Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

El objetivo general de este procedimiento es diseñar nanofibras independientes, nanoestructuras y matrices 2D a partir de una o varias proteínas de matriz extracelular utilizando el ensamblaje iniciado por la superficie. Esto se logra preparando primero sellos de polidimetil soano o PDMS vertiendo el prepolímero PDMS en un molde maestro con patrón topográfico y permitiendo que se cure. El segundo paso es cortar los sellos de PDMS curados y recubrirlos con una solución que contenga las proteínas de la matriz extracelular deseadas.

A continuación, los sellos se lavan, se secan y se imprimen por microcontacto en un encubrimiento de cubierta de vidrio recubierto de poli N iso propilacrilamida o PAM de tubería. El paso final es hidratar el cubreobjetos con agua desionizada tibia a 40 grados centígrados y dejar que se enfríe gradualmente reduciendo la solución. Una temperatura inferior a unos 32 grados centígrados desencadena la disolución de la capa PAM de la tubería térmicamente sensible y la liberación de nanofibras de proteínas ensambladas o nanoestructuras.

En última instancia, las nanofibras y nanoestructuras ensambladas son independientes en solución, como lo confirma la microscopía de contraste de fase o fluorescencia, y se pueden utilizar en otras aplicaciones, como andamios de ingeniería de tejidos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la separación de caras o el electrohilado, es la capacidad de diseñar nanofibras de proteínas ECM utilizando una técnica que realmente imita la forma en que las células normalmente construyen fibras ECM in vivo. La técnica de ensamblaje iniciado en superficie tiene una serie de ventajas únicas, incluida la capacidad de controlar la composición de proteínas, la morfología de las fibras y la arquitectura del andamio.

Además, podemos diseñar nanofibras de proteínas ECM a partir de proteínas de matriz extracelular como el laminado de fibra nin y el colágeno tipo cuatro, lo que ha demostrado ser difícil utilizando otros tipos de métodos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, ya que permite a los investigadores desarrollar construcciones con señales físicas y químicas específicas y bien definidas para dirigir una variedad de comportamientos celulares, como la adhesión y la diferenciación. Si eres nuevo en esta técnica, debes recordar inspeccionar continuamente la calidad de tus tallos, así como la fidelidad de los patrones impresos por micro contacto.

Esto es esencial para obtener el ensamblaje adecuado de las nanofibras y nanoestructuras del ECM. Para comenzar este procedimiento, prepare el prepolímero de polidimetil soano o PDMS combinando la base de elastómero y el agente de curado en una proporción de 10 a un peso por peso, por lo general, se utilizan 80 gramos de base y ocho gramos de agente de curado para garantizar que haya suficiente PDMS para cubrir el molde maestro en una mezcla de capa de un centímetro de espesor y DGA el PDMS usando un mezclador centrípeto configurado a la siguiente mezcla a 2000 RPM durante dos minutos, DGA a 2000 RPM durante dos minutos. Lo suficientemente pobre.

El PDMS pre polímero sobre el molde maestro para formar una capa de un centímetro de espesor aquí, el PDMS horneando a 65 grados centígrados durante cuatro horas. Una vez curado, use un bisturí para cortar la región que contiene el patrón para formar el sello PDMS. Para distinguir el lado de la característica del reverso del sello PDMS.

Corta una muesca en una de las esquinas de la parte posterior de la estampilla. Comience este procedimiento limpiando los cubreobjetos de vidrio de 25 milímetros de diámetro, sonique los cubreobjetos en etanol al 95% durante una hora y luego séquelos en un horno a 65 grados centígrados. A continuación, prepare la solución de poli e isopropilo acrilamida o piam, disuelva piam en un butanol a una concentración del 10%Centrar una cubierta de vidrio limpia, deslice el mandril de vacío del spin coer y pipetee 200 microlitros de la solución de Pam de tubería sobre la superficie del vidrio para cubrir la superficie por completo.

Gire la capa de cubierta a 6, 000 RPM durante un minuto. Limpie los sellos de PDMS por sonicación en etanol al 50% durante 30 minutos, y luego séquelos bajo una corriente de secado con nitrógeno y todos los pasos posteriores deben realizarse en una cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad para aplicaciones en las que se utilizará la matriz extracelular o las nanoestructuras de ECM con las células. El paso de impresión por microcontacto es el aspecto más difícil de este procedimiento.

Es importante inspeccionar los sellos PDMS en busca de defectos visibles antes de usarlos. Además, no use una solución de proteínas que tenga más de dos semanas de antigüedad. La cubierta recubierta de PIAM se desliza dentro de una placa de Petri cerrada y se esteriliza mediante la exposición a los rayos UV.

45 minutos bajo la luz ultravioleta en una cabina de bioseguridad es suficiente. Cubra la superficie del patrón de cada sello PDMS con 200 microlitros de la solución de proteína. La fibronectina o FN se utiliza aquí en una concentración de 50 microgramos por mililitro en agua destilada estéril.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente, después de una hora, lavar los sellos de PDMS y el agua destilada para eliminar el exceso de proteínas y secar completamente bajo un chorro de nitrógeno. Es importante eliminar el agua por completo para evitar la disolución prematura de la tubería. Recubrimiento de Pam en el cubreobjetos y transferencia inadecuada de proteínas.

Realice la impresión por microcontacto colocando el lado característico del sello PDMS en contacto con el cubreobjetos recubierto de PAM de la tubería si es necesario. Use fórceps para golpear ligeramente la parte posterior de los sellos para eliminar las burbujas de aire y asegurar un contacto uniforme después de cinco minutos. Despegue el sello PDMS de la cubierta.

En esta etapa. Dependiendo del estudio, se pueden modelar proteínas ECM adicionales para crear estructuras más complejas y multicomponente. Una vez que se haya impreso el patrón ECM, coloque el cubreobjetos de cubierta recubierto de PAM de tubería estampada en una placa de Petri de 35 milímetros e inspeccione la fidelidad del patrón utilizando microscopía de contraste de fase.

Dependiendo del patrón, puede ser necesaria una cámara CCD para resolver las características del patrón. La microscopía de fluorescencia también se puede utilizar para inspeccionar el patrón, siempre que las proteínas de la MEC estén marcadas con fluorescencia. Después de verificar la fidelidad del patrón, agregue tres mililitros de agua destilada a 40 grados centígrados a la placa de Petri y deje que el agua se enfríe gradualmente la disolución de la tubería.

La capa de PAM y la liberación de los patrones de proteínas de ECM se pueden monitorizar mediante microscopía de contraste de fase. Por lo general, para garantizar que se hayan liberado las nanoestructuras de proteínas ECM, el agua se enfría a temperatura ambiente muy por debajo de la temperatura crítica más baja de la solución de la tubería, pam, que es de 32 grados Celsius. Si la aplicación no permite el uso de técnicas ópticas, la liberación se puede controlar midiendo la temperatura de la solución.

Las nanofibras y otras nano estructuras estarán flotando en el agua después de la liberación de la capa de PAM de la tubería. Para otras aplicaciones, los nanotejidos y otras nanoestructuras deben manipularse, pero el enfoque exacto dependerá del objetivo experimental. Aquí se presentan resultados representativos para demostrar que el ensamblaje iniciado por la superficie o SIA es capaz de diseñar nanofibras de proteínas ECM con un control preciso sobre las dimensiones de las fibras.

Un conjunto de rectángulos de fibronectina, de 50 micrómetros de largo y 20 micrómetros de ancho, se modelaron sobre una cubierta de recubrimiento recubierta de piam con la adición de 40 grados Celsius de agua desionizada y el posterior enfriamiento por debajo de la solución crítica inferior. La temperatura del piam desencadenó la disolución del piam y la liberación de las nanofibras de fibroína al liberarlo. Las fibras se contrajeron porque estaban bajo un pretensado inherente.

