Name: Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a analizar la iniciación de la traducción en células mamíferas bajo estrés mediante perfilado de polisomas. Este método utiliza gradientes de sacarosa y ultracentrifugación para separar ribosomas activos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PA es un beneficiario de una beca &quot;Pierre Durand&quot; de la Facultad de medicina de la Universidad de Laval. Este trabajo fue apoyado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (MOP-CG095386) a RM El fraccionador polisomas fue adquirida a través de una subvención de la Fundación Canadiense para la Innovación (MOP-GF091050) para RMR M tiene un nuevo premio salarial investigador CIHR. Agradecemos a los Dres. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco y A. Cammas para consejos útiles.

El protocolo sigue las directrices aprobado por la Junta de Revisión Ética de Laval. 1. Preparación de cultivos celulares y de manipulación del cerebro <ol><li> Las células de mamíferos y Drosophila <ol><li> Crecer HeLa células de cáncer cervical y las células embrionarias Schneider de Drosophila como recomienda la American Type Culture Collection. Trabajar con células en un pasaje bajo. </li><li> Las células de la placa con el fin de alcanzar el 80% de confluencia el día del experimento. Para obtener los mejores resultados, utilice ~ 12 x 10 6 células para cada condición experimental. Antes de hacer los extractos para el análisis polisomas, estimular traducción añadiendo medio completo fresco durante al menos 90 min. </li></ol></li><li> Aislamiento cerebro: Aislar los cerebros de los ratones de edades comprendidas entre 9 y 16 días después del nacimiento. La eutanasia implica inhalación de CO2 después de la anestesia y la dislocación cervical. Tras el sacrificio, aislar todo el cerebro y, o bien el lugar it a -80 ° C o transferir directamente en frío PBS 1X para su uso inmediato. </li></ol> 2. Preparación del gradiente de densidad sistema de fraccionamiento <ol><li> Lave el sistema de tubos con 0,1% SDS durante 5 min. </li><li> Lavar el sistema de tubos con 70% de etanol durante 5 min, después con una solución RNaseZAP durante 5 min antes de lavarlo con agua DEPC. </li><li> La bomba de aire con el fin de secar el sistema de tubos del aparato. </li></ol> 3. Preparación de los gradientes de sacarosa <ol><li> Hacer 15% y 55% de sacarosa en soluciones 20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 1,25 mM de MgCl 2, NaCl 150 mM, y DTT 1 mM. </li><li> Generar el 15-55% de gradiente lineal de sacarosa utilizando un Isco Modelo 160 gradiente de primera, como se describe por las instrucciones del fabricante. Sin embargo, es importante para controlar así la velocidad de la bomba peristáltica de TRIS con el fin de evitar la creación de burbujas o turbulencias en los gradientes. Mantener los gradientes a 4 ° C hasta su uso. </li><li> Durante el tiempo en el programa de fabricante de gradiente se está ejecutando, enfriar la ultracentrífuga a 4 ° C. </li></ol> 4. Preparación de células de ratón y extractos de cerebro <ol><li> Preparación de extractos celulares <ol><li> Coloque la placa (s) en las células de hielo y lavado 3 veces con PBS frío 1X. </li><li> Células de la cosecha (~ 12 x 10 6) en 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCl a pH 20 7,4, 1,25 mM de MgCl 2, NaCl 150 mM, DTT 1 mM, 1% Nonidet P40, 5 inhibidor U / ml de RNasa, complementado con mini tabletas completas de cóctel inhibidor de la proteasa libre de EDTA), transferirlos a un tubo Eppendorf, y mezclar bien pasándolos 15x a través de una jeringa de insulina U100 1cc 28 G 1/2. Deje que el lisado celular descansar en hielo durante 15 min. </li><li> Ponga unas gotas de lisado de células en un portaobjetos para evaluar la lisis celular mediante la observación en un microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo de 10X. Solamente los núcleos deben ser visibles y no hay membranas celulares deben ser visibles fehaciente para la lisis celular. Como control, observarlas células no lisadas. </li><li> Aclarar el lisado de células por centrifugación a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C y mantener el lisado soluble que contiene los polirribosomas. </li></ol></li><li> Preparación de extractos de cerebro del ratón <ol><li> Homogeneizar todo el cerebro aislado (~ 500 mg) mediante 10 golpes en un homogeneizador Dounce enfriado con hielo con 2 ml de tampón de lisis y aclarar el homogeneizado por centrifugación a 11.