Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

El objetivo general de este procedimiento es diseñar nanofibras, nanoestructuras y matrices bidimensionales independientes a partir de una o múltiples proteínas de matriz extracelular utilizando ensamblaje iniciado en superficie. Esto se logra primero preparando sellos de poli(dimetilsiloxano) o PDMS, vertiendo el prepolímero de PDMS sobre un molde maestro con un patrón topográfico y dejándolo curar. El segundo paso consiste en recortar los sellos de PDMS curados y recubrirlos con una solución que contiene las proteínas de matriz extracelular deseadas.

A continuación, los sellos se lavan, se secan y se imprimen por microcontacto sobre una cubreobjetos de vidrio recubierta con poli N-isopropilacrilamida, o pNIPAM. El último paso consiste en hidratar la cubreobjetos con agua desionizada tibia a 40 grados Celsius y permitir que se enfríe gradualmente, lo que reduce la temperatura de la solución. Por debajo de aproximadamente 32 grados Celsius, se desencadena la disolución de la capa de pNIPAM sensible al calor y la liberación de las nanoestructuras o nanofibras proteicas ensambladas.

Finalmente, las nano fibras y nano estructuras ensambladas son independientes en solución, tal como se confirma mediante microscopía de contraste de fase y/o microscopía de fluorescencia, y pueden utilizarse en aplicaciones posteriores, como andamios para ingeniería de tejidos. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la separación por fases o el electrohilado, es la capacidad de diseñar nano fibras de proteínas de la matriz extracelular mediante una técnica que imita fielmente la forma en que las células construyen normalmente las fibras de matriz extracelular in vivo. La técnica de ensamblaje iniciado en la superficie presenta varias ventajas únicas, incluida la capacidad de controlar la composición proteica, la morfología de las fibras y la arquitectura del andamio.

Además, podemos diseñar nanofibras de proteínas de la matriz extracelular a partir de proteínas de la matriz extracelular como la fibronectina laminina y el colágeno tipo cuatro, lo cual ha resultado difícil utilizando otros tipos de métodos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos al permitir a los investigadores desarrollar construcciones con indicaciones físicas y químicas específicas y bien definidas para dirigir una variedad de comportamientos celulares, como la adhesión y la diferenciación. Si usted es nuevo en esta técnica, debe recordar inspeccionar continuamente la calidad de sus andamios, así como la fidelidad de los patrones impresos por microcontacto.

Esto es esencial para obtener un ensamblaje adecuado de las nanoestructuras y nanofibras de la matriz extracelular. Para comenzar este procedimiento, prepare el prepolímero de poli(dimetilsiloxano) o PDMS combinando la base elastomérica y el agente de curado en una relación de 10 a 1 peso por peso; normalmente se utilizan 80 gramos de base y 8 gramos de agente de curado para asegurar que haya suficiente PDMS para cubrir el molde maestro con una capa de un centímetro de espesor. Mezcle y desgasifique el PDMS utilizando un mezclador centrífugo ajustado a las siguientes condiciones: mezcle a 2000 RPM durante dos minutos, desgasifique a 2000 RPM durante dos minutos. Vierta con cuidado.

Coloque el prepolímero de PDMS sobre el molde maestro para formar una capa de un centímetro de espesor aquí, el PDMS mediante horneado a 65 grados Celsius durante cuatro horas. Una vez curado, use un escalpelo para recortar la región que contiene el patrón y formar el sello de PDMS. Para distinguir el lado de las características del lado posterior del sello de PDMS.

Corte una muesca en una de las esquinas del lado posterior del sello. Comience este procedimiento limpiando las laminillas de vidrio de 25 milímetros de diámetro; someta las laminillas a sonicación en etanol al 95 % durante una hora y luego séquelas en un horno a 65 °C. A continuación, prepare la solución de poli e isopropil acrilamida o piam: disuelva piam en butanol-1 a una concentración del 10 %. Coloque una laminilla de vidrio limpia en el portamuestras al vacío del espinador y agregue 200 microlitros de la solución de piam sobre la superficie de vidrio mediante pipeta, cubriendo completamente la superficie.

