Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

El objetivo general de este procedimiento es crear, probar y validar factores de transcripción artificial inducibles genéticamente o ATF con la especificidad deseada. Esto se logra creando primero el TF A a través de una transformación de levadura simple en la que la inclusión del producto PCR del dominio de unión al ADN A da como resultado una fusión en el marco con un receptor de estrógeno humano y VP 16. El segundo paso del procedimiento es crear un plásmido reportero de GFP para el TF A reemplazando los sitios de unión en el plásmido PMN ocho con secuencias de destino de TF A.

El tercer paso del procedimiento es analizar la capacidad de los ATF para activar el indicador de GFP y también evaluar su efecto sobre la fisiología de la levadura mediante la medición de la tasa de crecimiento. El paso final del procedimiento es utilizar el TF validado para expresar condicionalmente un objetivo genómico nativo. En última instancia, cualquier gen diana de interés puede activarse condicionalmente.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la inducción de la expresión génica mediada por galactosa, es que la inducción selectiva se puede lograr en diversas condiciones fisiológicas y de nutrientes sin efectos pleotrópicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de la levadura a través de la introducción rápida y reversible de los productos genéticos deseados, lo que permite el estudio tanto de la ganancia como de la pérdida de función. Para empezar, la PCR amplifica el dominio de unión al ADN o DVD de interés utilizando una polimerasa de alta fidelidad.

Transforme más de un microgramo del producto PCR purificado en levadura utilizando el método de acetato de litio. Después de la transformación, haga girar las células a máxima velocidad durante 15 segundos en una microcentrífuga, retire la mezcla de transformación y vuelva a suspender las células en aproximadamente 200 microlitros de agua estéril antes de colocar el extracto de levadura. Pepto dextrosa o medio YPD al día siguiente réplica de la placa de YPD en cinco placas de ácido fluoroerótico.

Después de un crecimiento de dos a cuatro días, vuelva a colocar al menos de cinco a 10 colonias en YPD. A continuación, realice una PCR de colonias utilizando los cebadores del protocolo de texto y la secuencia para verificar la inclusión. Diluir los oligonucleótidos de la región de unión deseada a concentraciones equimolares.

Fosforilar la región de unión usando T cuatro polinucleótidos quinasa, y luego un neo termociclador de acuerdo con las condiciones de reacción en el protocolo de texto. A continuación, digiera aproximadamente uno o dos microgramos de PMN ocho sin un HF y xb. Uno durante una hora a 37 grados centígrados de gel.

Purifique la banda de la columna vertebral y diluya la columna vertebral purificada a 10 nanogramos por microlitro. A continuación, diluya el sitio de unión fosforilado de doble cadena a cinco veces la concentración molar de la columna vertebral por microlitro. Usando T cuatro ADN ligasa ligar los sitios de unión en la columna vertebral digerida a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Realice la transformación añadiendo la mitad de la reacción de ligadura a 50 microlitros de células EIA coli estándar químicamente competentes y siguiendo el procedimiento indicado en el protocolo de texto. Después de recuperar las células, agregue de 100 a 200 microlitros de células por luria berti o lb más placa de ampicilina, e incube durante la noche. Al día siguiente, cultive e coli y lb más ampicilina líquida y coseche el ADN plásmido como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, verifique la secuencia del nuevo plásmido reportero de las colonias de ligadura. Finalmente, transforme el nuevo plásmido reportero en la cepa A TF que contiene E mediante transformación de acetato de litio. Para comenzar, cultive un TF más reportero que contenga cepa durante la noche en cinco mililitros de medio sintético completo sin uracilo.

Obtener 9 250 mililitros, agitar el matraz y añadir 25 mililitros de SC menos URA a cada uno. A continuación, prepare siete de los matraces con diferentes diluciones de beta estradiol, como se indica en el protocolo de texto, desde la dilución en serie diez veces mayor de un stock de beta estradiol de 25 milimolares a 125 microlitros de los cultivos nocturnos hasta estos siete matraces para que los dos matraces restantes inoculen con una cepa constitutiva productora de GFP y una cepa que carece de GFP. Estos son necesarios para calibrar el citómetro de flujo.

Agite el matraz a 200 RPM y 30 grados centígrados durante 12 a 18 horas. A continuación, retire 500 microlitros de cada cultivo y gírelos en tubos separados de einor de 1,7 mililitros. Después de aspirar el sobrenadante, enjuague las células peletizadas una vez con tampón de citometría de flujo, luego vuelva a suspender las células en un mililitro del mismo tampón.

A continuación, agregue un mililitro de tampón de citometría de flujo a nueve halcones dos. Agregue las celdas resuspendidas al tampón que contiene tubos de halcón para obtener un volumen final igual a dos mililitros. Por último, realice la citometría de flujo.

Utilice la dispersión directa y la dispersión lateral para identificar las células de levadura. Establezca el caudal en aproximadamente 3000 celdas por segundo. Mida la GFP a través del canal 50 y proceda como en el protocolo de texto de las existencias congeladas, extienda tanto una cepa que contenga un TF A como un TF A que carezca de deformación en YPD Después de dos días de crecimiento, inocule tubos de cultivo separados que contengan cinco mililitros de líquido YPD y cultive cada cepa durante la noche a 30 grados centígrados.

Realizar diluciones en serie de diez veces de una solución madre de beta estradiol de 0,25 milimolares hasta 10.000, doblar en etanol al 100%. Agregue 40 microlitros de cada cultivo durante la noche a 10 mililitros de líquido YPD. Para cada cepa, agregue 96 microlitros de las células diluidas a 18 pocillos de una placa de 96 pocillos.

A continuación, añada cuatro microlitros de beta estradiol a las células. Un punto esencial es asegurarse de que cada pozo tenga la misma cantidad de etanol total. Realice un triplicado con tres de los pocillos para cada cepa que sean solo etanol.

Los controles cubren la placa de 96 pocillos con una membrana permeable al gas. Monitoree el crecimiento a una densidad óptica de 600 nanómetros en un lector de placas. Cuantifique las tasas de crecimiento utilizando cualquier número de métodos, como encontrar la pendiente máxima.

Después de preparar el plásmido como se indica en el protocolo de texto PCR, amplifique el casete del promotor can MX. Transforme el producto de PCR en una cepa que exprese A TF utilizando la placa de método de acetato de litio, transforme las células en YPD y la placa de réplica en YPD más el antibiótico G 4 18 al día siguiente. Por último, confirmar la inserción adecuada del promotor utilizando el cebador directo y un cebador inverso interno al gen cuyo promotor ha sido sustituido.

El producto final de la PCR es de aproximadamente 1,2 KB, aquí se muestra la inducción de GFP por tres pares de promotores de TF diferentes: Z, cuatro EVZ, tres EV o GEV a lo largo del tiempo en respuesta a un beta estradiol micromolar. Obsérvese el aumento de la producción de GFP en respuesta a los ATF que contienen dominios de unión al ADN que no son de levadura. Esto puede deberse a que estos factores logran la especificidad de un solo gen en el genoma de la levadura.

La inducción de GEV por sí sola conduce a la activación o represión de cientos de genes, mientras que Z tres EV y Z cuatro EV solo activan la expresión de un gen objetivo colocado aguas abajo de un promotor sintético que contiene sitios de unión apropiados. Aquí, se muestra la inducción de GFP por Z tres EV en respuesta a beta estradiol cero nanomolar, y un beta estradiol micromolar después de 18 horas de inducción. También se midió la fluorescencia de células que carecían de GFP para ilustrar la estricta regulación del sistema Z tres EV. Aquí se muestra la capacidad de Z three EV para inducir GFP en un rango de concentraciones de beta estradiol.

La fluorescencia media de las distribuciones revela que la relación entre la concentración del inductor y la salida de expresión se gradúa con un coeficiente de Hill de aproximadamente uno, lo que indica la unión independiente de Z tres EV Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otros métodos, como los microarrays de expresión génica, para responder a preguntas adicionales, como cómo el cambio de la expresión de un solo gen afecta a los patrones de expresión génica del genoma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, probar y validar la eficacia de los factores de transcripción artificial. Estos factores de transcripción artificiales controlan condicionalmente la expresión de genes colocados aguas abajo de las secuencias diana de ADN apropiadas.