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Cargar el sobrenadante resultante sobre un cojín de 50% sacarosa y proceder con la sedimentación durante 2 horas a 200.000 xg usando un rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado translúcida que contiene los polirribosomas en 1 ml de tampón de lisis y mezclar bien pipeteando arriba y abajo. Dejar reposar la suspensión en el hielo durante 30 minutos antes de cargar en gradientes. </li></ol></li></ol> 5. Carga de los extractos en sacarosa Degradados y Ultracentrifugación <ol><li> Medir la concentraciónde ARN presente en el extracto citoplásmico utilizando un espectrofotómetro. Con cuidado y poco a poco cargar ~ 20 OD 260 unidades de extracto en el gradiente de sacarosa 15% a 55%. Asegúrese de que no tiene marca de 2-3 mm de espacio disponible en la superficie del tubo para evitar que desborda los tubos durante la centrifugación. </li><li> Centrifugar los gradientes usando un ultra-centrífuga durante 2 horas 30 minutos a 230.000 xg utilizando un rotor de ultracentrífuga TH-641 a 4 ° C. Cuando termina la centrifugación, retire los tubos y colocarlos en hielo con cuidado de no molestar a los gradientes. </li></ol> 6. Fraccionamiento de extractos citoplasmáticos de polisomas Profiling <ol><li> Coloque gradientes de sacarosa en sistema de fraccionamiento Densidad automatizado y proceder con el fraccionamiento automatizado y recogida de las fracciones (0,5 ml cada uno), tal como se describe por el fabricante. </li><li> Recoger cada fracción (~ 500 l) en tubos Eppendorf individuales con un seguimiento continuo de la absorbancia a 254 nm. En parallel de la operación de fraccionamiento de gradiente, el perfil polyribosomal se edita en el papel gráfico. También puede utilizar una unidad de adquisición de datos conectado a la grabadora de tabla para tener una adquisición electrónica del perfil polisomas. </li><li> Al final de cada ejecución, transferir Eppendorfs recogidos en hielo seco. En este momento, ya sea tienda recogieron fracciones a -80 ° C o precipitar directamente los complejos de proteína-ARN de la siguiente manera. </li></ol> 7. Extracción de Proteínas y Análisis <ol><li> Para cada fracción recogida de gradiente de sacarosa, añadir 2 volúmenes de etanol 100% frío y dejar que los complejos proteína-ARN precipitado a -20 ° C durante la noche. </li><li> Centrifugar cada precipitado de ARN-proteína a 11.000 xg durante 20 min a 4 ° C y luego se lava con etanol al 70%. Seco y resuspender el precipitado en tampón de muestra de SDS-PAGE antes de proceder con transferencia de Western usando anticuerpos específicos (ver Figura 2). </li></ol> 8. Extracción de ARN y Análisis <ol><li> Precipitar complejos proteína-ARN como en la sección 7.1. Resuspender cada precipitado de ARN-proteína en el tampón de lisis que contiene 0,1% de SDS. Se digiere el componente de proteína del precipitado con 2 mg / ml de proteinasa K durante 30 min en un 55 ° C baño de agua. </li><li> Extraer los componentes de ARN de la precipitado mediante la adición de 1 volumen de &quot;fenol: cloroformo&quot;, 2 volúmenes de cloroformo, y 0,1 volumen de 2 M de NaOAc pH 4 y centrifugando a 10.000 xg a 4 ° C durante 20 min. El precipitado de ARN de la fase acuosa resultante de cada muestra durante la noche a -20 ° C mediante la adición de 1 volumen de isopropanol y 0,2 g / l de glucógeno. Haga girar el precipitado durante 1 hora a 10.000 xga 4 º C. Lavar el precipitado de ARN con etanol al 70% frío. </li><li> Resuspender el sedimento de ARN en un pequeño volumen de agua libre de ARNasa. Evaluar la cantidad y la calidad de ARN usando el espectrofotómetro. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
<li>Fournier, M. -J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li>
<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li>
<li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), New York, N.Y. 1814-1821 (2009).</li>
<li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li>
<li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMR1+transcript+isoforms%3A+association+with+polyribosomes%3B+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li>
<li>Khandjian, E. W., Huot, M. -E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li>
<li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neuropsychopharmacol+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li>
<li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li>
<li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li>
<li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li>
<li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li>
<li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., Lü, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li>
<li>Fournier, M. -J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li>
<li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li>
<li>Béchade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+%28SMN%29+protein%3A+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li>
<li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDRD3%2C+a+novel+Tudor+domain-containing+protein%2C+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li>
<li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li>
<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
<li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
<li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El análisis del perfil de polisomas en gradientes de sacarosa permite la medición de iniciación de la traducción mediante el análisis de la densidad de polisomas aislados a partir de células o tejidos 9,11-14. Esta técnica es la mejor (si no el único) método para medir la iniciación de la traducción in vivo. Se utiliza para supervisar el estado de traslación de crecimiento de las células durante el ciclo celular 15, y para evaluar los efectos de diferentes tipos de estrés, incluyendo infec...

