Name: De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprende técnicas proteómicas de abajo hacia arriba para identificar proteínas de membrana y solubles en el epitelio sensorial coclear de ratón. Este método maximiza la cobertura del proteoma usando espectrometría de masas de alta resolución.

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Los autores agradecen al Dr. Kent Seeley, Director del Centro para el Descubrimiento de Medicamentos e Innovación (CDDI) Facilidad de Proteómica de la Universidad del Sur de Florida para el uso de este servicio. Este trabajo fue apoyado por la beca NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS

Declaración de Ética Los experimentos con tejido de ratones fueron aprobados por la Universidad del Sur de Florida Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Protocolos 3931R, 3482R) como se establece en virtud de las directrices de los Institutos Nacionales de Salud. 1. Extracción de proteínas <ol><li> Aislar epitelio sensorial coclear de 16 a 30 días de edad (P30) CBA / J ratones y almacenar a -80 ° C. </li><li> En el día del experimento, lavar el tejido con 500 l de 1x tampón fosfato salino (PBS). Se centrifuga durante 3 minutos a 1.000 xg, y eliminar el sobrenadante. Repita la operación para un total de tres lavados. </li><li> Tejido Someter a ultrasonidos durante 30 segundos en hielo en 100 l de tampón de lisis que contiene 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 120 mM, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 500 mg / ml de AEBSF, 10 mg / ml de leupeptina, 100 g / ml de pepstatina, 2 mg / ml de aprotinina, y 0,5 mg / ml utilizando un microcistina Dismembrator sónica (Modelo 100; Thermo Fisher). Lisado Enfriar en hielodurante 1 min entre cada sonicación. Sonicar un total de 3 veces. </li><li> Centrifugar la solución a 750 xga 4 ° C durante 2 min y separar el sobrenadante a un nuevo microtubo. Extraer el precipitado en 50 l de tampón de lisis por sonicación durante 30 segundos en hielo. Centrifugar la solución a 750 xga 4 º C durante 2 min. Combinar ambos lisados ​​y centrifugar a 28.600 xga 4 º C durante 60 min. Eliminar el sobrenadante a un nuevo microtubo y añadir tampón de lisis 20 l que contiene 0,1% de ASB-14 al sedimento. Vortex durante 1 min y se incuba durante 60 min a 4 ° C. </li><li> Calentar la muestra a 95 ° C durante 5 min, luego se enfría a 4 ° C durante 60 min. Siga con centrifugación a 16.000 xg a 25 º C durante 10 min. Se recoge el sobrenadante y transferir a un tubo nuevo. </li><li> Centrifugar la suspensión a 16.000 xg a 4 ° C durante 5 min y retener el sobrenadante para la digestión. </li></ol> 2. Doble digestión de la proteína trípticos de Todo el lisado Usando FASP <ol><li> Añadir un 30 μl alícuota (≤ 400 g) de extracto de proteína coclear, que contiene 4% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 100 mM de Tris-HCl, pH 7,6 y 0,1 M de ditiotreitol (DTT) directamente a un filtro giratorio 30K y mezclar con 200 l de 8 M de urea en Tris-HCl. Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Diluir el concentrado con 200 l de solución de urea 8 M y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Añadir 10 l de 10x yodoacetamida (IAA) en solución 8 M de urea al concentrado en el filtro y agitar durante 1 min. Incubar el filtro de centrifugado durante 20 min a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad, seguido por centrifugación a 14.000 xg durante 10 min. </li><li> Añadir 100 l de solución 8 M de urea al concentrado en la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de bicarbonato de amonio 50 mM de solución (ABC) a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x. </li><li> Añadir 0,4 g / l de tripsina en 1:100 (w / w) de la enzima a--Ratio proteína y se incuba durante la noche (O / N) a 37 ° C. </li><li> Después de la incubación, añadir 40 l de 50 mM de solución de ABC para filtrar unidad y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl para el filtro giratorio y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo fresco y acidificar con ácido fórmico (FA) al 