Aplicar recubrimiento por centrifugado sobre el cubreobjetos a 6.000 RPM durante un minuto. Limpiar los sellos de PDMS mediante sonicación en etanol al 50 % durante 30 minutos, seguido de secado bajo una corriente de nitrógeno; todos los pasos subsiguientes deben realizarse en una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad en aplicaciones donde la matriz extracelular o las nanoestructuras de ECM se utilizarán con células. El paso de impresión por microcontacto es el aspecto más difícil de este procedimiento.

Es importante inspeccionar los sellos de PDMS en busca de defectos visibles antes de su uso. Además, no utilice soluciones de proteína con una antigüedad superior a dos semanas. Coloque las cubreobjetos recubiertos con PIAM dentro de una placa de Petri cerrada y esterilice mediante exposición a UV.

45 minutos bajo la luz UV en una cabina de seguridad biológica son suficientes. Recubra la superficie con patrón de cada sello de PDMS con 200 microlitros de la solución de proteína. Se utiliza fibronectina o FN a una concentración de 50 microgramos por mililitro en agua destilada estéril.

Incubar durante una hora a temperatura ambiente; después de una hora, lavar los sellos de PDMS con agua destilada para eliminar las proteínas en exceso y secar completamente bajo una corriente de nitrógeno. Es importante eliminar completamente el agua para evitar la disolución prematura del tubo, el revestimiento de Pam en la cubeta y una transferencia inadecuada de proteínas.

Realice la impresión por microcontacto colocando el lado con características del sello de PDMS en contacto con la cubreobjetos recubierta con PAM del tubo, si es necesario. Utilice pinzas para golpear suavemente la parte posterior de los sellos y eliminar cualquier burbuja de aire, y asegure un contacto uniforme después de cinco minutos. Retire el sello de PDMS de la cubreobjetos.

En esta etapa, según el estudio, se pueden configurar proteínas adicionales de la matriz extracelular para crear estructuras más complejas y multicomponentes. Una vez impreso el patrón de la matriz extracelular, coloque el cubreobjetos recubierto con PAM de tubo configurado en una placa de Petri de 35 milímetros e inspeccione la fidelidad del patrón utilizando microscopía de contraste de fase.

Dependiendo del patrón, puede ser necesario utilizar una cámara CCD para resolver sus características. La microscopía de fluorescencia también puede emplearse para inspeccionar el patrón, siempre que las proteínas de la matriz extracelular estén marcadas con fluorescencia. Tras verificar la fidelidad del patrón, añada tres mililitros de agua destilada a 40 grados Celsius a la placa de Petri y permita que el agua se enfríe gradualmente para disolver el conducto.

La capa de PAM y la liberación de los patrones de proteínas de la matriz extracelular se pueden monitorear mediante microscopía de contraste de fase. Normalmente, para asegurar que las nanoestructuras de proteínas de la matriz extracelular se han liberado, el agua se enfría a temperatura ambiente, bien por debajo de la temperatura crítica inferior de solución del PAM, que es de 32 grados Celsius. Si la aplicación no permite el uso de técnicas ópticas, la liberación se puede monitorear midiendo la temperatura de la solución.

Las nano fibras y otras nano estructuras flotarán en el agua tras la liberación de la capa de PAM del tubo. Para aplicaciones adicionales, es necesario manipular las nano telas y otras nano estructuras, pero el enfoque exacto dependerá del objetivo experimental. Aquí se presentan resultados representativos que demuestran que el ensamblaje iniciado en la superficie, o SIA, es capaz de diseñar nano fibras de proteínas de la matriz extracelular con control preciso sobre las dimensiones de las fibras.

Se dispusieron en patrón una serie de rectángulos de fibronectina, de 50 micrómetros de longitud y 20 micrómetros de ancho, sobre un cubreobjetos recubierto con piam mediante la adición de agua desionizada a 40 grados Celsius y posterior enfriamiento por debajo de la temperatura crítica inferior de solución. La temperatura del piam desencadenó la disolución del piam y la liberación de las nano fibras de fibroína tras la liberación. Las fibras se contrajeron porque estaban sometidas a una pre-tensión inherente.

Cuando se imprimieron sobre la superficie de piam, el análisis de Alice de las dimensiones de las nanofibras de fibronectina antes de la liberación reveló que eran monodispersas, con una longitud promedio de 50,19 ± 0,49 micrómetros y un ancho promedio de 19,98 ± 0,17 micrómetros. Tras la liberación, las nanofibras se contrajeron considerablemente, pero permanecieron monodispersas, con una longitud promedio de 14,15 ± 0,92 micrómetros y un ancho promedio de 2,65 ± 0,32 micrómetros. La microscopía de fuerza atómica proporcionó una perspectiva de mayor resolución de los cambios dimensionales de las fibras asociados con el proceso de liberación por SIA.

Notablemente, las fibras antes de la liberación tenían un grosor uniforme de aproximadamente cinco nanómetros, mientras que las fibras después de la liberación presentaban un grosor del orden de varios cientos de nanómetros, al tiempo que su longitud y anchura disminuían. Mediante el proceso SIA, es posible diseñar una variedad de nanoestructuras de proteínas de la MEC con tamaño, forma y composición ajustables. Por ejemplo, nanofibras de fibronectina con una anchura inicial de 20 micrómetros y una longitud de un centímetro fueron dispuestas sobre un tubo.

Después de enfriar y extraer el cubreobjetos recubierto con PAM, se liberaron las nano fibras, formando largos hilos con un ancho reducido de aproximadamente tres micrómetros. Además, dado que el patrón está definido por la topografía superficial del sello de PDMS utilizado para la impresión por microcontacto, es posible diseñar nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular como prueba de concepto.

Se crearon estrellas multi-brazo de fibroína. La liberación térmica provocó la contracción de los brazos, pero no de la región central de la estrella donde se unen los brazos. La AIE también funciona con otras proteínas de la matriz extracelular, como la laminina o LN, y se pueden incorporar múltiples proteínas de la matriz extracelular en la misma estructura.

En este ejemplo, líneas ortogonales interconectadas de 20 micrómetros de ancho de fibronectina mostradas en rojo y líneas de 50 micrómetros de ancho de laminina mostradas en verde integradas en una nanoestructura 2D se configuraron y luego se liberaron; tras la liberación, ambos tipos de nanofibras se contrajeron, pero se mantuvo la interconectividad general y la estructura de red cuadrada. Estos resultados demuestran que la SIA puede utilizarse para diseñar materiales de matriz extracelular con una variedad de composiciones y estructuras. Por último, se muestran algunos casos de fallos en la SIA de nanofibras de matriz extracelular.

Una causa es la liberación inadecuada de un patrón incompleto debido a una mala transferencia de la proteína de la matriz extracelular a la superficie de piam. Durante la impresión por microcontacto, la presencia de agujeros, bordes irregulares y otros defectos generará nanofibras y nanoestructuras incompletas y propensas a romperse y fragmentarse tras la liberación. La disolución rápida del pipe PAM también puede provocar una baja fidelidad del patrón después de la liberación.

Por ejemplo, utilizando agua a 20 grados Celsius, una temperatura ya inferior a la temperatura crítica inferior de solución, provocará que el piam se hinche y disuelva rápidamente. Esto puede hacer que las nano fibras retrocedan bruscamente y se rompan, como se ilustra en la imagen 32, y formen configuraciones aleatorias y desorganizadas, como se muestra en la imagen 52.

Antes de comenzar este procedimiento, revise el estado de los tallos de PDMS en busca de defectos y asegúrese de que todas las superficies estén libres de polvo. De lo contrario, se impedirá la transferencia adecuada de proteínas y se producirá un ensamblaje deficiente de las estructuras de CM-A. Tras seguir este procedimiento, las nanoestructuras o nanofibras liberadas pueden utilizarse para realizar diversas tareas, como analizar las propiedades mecánicas de las fibras proteicas o emplearse como andamios para la ingeniería de tejidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar nanofibras y nanoestructuras de proteínas de la matriz extracelular con composición, geometría y arquitectura ajustables. En particular, comprenderá cómo imprimir mediante microcontacto patrones de proteínas de la matriz extracelular sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con pirex, y luego inducir térmicamente la disolución de la superficie para ensamblar las estructuras de la matriz extracelular.