Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

El objetivo general de este procedimiento es medir los efectos de las condiciones de estrés en la traducción, la iniciación de células y tejidos de mamíferos mediante el perfil de polisomas. Esto se logra tratando primero las células cancerosas de mamíferos con un medicamento contra el cáncer y luego preparando extractos de células. El segundo paso es hacer sacarosa, degradados.

A continuación, los extractos celulares se cargan en la sacarosa, se gradientan y se ultracentrifugan para separar las fracciones ribosómicas. En última instancia, se realiza un análisis de Western blot utilizando anticuerpos específicos para evaluar la asociación de las proteínas probadas con el polisoma. La principal ventaja de esta técnica de un método existente como el marcaje metabólico, es que nos permite evaluar el efecto de las condiciones de estrés en la etapa de iniciación de la traducción.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo terapéutico del estrés, como si los fármacos contra el cáncer afectan al inicio de la traducción y cómo lo hacen. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer porque ayuda a revelar nuevas vías reguladoras de la iniciación de la traducción. Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación del inicio de la traducción en cultivos celulares, también se puede aplicar a otros sistemas, como tejidos aislados, incluidos el cerebro y los tumores.

Para preparar primero el sistema automatizado de fraccionamiento de gradiente de densidad, lave el sistema de tubos del aparato con 0.1%SDS durante cinco minutos. A continuación, lave el sistema de tubos con etanol al 70% durante cinco minutos, seguido de una solución de ARN Zap durante cinco minutos. Y por último, con DEPC, agua, seque el sistema de tubos bombeando aire al sistema.

A continuación, prepare las soluciones de 15% y 55% de sacarosa para generar el gradiente lineal de 15 a 55% de sacarosa utilizando un formador de gradiente 60 modelo ISCO uno. Siguiendo las instrucciones del fabricante, es importante controlar cuidadosamente la velocidad de la bomba peristáltica tris para evitar la creación de burbujas o turbulencias en los gradientes durante el tiempo en que el programa de creación de gradientes está funcionando para enfriar la ultracentrífuga a cuatro grados centígrados. Mantenga los gradientes a cuatro grados centígrados hasta que se utilicen células de cáncer de cuello uterino helo de paso bajo previamente colocadas para alcanzar el 80% de confluencia.

El día del experimento. Es importante realizar extracciones de células frescas y evitar la contaminación del ARN durante este procedimiento, 90 minutos antes de agregar el medicamento anticancerígeno, reemplace el medio de las células con medio fresco y completo. Para estimular la traducción, regrese las células a la incubadora.

Agregue el medicamento contra el cáncer directamente al cultivo celular como un complemento de control. DMSO incube durante cuatro horas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono después de cuatro horas, coloque las placas en hielo y lave las células tres veces con células de recolección de PBS frías en un mililitro de tampón de lisis para obtener mejores resultados. Utilice aproximadamente 12 millones de células para cada condición experimental.

Transfiera las células de las placas raspadas a un tubo de einor y mezcle bien pasándolas 15 veces a través de una jeringa. Deje reposar los lisados celulares sobre hielo durante 15 minutos. A continuación, coloque unas gotas de lisado celular en un portaobjetos y evalúe la lisis celular mediante microscopía de contraste de fase utilizando un objetivo de 10 x.

Una vez verificada la lisis celular, clarificar el lisado celular por centrifugación a 11.000 Gs durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el lisado soluble que contiene los polirribosomas a un nuevo tubo y manténgalo en hielo antes de cargar los extractos citoplasmáticos en los gradientes de sacarosa. Mida cuidadosamente la concentración de ARN presente con un espectrofotómetro y cargue lentamente aproximadamente 20 OD dos 60 unidades del extracto en el gradiente de sacarosa del 15 al 55%.

Asegúrese de que haya dos o tres milímetros de espacio disponible en la superficie del tubo para evitar que se desborde durante la centrifugación. Cargue los tubos en el rotor. Coloque el rotor en la ultracentrífuga y centrifugue los gradientes a 230.000 G a cuatro grados centígrados durante dos horas y 30 minutos.