1,0% para detener la digestión. </li><li> Lavar la unidad de filtro con 40 l de 8 M de urea, y luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua. </li><li> Lave el filtro de la unidad 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final añadir 0,4 g / l de tripsina en 1:100 (w / w) Relación de enzima a proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos de la segunda digerir mediante la adición de 40 l de solución mM ABC 50 a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución de NaCl 0,5 M a launidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo nuevo y se acidifica con FA a 1,0%. </li><li> Las muestras se pueden cuantificar utilizando el ensayo colorimétrico de microplacas utilizando BSA como estándar. </li></ol> 3. Endoproteinasa LysC y tríptica Proteína La digestión de Whole lisado Usando FASP <ol><li> Añadir una alícuota de 30 l (≤ 400 g) de extracto de proteína coclear que contiene 4% de SDS, Tris-HCl 100, pH 7,6 y 0,1 M DTT directamente a un filtro giratorio 30K y mezclar con 200 l de urea 8 M en Tris-HCl . Se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Diluir el concentrado con 200 l de solución de urea 8 M y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. </li><li> Añadir 10 l de 10x IAA en solución 8 M de urea al concentrado en el filtro y agitar durante 1 min. Incubar el filtro de centrifugado durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y luego se centrifuga a 14000 × g durante 10 min. </li><li> Añadir 100 l de sol 8 M urealución al concentrado en la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de 100 mM de solución de ABC a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x. </li><li> Añadir 0,1 g / l de endoproteinasa LysC en un 01:50 (w / w) Relación de enzima a proteína y se incuban O / N a 30 ° C. </li><li> Después de la incubación, añadir 40 l de 100 mM de solución de ABC a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl para el filtro giratorio y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos lysC a un microtubo fresco y acidificar con FA a 1,0% para detener la digestión. </li><li> Lavar la unidad de filtro con 40 l de 8 M de urea, y luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua. </li><li> Lave el filtro de la unidad 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final, se añadirán 0,4 g / l de tripsina 1:100 en-enzima-a Prorelación de proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos mediante la adición de 40 l de solución mM ABC 50 a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a la unidad de filtro y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos a un microtubo nuevo y se acidifica con 1,0% FA. </li><li> La muestra puede ser cuantificada usando el ensayo colorimétrico de microplacas con BSA como estándar. </li></ol> 4. Péptidos desalado el uso de columnas de Spin <ol><li> Activar una columna C 18 MacroSpin mediante la adición de 500 l de acetonitrilo (ACN) y se centrifuga a 1100 xg durante 1 min. Deseche el flujo continuo después de la centrifugación. </li><li> Equilibrar la columna con 500 l de 0,1% FA y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Deseche el filtrado y repita este paso 1x. </li><li> Agregue hasta 500 l de péptido digerir a la de una columnad centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Si el volumen de la muestra es superior a 500 l continuación, repita este paso. </li><li> Lavar la columna con 500 l de 0,1% FA y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Deseche el flujo directo. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 250 l de una relación de 90:10 a-ACN-a agua a la columna y centrifugar a 1100 xg durante 1 min. Recoger el eluyente que contiene los péptidos desalado y traslado a un microtubo fresco. Repita este paso 1x. </li><li> Secar la muestra de péptido desalado en una centrífuga de vacío y evitar que la muestra se seque por completo. </li></ol> 5. Cromatografía de intercambio iónico <ol><li> Inyectar 50-100 g de muestra de proteína digerida en un 200 x 2,1 mm, columna SCX m 5 (Polysulfoethyl A) para separar los péptidos. </li><li> Utilice un gradiente de 2-40% de B durante 50 min con una velocidad de flujo de 250 l / min. El disolvente A es formiato de amonio 5 mM, pH 3,0 en 25% de acetonitrilo y 75% ddH 2 O. Disolvente B es formiato de amonio 500 mM, pH6,0 en el 25% y el 75% ACN ddH 2 O. </li><li> Monitorear las fracciones de péptidos a 280 nm y recoger las fracciones en intervalos de 2 min utilizando un colector de fracciones. </li><li> Fracciones secas en un concentrador de vacío y resuspender en 500 l de acetonitrilo al 50% en ddH2O contiene 5% de FA para ayudar en la extracción de sal. </li><li> Fracciones resecar y almacenarlos a -80 ° C hasta su utilización para el análisis LC-MS/MS nano. </li></ol> 6. Precipitación con acetona Antes de la separación GELFrEE el sobrenadante proteína coclear tiene que ser desalada. Precipitación con acetona se puede utilizar para desalar y concentrar las proteínas. <ol><li> Añadir tres volúmenes de acetona helada al sobrenadante coclear. Agite suavemente y se incuba a 20 ° CO / N. </li><li> Centrifugar la mezcla de la muestra a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. </li><li> Lavar el 3x proteína de pellets con acetona fría y se centrifuga a 14.000 xg durante 5 min a 4° C. </li><li> Aire secar el pellet y se disuelven en 112 l de 18 MΩ agua. </li><li> Determinar la concentración de proteína usando el ensayo colorimétrico de microplacas. </li></ol> 7. GELFrEE Fraccionamiento de coclear sensorial Epitelio <ol><li> Añadir 30 l de 5x tampón de muestra (0,25 M de Tris-HCl, pH 6,8, 10% (w / v) SDS, 50% de glicerol, 0,5% (w / v) de azul de bromofenol) a la proteína desalada en suspensión en 112 l de 18 MΩ agua. </li><li> Añadir 8 l de DTT 1 M y se calienta a 95 ° C durante 5 minutos para reducir los enlaces disulfuro de la proteína. Después de calentar permitir enfriar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 8 ml de tampón de depósito de ánodo, 150 l de tampón de probar la cámara de recolección, y 6 ml de tampón de depósito de cátodo. </li><li> Retire cualquier búfer que puede haber fluido en la cámara de muestra de carga utilizando una pipeta. </li><li> Carga 150 l (≤ 1 mg) de la mezcla de proteínas coclear, en la cámara de muestra de carga utilizando un 8% Tres-acetato de cartucho con un intervalo de masa de 3,5 a 150 kDa. </li><li> Electrodos más bajas y la tapa del instrumento para iniciar la carrera. </li><li> En el primer tiempo de pausa en el instrumento añadir 2 ml de tampón al depósito catódico y reanudar plazo. </li><li> En cada intervalo de pausa en el instrumento, recoger la muestra de la cámara de recolección de la muestra con una pipeta y añadir a un microtubo recién etiquetados. Lávese las 2x cámara colección con 150 l de tampón y deseche. </li><li> Añadir 150 l de tampón dulce corriente a la cámara de recogida de muestras y reanudar la ejecución. Reunir las fracciones de proteína durante un periodo de tiempo de 2,6 horas en un volumen total de 150 l / fracción. </li></ol> 8. Gel Electroforesis 1D de GELFrEE fracciones Electroforesis en gel de 1D puede utilizarse para visualizar los resultados de GELFrEE fraccionamiento antes de la digestión enzimática y el análisis de MS. Fracciones de proteína GELFrEE se pueden separar en un gel de Tris-HCl 4-15%. </p&gt; <ol><li> Mezcle una alícuota de 5 l de cada fracción GELFrEE con 5 l de muestra de tampón de dilución (DTT 350 mM en tampón de muestra). </li><li> Calentar las muestras a 95 ° C durante 3 min. </li><li> Muestras de enfriar a ta. </li><li> De carga 10 l de cada fracción GELFrEE en carriles de gel individuales y de carga 5 l de estándar de peso molecular en el último carril no utilizado. </li><li> Correr el gel a 125 V durante 1,5 horas o hasta que el frente del colorante llega a la parte inferior del gel. </li><li> Retire con cuidado el gel y teñir con Silver Stain Plus para visualizar la separación de proteínas. </li></ol> 9. Proteína La digestión de las fracciones GELFrEE Uso FASP Un procedimiento FASP modificado se utiliza para la eliminación del detergente y la digestión de las fracciones GELFrEE. <ol><li> Añadir cada fracción individual directamente a una unidad de filtro de 30K; mezclar con 200 l de urea 8 M en Tris-HCl y se centrifuga a 14.000 xg durante 25 min. </li><li> Diluir el concentrado con 200 l de solución de ureay se centrifuga a 14.000 xg durante 12 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 10 l de 10x IAA en solución de urea al concentrado en cada unidad de filtro, de vórtice durante 1 min, y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad. </li><li> Añadir 100 l de solución de urea al concentrado en las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 15 min. Repita este paso 2x. Añadir 100 l de 100 mM de solución de ABC para las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 2x. </li><li> Añadir 0,1 g / l de LysC para un 1:50 (W / W) Relación de enzima a la proteína a las unidades de filtro y se incuba O / N a 30 º C. </li><li> Después de la incubación, añadir 40 l de 100 mM de solución de ABC para los filtros de spin y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a los filtros de spin y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos LysC de cada filtro de selección para un microtubo nuevo y se acidifica con trifluoroacácido etic (TFA). </li><li> Lavar los filtros de spin con 40 l de urea 8 M, luego se lava 2 veces con 40 l 18 MΩ agua. </li><li> Lavar los filtros de spin 3 veces con 100 l de 50 mM solución ABC. Después del lavado final añadir 0,4 g / l de tripsina en un 1:100 (w / w) Relación de enzima a proteína e incubar O / N a 37 ° C. </li><li> Eluir péptidos trípticos de cada unidad de filtro mediante la adición de 40 l de 50 mM de solución de ABC y se centrifuga a 14.000 xg durante 10 min. Repita este paso 1x. </li><li> Añadir 50 l de solución 0,5 M de NaCl a las unidades de filtro y centrifugar a 14.000 xg durante 10 min. Transferir el filtrado que contiene los péptidos trípticos de cada unidad de filtro a un microtubo fresco y acidificar con TFA. </li><li> Seque todas las digestiones en un concentrador de vacío. </li></ol> 10. Preparación de muestras para LC-MS/MS <ol><li> LysC Reconstituir seca y péptido tríptico digiere fracciones en 20 l de 0,1% FA y agitar. </li><li> Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 10min y retirar el 95% superior de la muestra a un nuevo vial de muestra. </li><li> Inyectar 5 l de cada fracción de péptido en una trampa 100 micras muestra x 25 mm para eliminar las sales y contaminantes y realizar la separación cromatográfica en una columna de 75 m 18 × 10 cm C. </li><li> Utilice un gradiente de 2-40% de B durante 100 min con una velocidad de flujo de 200 nl / min. El disolvente A es 95% ddH2O y acetonitrilo 5% que contiene 0,1% FA. Disolvente B es 80% de ACN y 20% ddH2O que contiene 0,1% FA. </li><li> Recoge diez espectros de masas en tándem para cada MS escanear en un espectrómetro de masas de alta resolución. Un espectrómetro de masas LTQ Orbitrap se utilizó en este experimento. </li></ol> 11. Identificación de proteínas <ol><li> Identificar las proteínas utilizando la base de datos del ratón UniProt contiene tanto avance y retroceso secuencias de proteínas y contaminantes comunes. Software MaxQuant con motor de búsqueda MASCOTA se utiliza para buscar en la base de datos de proteínas. </li><li> Los parámetros de búsqueda que se pueden utilizar incluyen; MODIFIC fijoación de Carbamidomethyl de cisteína, modificaciones variables de la oxidación de la metionina, la proteína acetilación N-terminal, máximo de 2 perdió la escisión. El péptido de longitud mínima para considerar para su identificación son 6 aminoácidos. Introduzca un error de concentración de masa de péptido ± 8 ppm y una tolerancia de masa fragmento de 1,2 Da (error de masa depende de la espectrómetro de masas que se utiliza). </li><li> En el software MaxQuant, use un falso descubrimiento tasa del 1% (FDR) para la identificación de péptidos y proteínas. Identificación de proteínas está en la lista con el número de péptidos emparejados, la cobertura de secuencia por ciento de proteína, y las secuencias de péptidos. </li></ol>

