Disminución de la concentración de itraconazol y Duración del éxito en el tratamiento de
14 de marzo de 2014
Infección por Batrachochytrium dendrobatidis en los anfibios puede ser eliminado utilizando una concentración reducida (0,0025%) y menor duración (baños de cinco minutos durante seis días) de itraconazol que la que se utiliza generalmente. Se observaron menos mortalidad y menos efectos secundarios negativos utilizando este protocolo de tratamiento modificado.
El objetivo general de este procedimiento es tratar anfibios infectados con el hongo de los anfibios Kitt, Bera key tridium, dendro, he o BD, utilizando la quimioterapia antifúngica con triazol. Esto se logra primero cultivando cepas de BD e inoculando los animales con el patógeno fúngico. El segundo paso consiste en probar a los animales mediante extracción de ADN y QPCR en hisopos cutáneos para confirmar la infección por BD.
A continuación, los animales infectados se tratan sumergiéndolos en una solución de econazol al 0,0025 % durante cinco minutos al día durante seis días. El paso final consiste en monitorear el estado de la infección en los animales tratados mediante análisis de QPCR en hisopados de piel durante un mínimo de cuatro semanas posteriores a la finalización del tratamiento, para asegurar la cura exitosa del animal. Este procedimiento demuestra que una concentración reducida y un tiempo de tratamiento más corto del antifúngico itraconazol son eficaces para tratar animales infectados con Bd. La principal ventaja de utilizar este régimen de tratamiento frente a la dosis recomendada, que consiste en una solución de itraconazol al 0,01 % durante 11 días, es que una concentración reducida equivalente a un cuarto de la dosis recomendada y un tiempo de tratamiento reducido a seis días sigue siendo eficaz para curar la infección por BD, pero también minimiza los efectos secundarios negativos asociados con la dosis recomendada.
Después de incubar el BD en caldo triptónico según se describe en el protocolo escrito y verificar el movimiento de los esporos Zo, inundar cada placa con cinco mililitros de agua corriente envejecida y esperar 10 minutos para permitir que los esporos ZO penetren en el medio. A continuación, verter la suspensión de esporos ZO en un recipiente portátil. Estimar la concentración de esporos ZO mediante un hemocitómetro y diluir la mezcla hasta una concentración de uno por diez elevado a seis por tres mililitros con agua corriente envejecida para inocular un animal como la Latoria vei Alpina que se muestra aquí.
Sosténgalo sobre un recipiente de 50 mililitros y vierta tres mililitros de la mezcla de inóculo sobre su vientre. Luego coloque el animal en el recipiente junto con el exceso de inóculo. Coloque una tapa en el recipiente y deje al animal en el recipiente de inóculo durante 24 horas para asegurar la infección.
Para prevenir la contaminación con el patógeno BD. Retire los guantes usados y colóquelos para ser autoclavados antes de su eliminación. Después de ponerse un nuevo par de guantes, proceda a inocular al siguiente animal.
Después de 24 horas de inoculación, devuelva los animales a sus terrarios desinfectados individuales durante dos semanas. Recuerde desinfectar todos los desechos líquidos antes de su eliminación llevando la solución al 10% de lejía después de dos semanas. Compruebe la infección exitosa por BD mediante hisopado de los animales con un hisopo de algodón estéril.
Rotando suavemente la torunda durante y entre los pasos. Realice cinco pasadas en el vientre en cada lado, cada muslo y cada una de las cuatro extremidades, para un total de 45 pasadas. Almacene las torundas en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros a menos 20 grados Celsius.
Extraiga el ADN genómico de las muestras utilizando un kit comercial disponible para aislamiento de ADN y realice la QPCR según se describe en el protocolo del texto. Prepare tres baños de tratamiento, uno para cada una de las tres dosis de itraconazol según se indica en el protocolo del texto. A continuación, coloque individualmente los anfibios en desinfectado.
Recipientes de 50 mililitros con 35 mililitros de la solución de tratamiento. Recordando cambiar los guantes entre cada animal, agite suavemente el recipiente ocasionalmente para asegurar que los animales queden completamente cubiertos durante cinco minutos. Después de cinco minutos, devuelva los animales a su área desinfectada.
Repita el tratamiento de cinco minutos diariamente durante cinco días adicionales. Evalúe nuevamente a los animales para la infección por BD una semana después de finalizar el tratamiento y una vez por semana durante cuatro semanas para asegurar que la infección se haya eliminado. Tenga en cuenta que, incluso después de finalizado el tratamiento, los animales deben manejarse como si aún representaran un riesgo de contaminación.
Los animales deben mantenerse en áreas separadas durante al menos un mes después de la infección. Si el tratamiento no tiene éxito, debe repetirse. Diferentes especies y diferentes estadios de vida responden de manera distinta a la infección y a los regímenes de tratamiento, por lo tanto, el tratamiento debe probarse antes de ser implementado ampliamente.
Dado que BD es un riesgo biológico, desinfecte semanalmente el terrario individual sumergiendo el terrario y los recipientes de tratamiento en una solución de lejía al 10%. Sumerja durante al menos 30 segundos, elimine la lejía con dos enjuagues con agua y deje secar los recipientes durante 24 horas antes de reutilizarlos para la supervivencia de las ranas. A continuación se muestran resultados tras 11 días de tratamiento con BD o seis días de tratamiento con BD.
Las flechas negras indican el último día de tratamiento. Las líneas continuas indican la supervivencia de los grupos control. Las líneas negras continuas corresponden a animales que fueron positivos para BD pero que no recibieron el tratamiento con BD.
Y las líneas grises continuas corresponden a animales que dieron negativo en BD y que no recibieron tratamiento con BD. Las líneas discontinuas muestran la supervivencia de los grupos tratados que recibieron la concentración indicada de econazol. Todos los animales tratados con 0,0025 % en nebulizador durante seis días dieron negativo en BD cuatro semanas después de finalizado el tratamiento, por lo que este tratamiento se consideró exitoso.
Además, esta dosis de tratamiento con econazol no mostró diferencias significativas en mortalidad en comparación con los controles positivos de BD. Obsérvese que los tratamientos con econazol al 0,01 % y al 0,005 % durante 11 días provocaron un aumento significativo en la mortalidad en comparación con los controles positivos de BD. No olvide que el patógeno fúngico BD representa un riesgo biológico, por lo que se deben tomar precauciones como el uso y cambio de guantes, la autoclaveación de todos los residuos sólidos y la desinfección.
Todos los residuos líquidos deben gestionarse al seguir este procedimiento.
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Resumen
Este estudio investiga un protocolo de tratamiento modificado para la infección por Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) en anfibios utilizando itraconazol. Los hallazgos sugieren que una concentración reducida y una duración más corta del tratamiento pueden eliminar eficazmente la infección mientras se minimizan los efectos secundarios.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Micología
- Salud de los anfibios
- Tratamiento de enfermedades infecciosas
Antecedentes
- Batrachochytrium dendrobatidis es un hongo patógeno que afecta a los anfibios.
- El tratamiento tradicional implica concentraciones más altas y duraciones más largas de agentes antifúngicos.
- Reducir la concentración y la duración del tratamiento puede mejorar el bienestar animal.
- La monitorización del estado de infección tras el tratamiento es crucial para evaluar la eficacia.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficacia de una concentración más baja de itraconazol para tratar la infección por Bd.
- Minimizar los efectos secundarios negativos asociados con los protocolos de tratamiento tradicionales.
- Establecer un régimen de tratamiento más humano para anfibios infectados.
Métodos Utilizados
- Inoculación de anfibios con cultivos de Bd.
- Extracción de ADN y QPCR para confirmación de la infección.
- Baño diario de los animales infectados en una solución de itraconazol al 0,0025 % durante cinco minutos al día durante seis días.
- Monitoreo posterior al tratamiento mediante análisis de QPCR en hisopados cutáneos durante cuatro semanas.
Resultados principales
- El protocolo de tratamiento modificado eliminó eficazmente la infección por Bd.
- La reducción de la concentración y la duración provocó una menor mortalidad.
- Se observaron menos efectos secundarios negativos en comparación con los métodos tradicionales.
- El tratamiento exitoso se confirmó mediante análisis de QPCR.
Conclusiones
- Una concentración más baja y una duración del tratamiento más corta de itraconazol son eficaces contra Bd.
- Este enfoque puede mejorar el bienestar de los anfibios tratados.
- Investigaciones futuras podrían optimizar los protocolos de tratamiento para otros patógenos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este estudio demuestra que reducir la concentración del antifúngico y la duración del tratamiento puede mantener la eficacia al tiempo que mejora los perfiles de seguridad en modelos de anfibios. Para la I+D de biofármacos, esto respalda estrategias de optimización de dosis que equilibran el índice terapéutico y la tolerabilidad en el desarrollo preclínico de antifúngicos. El enfoque resalta cómo el refinamiento iterativo de los parámetros del régimen puede reducir los riesgos de los candidatos líderes antes de los estudios habilitantes para el IND.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las relaciones dosis-respuesta para mecanismos antifúngicos en un modelo de infección en organismo completo.
- Valor operativo: Proporciona un sistema escalable para evaluar la interacción con el blanco y la eliminación del patógeno bajo condiciones de exposición reducida.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Establece una lectura estandarizada basada en QPCR para cuantificar la carga fúngica tras el tratamiento.
- Valor operativo: Facilita la reproducibilidad del ensayo mediante protocolos definidos de inmersión y controles ambientales.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece un sistema relevante para la enfermedad para evaluar los márgenes de seguridad de los compuestos antifúngicos en diferentes etapas de la vida.
- Valor operativo: Facilita la comparabilidad entre especies mediante la definición de parámetros para el fracaso del tratamiento y los criterios de éxito.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se encaja dentro de la optimización de compuestos antifúngicos iniciales, donde se evalúan los compromisos entre eficacia y seguridad antes de la selección del candidato.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al vincular la disminución de la exposición al fármaco con la conservación de la eliminación del patógeno.
- Tamizaje: Permite la evaluación estandarizada de la eficacia de compuestos mediante matrices definidas de duración de inmersión y concentración.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante QPCR para comparar la carga fúngica entre grupos de tratamiento.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al establecer ventanas de monitoreo post-tratamiento para confirmar la eliminación sostenida.
- Reutilización Empresarial: Proporciona una plataforma reutilizable para evaluar candidatos antifúngicos con una carga de recursos reducida por condición de prueba.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación del blanco mediante la correlación entre una exposición menor y una eficacia sostenida.
- Valor operativo: Normalización de la inducción de infecciones, administración del tratamiento y descontaminación ambiental.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al identificar regímenes eficaces con señales reducidas de toxicidad.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de compuestos que demuestran eficacia a concentraciones más bajas.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en cría de anfibios, manejo de patógenos fúngicos y diagnósticos moleculares.
- Los equipos necesarios incluyen sistemas de QPCR, hemocitómetros para la cuantificación de esporas y cámaras ambientales controladas.
- La estandarización entre equipos requiere consenso sobre los umbrales de confirmación de infección y el monitoreo del cumplimiento del tratamiento.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la tolerancia específica a especies respecto a los procedimientos de baño y el metabolismo del fármaco dependiente del estadio de vida.
- Las limitaciones prácticas incluyen los requisitos de contención de riesgos biológicos para Bd y la variabilidad específica a cada especie en la respuesta al tratamiento.