Cuando se complete la centrifugación, retire los tubos y colóquelos en hielo con cuidado sin alterar los gradientes. Para comenzar el fraccionamiento de los extractos citoplasmáticos, coloque los gradientes de sacarosa en un sistema automatizado de fraccionamiento de densidad y proceda con el fraccionamiento y la recolección automatizados de fracciones según lo descrito por el fabricante. Recoja cada fracción de 0,5 mililitros en tubos de einor individuales con monitoreo continuo de la absorbancia a 250 nanómetros en paralelo a la operación de fraccionamiento en gradiente, el perfil polirribosómico se editará en el papel cuadriculado al final de cada ejecución.

Transfiera los tubos con las fracciones recolectadas a hielo. Para comenzar este procedimiento, agregue dos volúmenes de etanol 100% frío a cada fracción recolectada y deje que los complejos de proteínas de ARN precipiten a menos 20 grados Celsius durante la noche. Para la extracción de proteínas, centrifugar cada precipitado de proteína de ARN a 11.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados después de lavar con etanol al 70% de secado al aire y volver a suspender el precipitado.

Antes de continuar con el análisis de Western blot para la extracción de ARN Resus, suspenda cada precipitado de proteína de ARN en un tampón de lisis que contenga 0,1%SDS y digiera un componente proteico del precipitado con dos miligramos por mililitro de proteinasa K durante 30 minutos. En un baño de agua al 55% Celsius, agregue un volumen de cloroformo fenol, dos volúmenes de cloroformo y 0,1 volúmenes de acetato de sodio molar pH cuatro. Déjalo reposar sobre hielo durante 15 minutos.

Centrifugar a 10.000 GS a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Recoja la fase acuosa resultante de cada muestra de ARN precipitado añadiendo un volumen de isopropanol y 0,2 microgramos por microlitro de glucógeno y dejándolo a menos 20 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar el precipitado a 10.000 g a cuatro grados centígrados durante una hora.

Retire el sobrenadante y lave la bolita de ARN con etanol frío al 70%, resuspenda la bolita de ARN en un pequeño volumen de ARN. Agua gratis. Evalúe la cantidad y calidad del ARN utilizando el fotómetro espectrométrico.

Aquí se muestran perfiles representativos de polisomas de extractos citoplasmáticos. Preparado a partir de células helo cultivadas en condiciones normales o después del tratamiento con el inhibidor del proteasoma durante cuatro horas y centrífuga realizado con un gradiente lineal de sacarosa del 15 al 55% de volumen a peso. En cada perfil se indican las posiciones de los ribosomas 40 s 60 s, ribosomas 80 s, monos y polisomas.

Las fracciones de la parte superior a la inferior del gradiente se muestran de izquierda a derecha, las fracciones se recolectaron y analizaron mediante Western blot con anticuerpos contra la proteína ribosómica grande L 28, así como la proteína asociada al polisoma FMRP que sirven como controles para la integridad del polisoma en condiciones normales de crecimiento. Los complejos de iniciación de la traducción se convierten en polirribosomas cuya detección mediante el perfil de polisomas atestigua una iniciación activa de la traducción, como se observa aquí. El tratamiento con el inhibidor del proteasoma reduce los picos de polisomas con un aumento concomitante de un DS Monos que indica una inhibición del inicio de la traducción Mientras se realiza este procedimiento, es importante trabajar en un entorno libre de r nasa para manejar los gradientes con cuidado y controlar la lisis celular Después de este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la sangre occidental y la sangre norte, para responder preguntas adicionales, como la asociación de una proteína específica o el MNA M con el polisoma que se ve afectado por el tratamiento anticancerígeno después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la traducción exploraran el impacto de la regulación de los factores de iniciación de la traducción en enfermedades humanas como el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas.