado para expresar condicionalmente un objetivo genómico nativo. En última instancia, cualquier gen diana de interés puede hacerse condicionalmente activo.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la inducción mediada por galactosa de la expresión génica es que se puede lograr una inducción selectiva en diversas condiciones nutricionales y fisiológicas sin efectos pleiotrópicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de la levadura mediante la introducción rápida y reversible de productos génicos deseados, permitiendo el estudio tanto de la ganancia como de la pérdida de función. Para comenzar, amplifique por PCR el dominio de unión al ADN o DVD de interés utilizando una polimerasa de alta fidelidad.

Transforme más de un microgramo del producto de PCR purificado en levadura utilizando el método de acetato de litio. Después de la transformación, centrifugue las células a velocidad máxima durante 15 segundos en una microcentrífuga, elimine la mezcla de transformación y resuspenda las células en aproximadamente 200 microlitros de agua estéril antes de sembrarlas en extracto de levadura. Al día siguiente, realice una placa de replica desde YPD hasta cinco placas de ácido fluororacético en medio peptona-dextrosa o YPD.

Después de crecer durante dos a cuatro días, repicar al menos cinco a 10 colonias en YPD. Luego, realizar una PCR de colonia utilizando los cebadores descritos en el protocolo del texto y secuenciar para verificar la inclusión. Diluir los oligonucleótidos de la región de unión deseada a concentraciones equimolares.

Fosforile la región de unión utilizando la cinasa de polinucleótidos T cuatro y, a continuación, un termociclador neo según las condiciones de reacción descritas en el protocolo del texto. A continuación, digiera aproximadamente uno a dos microgramos de PMN ocho con not uno HF y xb. Uno durante una hora a 37 grados Celsius en gel.

Purifique la banda del armazón y diluya el armazón purificado a 10 nanogramos por microlitro. Luego, diluya el sitio de unión fosforilado de doble cadena a cinco veces la concentración molar del armazón por microlitro. Utilizando la ligasa de ADN T4, ligue los sitios de unión al armazón digerido a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Realice la transformación añadiendo la mitad de la reacción de ligación a 50 microlitros de células de EIA coli químicamente competentes estándar, y siga el procedimiento indicado en el protocolo escrito. Después de recuperar las células, añada de 100 a 200 microlitros de células por placa de luria berti o lb más ampicilina, e incube durante la noche. Al día siguiente, cultive el e coli en medio líquido lb más ampicilina y purifique el ADN plasmídico según se describe en el protocolo escrito.

Luego, secuencie y verifique el nuevo plásmido reportero a partir de colonias de ligación. Finalmente, transforme el nuevo plásmido reportero en la cepa E que contiene el A TF utilizando la transformación con acetato de litio. Para comenzar, cultive una cepa que contenga el TF más el reportero durante la noche en cinco mililitros de medio sintético completo sin uracilo.

Obtenga 9 frascos de 250 mililitros y agregue 25 mililitros de SC sin URA a cada uno. Luego prepare siete de los frascos con diferentes diluciones de beta-estradiol según se indica en el protocolo del texto, a partir de diluciones seriadas diez veces de un stock de beta-estradiol de 25 milimolar, añadiendo 125 microlitros de cultivos nocturnos a estos siete frascos. Para los dos frascos restantes, inocule con una cepa productora constitutiva de GFP y con una cepa que carece de GFP. Estos son necesarios para calibrar el citómetro de flujo.

Agite el matraz a 200 RPM y 30 grados Celsius durante 12 a 18 horas. Luego, retire 500 microlitros de cada cultivo y centrifugue en tubos eppendorf separados de 1,7 mililitros. Después de aspirar el sobrenadante, enjuague las células sedimentadas una vez con tampón para citometría de flujo, y luego resuspenda las células en un mililitro del mismo tampón.