Las células eucariotas constantemente se encuentran con una amplia gama de condiciones de estrés fisiológicos y ambientales nocivos que requieren una rápida respuesta celular adaptativa. Respuesta al estrés celular requiere un equilibrio preciso entre la lucha contra la supervivencia y pro-supervivencia factores que actúan. La interrupción de este equilibrio puede tener consecuencias irreversibles que conducen al desarrollo de patologías humanas como el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas. Durante la primera etapa de la respuesta al estrés, las células activan vías de pro-supervivencia que implican el control coordinado de los cambios en la expresión génica a nivel de la traducción del ARNm. la traducción del ARNm en eucariotas es un proceso celular complejo que implica interacciones coordinadas entre los factores de iniciación de la traducción (EIFS), proteínas de unión de ARN específica (RBDS), y moléculas de ARN 1. la traducción del ARNm se divide en tres fases distintas: la iniciación, elongación, y terminación. Aunque las tres fases están sujetas a regulaciónmecanismos reguladoras, los mecanismos de control de la traducción se dirigen principalmente la fase de iniciación de la traducción, que de este modo constituye el paso limitante de la velocidad de la síntesis de proteínas 2. Iniciación de la traducción es un proceso altamente ordenado que comienza con la formación de la eIF2a.GTP.Met-tRNA I Met complejo ternario, y su posterior unión a la subunidad 40S del ribosoma, lo que lleva a la formación del complejo de pre-iniciación. El siguiente paso es el reclutamiento del complejo pre-iniciación a ARNm, que implica la actividad de los factores de iniciación de la traducción como eIF4F y eIF3. El complejo de preiniciación 48S así formado sufre cambios conformacionales específicos que permiten esta maquinaria para iniciar la exploración de la región 5&#39;-no traducida del ARNm hasta que se reconoce el codón de iniciación agosto La mayoría de los factores de iniciación de la traducción se liberan y 60S subunidades son reclutados para formar un ribosoma 80S complejo competente para su traducción, unt que se inicia la síntesis de proteínas punto (Figura 1). Más de un 80S monosome se puede traducir la misma mRNA a la vez la producción de los llamados polisomas (o polirribosomas). La densidad de polisomas en un ARNm refleja la iniciación, elongación y las tasas de terminación y por lo tanto es una medida de la traducibilidad de una transcripción en particular. Sin embargo, el perfil de polisomas se utiliza principalmente para evaluar los cambios en la traducción del ARNm en la etapa de iniciación. Aquí hemos utilizado un inhibidor del proteasoma como inhibidor de la iniciación de la traducción. El tratamiento de las células cancerosas con este fármaco induce una respuesta de estrés que se caracteriza por la activación de la quinasa de estrés llamado HRI que fosforila el factor de iniciación de la traducción eIF2a 3. La fosforilación de la eIF2a es uno de los eventos más importantes que conducen a la inhibición de la iniciación de la traducción en células de mamífero 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>HeLa células de cáncer de cuello uterino</td><td>Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila células embrionarias</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Medio de cultivo y suplementos</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologías DMEM</td><td>Life</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Científico Científico</td><td>SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Soluciones</td></tr><tr><td>de sacarosa D-sacarosa</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibidor de la RNasa (Inhibidor de la ribonucleasa recombinante RnaseOUT)</td><td>Life technologies</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteasas (completos, mini, sin EDTA)</td><td>Roche</td><td>11,836,170,001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Extracción de ARN</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Life technologies</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenol: cloroformo</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientist</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnologías de vida de glucógeno</td><td></td><td>10814-010</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros organics</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Antibodies</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-FMRP</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

análisis de la traducción iniciación durante condiciones de estrés por polisoma profiling