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

<html> Los pasos clave para maximizar la identificación de proteínas a partir del epitelio sensorial coclear son: 1) el uso de múltiples endoproteinasas para la digestión, 2) uso de múltiples técnicas de separación, y 3) la utilización de un espectrómetro de masas de alta resolución. La aplicación de múltiples enzimas aumenta el número de péptidos y mejora la cobertura de secuencia de la proteína, por lo tanto, mejorar el número de proteínas identificadas a partir del tejido coclear. Tripsina, la proteasa más utilizado p...

La proteómica es el estudio de sistemas biológicos complejos mediante el análisis de la expresión de proteínas, la función, las modificaciones y las interacciones 1. Varios métodos han sido utilizados para el análisis del proteoma del oído interno, incluyendo el anticuerpo de microarrays 2, electroforesis bidimensional en gel de 3-5, y DIGE 6. Sin embargo, sólo un número limitado de proteínas se han identificado y caracterizado 2,7-10, en comparación con los más de 10.000 genes y las etiquetas de secuencias expresadas (EST) identificados en el oído interno 11,12, MS es la técnica más utilizada integral y en proteómica para la caracterización de proteínas. Análisis de muestras proteómicos complejas, tales como la cóclea, puede ser un reto. Sin embargo, la combinación de múltiples técnicas de separación con MS permite la identificación de un mayor número de péptidos y proteínas, debido a un mayor rango dinámico y la capacidad de concentración pico 13. Cro MultidimensionalPHY reduce mezclas de proteínas altamente complejas, al permitir el uso de diferentes mecanismos de adsorción. Hay dos enfoques de análisis MS proteoma de uso común, la escopeta y la proteómica de abajo hacia arriba. En proteómica escopeta, una mezcla de proteínas intactas se digiere enzimáticamente y se separó mediante cromatografía multidimensional con fuerte cromatografía de intercambio catiónico (SCX), seguido de cromatografía líquida en fase inversa (RPLC) 14,15. Los péptidos separados son sometidas a tándem MS y base de datos de búsqueda 15. Una ventaja principal de esta técnica es que miles de proteínas pueden ser identificadas en un solo análisis y la técnica es más adecuada para las proteínas de membrana. En el enfoque de abajo arriba, la mezcla de proteínas se separa, por lo general por una o electroforesis de dos dimensiones, y las bandas de proteínas individuales o puntos cortado y digerido con una enzima tal como tripsina, por lo general resulta en múltiples péptidos. Sin embargo, otra más recientely desarrolló enfoque electroforética, utilizado en la proteómica de abajo hacia arriba, es GELFrEE. Esta técnica fracciona muestras de proteínas en fase líquida y los hace menos complejo antes del análisis. Esta técnica es reproducible, ofrece una alta recuperación de proteína, y reduce la distribución de las proteínas abundantes altas en las muestras de proteínas complejas 16. Péptidos derivados de proteínas separadas, se analizan por EM, mediante el uso de huellas másicas de péptidos o MS en tándem (MS / MS), para crear etiquetas de secuencia para la búsqueda de base de datos 17-19. Algunas de las principales ventajas de utilizar el enfoque de abajo hacia arriba son la capacidad de obtener separaciones de alta resolución y cobertura de la proteína completa. Proteómica abajo hacia arriba es la técnica más utilizada en proteómica 20, por lo tanto, varias herramientas bioinformáticas disponibles. Además, las proteínas se pueden separar en una mezcla compleja antes de la digestión, por lo que hay una mayor probabilidad de identificación. Uno de los principales retosen el uso de el oído interno para el análisis proteómico es su pequeño tamaño, accesibilidad restringida, y el tipo de células diversidad 21. Además, las proteínas clave que distinguen su funcionalidad, tales como los canales iónicos, transportadores y receptores, son proteínas de membrana, que pueden ser difíciles de aislar 22. Por lo tanto, la preparación de muestras de filtro asistido (FASP) es ventajoso para los análisis proteómicos de tejidos que están limitados para la extracción de la proteína y que requieren detergentes para solubilizar las membranas 23. Este filtrado permite el análisis de MS de membrana y proteínas solubles y para la capacidad de aislar péptidos a partir de los contaminantes de bajo peso molecular 23,24. El presente protocolo describe enfoques proteómicos comúnmente utilizados que se combinan y modificar para analizar proteínas tanto solubles y de membrana y para maximizar el número de ID de la proteína a partir del epitelio sensorial coclear. Vamos a describir el uso de la proteómica escopeta con FASP múltiples digeririónico, cromatografía de intercambio iónico, MS de alta resolución, y el análisis de datos. Además, vamos a describir la proteómica de abajo hacia arriba con GELFrEE, FASP multi-digestión, MS de alta resolución, y el análisis de datos.

