Inyección sistémica de Neuronales células madre / progenitoras en ratones con EAE crónica

El objetivo general de este protocolo es administrar células progenitoras madre neurales al SNC mediante inyección intravenosa en ratones afectados por encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo de enfermedad que imita la esclerosis múltiple. Esto se logra derivando primero células progenitoras madre neurales, o NPC, de la zona subventricular del cerebro de ratones adultos. El segundo paso es marcar genéticamente a las NPC con tecnología de vectores virales para la identificación y el seguimiento de células in vivo.

A continuación, las neuroesferas proliferantes se disocian en una suspensión de una sola célula, se resuspenden a la densidad deseada y se inyectan en la vena de la cola de los ratones EAE en el pico de la enfermedad. En última instancia, la patología postmortem de órganos y tejidos y la inmunohistoquímica se realizan para identificar y caracterizar la supervivencia, la distribución y la integración de las células madre inyectadas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método mínimamente invasivo, seguro y eficaz para trasplantar células madre y progenitoras al sistema nervioso inflamado.

Este método ayuda a responder tres preguntas clave relacionadas con la seguridad y eficacia de las células madre inyectadas sistémicamente en modelos de enfermedades inflamatorias del sistema nervioso. La demostración visual de este método es útil especialmente para los científicos jóvenes, ya que ayuda en la comprensión de los pasos experimentales críticos, desde el aislamiento de las células madre cerebrales hasta la preparación para la inyección sistémica en un modelo de ratón para la esclerosis múltiple. Utilizar una técnica estéril adecuada.

Coloque un cerebro recién aislado en una matriz de corte de cerebro. Utilice dos hojas de afeitar para producir secciones coronales, a dos milímetros del polo anterior del cerebro, excluyendo las huellas ópticas y tres milímetros posteriores al corte anterior. Coloque los trozos de cerebro en una placa de Petri limpia y trabaje bajo un microscopio de disección para aislar el tejido de la zona subventricular.

Después de picar el tejido, agréguelo a 30 mililitros de solución de digestión previamente preparada y filtrada. Agitar suavemente e incubar durante 30 minutos, agitando cada 15 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de crecimiento completo.

Medio o MCG por pipeteo. Primero con una pipeta P 1000 y luego con una pipeta P 200. Una vez que se alcanza una suspensión de una sola celda, llévela a cinco mililitros con CGM y transfiérala a un nuevo matraz.

Coloque las células en una incubadora y permita que se formen neuroesferas durante cinco a siete días. Cuando esté listo, recoja la suspensión en un tubo de 15 mililitros y centrifuga. Retirar el sobrenadante y resuspender el paladar en 200 microlitros de MCG.

Disocie las neuroesferas mecánicamente pasándolas a través de una punta de pipeta P 200 de 100 a 150 veces. Lleva la suspensión hasta un mililitro con CGM. A continuación, diluya con precisión la suspensión.

Mezcle el volumen adecuado con una tinción vital y llene un hemocímetro para determinar el recuento de células. Vuelva a suspender las células en la concentración correcta y transfiéralas a un nuevo matraz. Repita estos pasos cada cuatro o cinco días para ayudar a la identificación de las células trasplantadas in vivo.

Las NPC se transducen con vectores virales que codifican genes reporteros 72 horas después de la transducción de NPC. La expresión de genes reporteros fluorescentes es verificable mediante inmunofluorescencia o citometría de flujo. Cuando esté listo, coseche las neuroesferas que expresan GFP por centrifugación y elimine el sobrenadante.

A continuación, agregue 200 microlitros de solución de disociación de agregados celulares e incube durante 10 minutos. Recupere las células y vuelva a suspenderlas suavemente para obtener una suspensión de una sola célula. Teniendo cuidado de evitar burbujas de aire.

Después de contar y diluir las células, mantenga la suspensión celular en hielo hasta que esté lista para usar. Una vez que las neuroesferas estén listas, recupere los ratones que se prepararon previamente para servir como modelo de ratón para el SNC. El tratamiento del daño debe ocurrir en el pico de expresión de la enfermedad.

Comience colocando a los ratones en una caja de calentamiento durante unos 10 minutos para permitir que la vena de la cola se dilate. Cuando esté listo, transfiera un mouse de la caja de calentamiento a un protector de mouse. Cierre el sujetador para restringir el movimiento y aislar la cola.

Esterilice el área de inyección en la cola con una solución tópica adecuada. Llene una jeringa de insulina de un mililitro con 150 microlitros de suspensión celular y asegúrese de eliminar todas las burbujas. Localice la vena en la superficie dorsal de la cola y coloque la aguja paralela a la vena en la parte media inferior de la cola.

Aquí, la vena está más cerca de la superficie de la piel. Facilitando así el procedimiento. Inserte suavemente la aguja en la vena asegurando su posición correcta extrayendo unos microlitros de sangre.

Luego, inyecte lentamente la solución en la vena de la cola Después de la inyección, retire la aguja y aplique presión durante unos segundos para ralentizar el sangrado. Coloque el ratón en una jaula nueva y vigile hasta que se recupere. Repita el mismo procedimiento para todos los ratones en puntos de tiempo experimentales predeterminados.

Se recogen muestras de animales tratados y de control y se analizan para determinar la infiltración e integración de las NPC en el SNC y otros tejidos cuando proliferan como neurosferas. Las NPC expresan marcadores de actividad mitótica como la fosfohisona H tres en verde y de células neuronales indiferenciadas como el nido en rojo cuando se colocan en condiciones de diferenciación adecuadas. Las NPCs expresan marcadores típicos de los tres linajes neuronales, como el marcador de astroglía, GFAP, el marcador neuronal, la proteína microtubular asociada dos, y los marcadores gliales oligo dyl O cuatro y los núcleos de proteínas básicas de mielina se contratiñen con MPCs indiferenciadas dpi que van a ser terapéuticamente eficaces después del trasplante deben expresar moléculas de adhesión a la superficie celular que incluyen CD 44 y la subunidad alfa cuatro del antígeno cuatro muy tardío. Estos ejemplos muestran que las NPCs transducidas expresan GFP, tanto como neuroesferas proliferantes como cuando se diferencian in vitro tras la retirada del factor de crecimiento. Las NPCs singénicas inyectadas sistémicamente en ratones EAE se encuentran casi exclusivamente en áreas perivasculares de daño en el SNC indicadas por las flechas tanto en el cerebro como en la médula espinal hasta 45 días después del trasplante.

Un paso clave de este procedimiento es la disociación celular. De hecho, la preparación de la suspensión unicelular es fundamental para evitar pinzas o agregados que puedan provocar la oclusión del vaso después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los investigadores en medicina regenerativa que estaban explorando protocolos mínimamente invasivos para la entrega eficiente de células madre no periódicas en el cerebro de pequeños animales de laboratorio y, en una perspectiva cercana, en humanos afectados por enfermedades neurológicas inflamatorias.

Después de ver este video, es de esperar que tenga una comprensión clara de los problemas relacionados con el aislamiento, la preparación y la inyección sistémica de posturas específicas de tejido en animales de laboratorio con enfermedades cerebrales.