Cuando se modelaron en la superficie de piam, el análisis de Alice de las dimensiones de las nanofibras de fibronectina antes de la liberación reveló que eran monodispersas con una longitud promedio de 50.19 más o menos 0.49 micrómetros y un ancho promedio de 19.98 más o menos 0.17 micrómetros. Tras la liberación, las nanofibras se contrajeron apreciablemente, pero permanecieron monodispersas con una longitud media de 14,15 más o menos 0,92 micrómetros y una anchura media de 2,65 más o menos 0,32 micrómetros. La microscopía de fuerza atómica proporcionó una perspectiva de mayor resolución de los cambios dimensionales de la fibra asociados con el proceso de liberación de SIA.

En particular, las fibras de preliberación tenían un grosor uniforme de unos cinco nanómetros, mientras que las fibras posteriores a la liberación tenían un grosor del orden de varios cientos de nanómetros, mientras que la longitud y la anchura disminuían. Utilizando el proceso SIA, es posible diseñar una variedad de nanoestructuras de proteínas ECM con tamaño, forma y composición ajustables. Por ejemplo, las nanofibras de fibronectina, inicialmente de 20 micrómetros de ancho y un centímetro de largo, se modelaron en una tubería.

Cubierta recubierta de PAM deslizamiento sobre enfriamiento y tubería. Con la disolución de Pam, las nano fibras se liberaron formando hilos largos con un ancho reducido de unos tres micrómetros. Además, dado que el patrón está definido por la topografía de la superficie del sello PDMS utilizado para la impresión por microcontacto, es posible diseñar nanoestructuras complejas de proteínas ECM como prueba de concepto.

Se crearon estrellas de fibroína de múltiples brazos. La liberación térmica resultó en la contracción de los brazos, pero no en la región central de la estrella donde los brazos se unieron. SIA también trabaja con otras proteínas de ECM, como el laminado o el LN, y se pueden incorporar múltiples proteínas de ECM en la misma estructura.

En este ejemplo, se modelaron líneas ortogonales interconectadas de 20 micrómetros de fibronectina que se muestran en rojo y líneas de 50 micrómetros de ancho de laminina que se muestran en verde integradas en un tejido nano 2D y luego se liberaron al soltar ambos tipos de nanofibras contraídas, pero se mantuvo la interconectividad general y la estructura de celosía cuadrada. Estos resultados demuestran que SIA se puede utilizar para diseñar materiales ECM con una variedad de composiciones y estructuras. Por último, se muestran algunos casos de SIA fallido de nanofibras ECM.

Una de las causas es la liberación incorrecta de un patrón incompleto debido a una mala transferencia de la proteína ECM a la superficie del piam. Durante la impresión por microcontacto, la presencia de agujeros, bordes irregulares y otros defectos creará nanofibras y nanoestructuras que están incompletas y son propensas a romperse y fragmentarse al soltarse. La disolución rápida de la tubería PAM también puede causar una mala fidelidad del patrón después de la liberación.

Por ejemplo, usar agua a 20 grados centígrados, una temperatura que ya está por debajo de la solución crítica más baja. La temperatura del piam hará que el piam se hinche y se disuelva rápidamente. Esto puede hacer que las nanofibras se rompan y se rompan, como se ilustra en la imagen 32, y formen configuraciones aleatorias y desorganizadas, como se ilustra en la imagen de 52 segundos.

Antes de comenzar este procedimiento, el estado del PDMS se debe a defectos y también asegúrese de que todas las superficies estén libres de polvo. De lo contrario, impedirá la transferencia adecuada de proteínas y conducirá a un ensamblaje deficiente de las estructuras A CM. Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, las nanofibras o nanoestructuras de liberación se pueden usar para hacer una serie de cosas, como analizar las propiedades mecánicas de las fibras de proteínas, o se pueden usar como andamios para la ingeniería de tejidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar nanofibras y nanoestructuras de proteínas ECM con composición, geometría y arquitectura ajustables. Específicamente, comprenderá cómo micro contactar patrones de impresión de proteínas ECM en cubreobjetos de vidrio recubiertos de pitón y luego desencadenar térmicamente la disolución de la superficie para ensamblar las estructuras de ECM.