A continuación, agregue un mililitro de tampón para citometría de flujo a nueve tubos cónicos de dos mililitros. Añada las células re-suspendidas al tampón que contiene los tubos cónicos para obtener un volumen final igual a dos mililitros. Por último, realice la citometría de flujo.

Utilice la dispersión directa y la dispersión lateral para identificar las células de levadura. Establezca la velocidad de flujo en aproximadamente 3000 células por segundo. Mida la GFP a través del canal 50 y continúe según el protocolo descrito en el texto: a partir de stocks congelados, realice siembra por estría tanto una cepa que contenga como una cepa que carezca del factor de transcripción A en YPD. Después de dos días de crecimiento, inocule tubos de cultivo separados que contengan cinco mililitros de medio líquido YPD y cultive cada cepa durante la noche a 30 grados Celsius.

Realice diluciones seriadas de diez veces de una solución stock de beta-estradiol 0,25 milimolar hasta 10 000 veces en etanol al 100 %. Añada 40 microlitros de cada cultivo nocturno a 10 mililitros de caldo YPD. Para cada cepa, añada 96 microlitros de las células diluidas a 18 pocillos de una placa de 96 pocillos.

Luego agregue cuatro microlitros de beta-estradiol a las células. Un punto esencial es asegurarse de que cada pocillo tenga la misma cantidad total de etanol. Realice un ensayo por triplicado utilizando tres pocillos para cada cepa, conteniendo solo etanol.

Los controles cubren la placa de 96 pocillos con una membrana permeable al gas. Supervise el crecimiento a una densidad óptica de 600 nanómetros en un lector de placas. Cuantifique las tasas de crecimiento utilizando cualquiera de varios métodos, como hallar la pendiente máxima.

Después de preparar el plásmido según se indica en el protocolo de texto de PCR, amplifique el casete del promotor can MX. Transforme el producto de PCR en una cepa que exprese A TF utilizando el método de acetato de litio, plaque las células transformadas en YPD y realice un replica-plaqueo en YPD más antibiótico G cuatro 18 al día siguiente. Finalmente, confirme la inserción adecuada del promotor utilizando un cebador directo y un cebador inverso interno al gen cuyo promotor ha sido reemplazado.

El producto final de la PCR tiene aproximadamente 1,2 KB; aquí se muestra la inducción de GFP mediante tres pares diferentes de promotores de TF: Z cuatro EVZ, tres EV o GEV, a lo largo del tiempo en respuesta a un micromolar de beta-estradiol. Obsérvese el aumento en la producción de GFP en respuesta a los ATF que contienen dominios de unión al ADN no derivados de levadura. Esto podría deberse a que estos factores logran una especificidad para un solo gen en el genoma de levadura.

La inducción mediante GEV conduce por sí sola a la activación o represión de cientos de genes, mientras que Z tres EV y Z cuatro EV solo activan la expresión de un gen diana colocado aguas abajo de un promotor sintético que contiene sitios de unión apropiados. Aquí se muestra la inducción de GFP por Z tres EV en respuesta a cero nanomoles por litro de betaestradiol y un micromol por litro de betaestradiol tras 18 horas de inducción. También se midió la fluorescencia en células que carecían de GFP para ilustrar la regulación estricta del sistema Z tres EV. Se muestra aquí la capacidad de Z tres EV para inducir la expresión de GFP en un rango de concentraciones de betaestradiol.

La fluorescencia media de las distribuciones revela que la relación entre la concentración del inductor y la producción de expresión es gradual, con un coeficiente de Hill de aproximadamente uno, lo que indica unión independiente de Z tres EV. Tras seguir este procedimiento, se podrían realizar otros métodos como microarreglos de expresión génica para responder preguntas adicionales, como cómo el cambio en la expresión de un solo gen afecta los patrones genómicos de expresión génica. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo diseñar, probar y validar la eficacia de factores de transcripción artificiales. Estos factores de transcripción artificiales controlan condicionalmente la expresión de genes colocados aguas abajo de secuencias diana de ADN apropiadas.