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

El control preciso de la traducción del ARNm es fundamental para la homeostasis de células eucariotas, particularmente en respuesta a estrés fisiológico y patológico. Las alteraciones de este programa pueden dar lugar al crecimiento de las células dañadas, un sello distintivo del desarrollo del cáncer, o a la muerte celular prematura tal como se ve en las enfermedades neurodegenerativas. Gran parte de lo que se conoce acerca de la base molecular para la traducción de control se ha obtenido a partir del análisis de polisomas utilizando un sistema de fraccionamiento en gradiente de densidad. Esta técnica se basa en la ultracentrifugación de extractos citoplásmicos en un gradiente lineal de sacarosa. Una vez que se ha completado el giro, el sistema permite el fraccionamiento y la cuantificación de las zonas centrifugadas correspondientes a diferentes poblaciones de traslación ribosomas, lo que resulta en un perfil de polisomas. Cambios en el perfil de polisomas son indicativos de cambios o defectos de iniciación de la traducción que se producen en respuesta a diversos tipos de estrés. Esta técnica también permite evaluar ªe papel de las proteínas específicas en la iniciación de la traducción, y para medir la actividad de traducción de los ARNm específicos. Aquí describimos nuestro protocolo para realizar perfiles de polisomas con el fin de evaluar iniciación de la traducción de las células y los tejidos eucariotas, ya sea en condiciones normales o de estrés de crecimiento.

Como se ha mencionado, polysome perfil permite el análisis de los cambios de iniciación de la traducción bajo condiciones de estrés. Figura 1 es una vista simplificada de iniciación de la traducción que, como se ha descrito anteriormente es un proceso de múltiples etapas que implica un conjunto ordenado de complejos de iniciación de la traducción. En condiciones normales de crecimiento, los complejos de iniciación de traducción se convierten en polirribosomas cuya detección por perfil polysome dar fe de...

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los efectos de condiciones de estrés sobre la traducción y la iniciación en células y tejidos de mamíferos mediante el perfilado de polisomas. Esto se logra primero tratando células cancerosas de mamífero con un fármaco anticancerígeno y luego preparando extractos celulares. El segundo paso consiste en preparar gradientes de sacarosa.A continuación, los extractos celulares se cargan sobre los gradientes de sacarosa y se someten a ultracentrifugación para separar las fracciones ribosomales. Finalmente, se realiza un análisis por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos para evaluar la asociación de las proteínas analizadas con los polisomas. La principal ventaja de esta técnica frente a un método existente como el marcaje metabólico es que nos permite evaluar el efecto de condiciones de estrés en la etapa de iniciación de la traducción.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo terapéutico del estrés, como si y cómo los fármacos anticancerígenos afectan la iniciación de la traducción. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia contra el cáncer porque ayuda a revelar nuevas vía

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Este protocolo describe un método fácil para extraer y fraccionar transcripciones de tejidos vegetales sobre la base del número de ribosomas unidos. Permite una estimación global de la actividad de traducción y la determinación del estado de traducción de ARNm específicos.

Un método fácil para la planta de perfiles de polisomas

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.

Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

El protocolo presentado aquí implica el perfil polisomal para aislar translatoma, ARNm asociados con ribosomas, en ARN polisomales y no polisomales de Arabidopsis a través de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Este método demuestra la eficiencia de traslación de Arabidopsis sometida a estrés térmico.

Prueba de eficiencia de traslación utilizando perfiles de polisomas bajo estrés térmico

Aprende a analizar la iniciación de la traducción en células mamíferas bajo estrés mediante perfilado de polisomas. Este método utiliza gradientes de sacarosa y ultracentrifugación para separar ribosomas activos.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

Explorar más videos