<table><tbody><tr><td>Cartucho de trisacetato al 8%&nbsp;</td><td>Descubrimiento de proteínas</td><td>42103</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Honeywell</td><td>015-1L</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>Calbiochem</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>Formiato de amonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC16861</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Calbiochem</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>ASB-14&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>182750-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>BioRad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>C18 columna&nbsp;</td><td>Nuevo objetivo</td><td>A25112</td><td>75 &mu; m x 10 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas DC</td><td>BioRad</td><td>500-0116 Protocolo de</td><td>ensayo de microplacas</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Endoproteinasa Lys-C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3428</td><td></td></tr><tr><td>FASP Kit de digestión de proteínas</td><td>Protein Discovery</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico&nbsp;</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>GELFrEE Sistema de fraccionamiento</td><td>Protein Discovery</td><td>42001</td><td>GELFrEE 8100</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Calbiochem</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Columna MacroSpin</td><td>The Nest Group</td><td>SMM SS18V</td><td>Sílice C18</td></tr><tr><td>Microcistina</td><td>Calbiochem 475815</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Columna de polisulfoetilo A</td><td>El grupo nido</td><td>202SE0503</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Desmembrador sónico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-338-53</td><td>Modelo 100</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6567</td><td>Grado proteómico</td></tr></tbody></table>

de abajo hacia arriba y de escopeta proteómica para identificar una exhaustiva coclear proteoma

Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

La proteómica es un enfoque de uso común que puede proporcionar conocimientos sobre los sistemas biológicos complejos. El epitelio sensorial coclear contiene receptores que transducen la energía mecánica del sonido en una energía electro-química procesada por los sistemas nerviosos periférico y central. Varias técnicas de proteómica se han desarrollado para estudiar el oído interno coclear, tales como la electroforesis bidimensional en gel de diferencia (2D-DIGE), microarrays de anticuerpos, y espectrometría de masas (MS). MS es la herramienta más completa y versátil en proteómica y en conjunto con los métodos de separación puede proporcionar un proteoma en profundidad de las muestras biológicas. Métodos de separación combinadas con EM tiene la capacidad de enriquecer las muestras de proteínas, detección de bajo peso molecular y proteínas hidrofóbicas, y identificar las proteínas de baja abundancia mediante la reducción de la gama dinámica proteoma. Diferentes estrategias de digestión se pueden aplicar a toda lisado o a proteínas de lisado fraccionado para mejorar péptido y proteínascobertura de secuencia. La utilización de diferentes técnicas de separación, incluyendo intercambio catiónico fuerte (SCX), de fase inversa (RP), y la electroforesis en gel de fracción de atrapamiento de líquido-se eluyó (GELFrEE) se puede aplicar para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis de MS para la identificación de proteínas.

Para obtener el proteoma más completa del epitelio sensorial coclear, se requiere la disección de tejidos rápida antes de la extracción de proteínas y preparación de la muestra. Dos técnicas de proteómica se pueden utilizar, de escopeta y de abajo hacia arriba la proteómica. Para preparar las muestras para la proteómica de escopeta, se utilizó procedimiento de digestión FASP como se ilustra en la Figura 1. El método permite FASP para la concentración de proteínas, la eliminación de los detergentes, y la...

Análisis del proteoma del epitelio sensorial coclear puede ser un reto debido a su pequeño tamaño y porque las proteínas de membrana son difíciles de aislar e identificar. Tanto la membrana y proteínas solubles se pueden identificar mediante la combinación de múltiples métodos de preparación y técnicas de separación junto con espectrometría de masas de alta resolución.

De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener el mayor número de identificaciones de proteínas a partir del epitelio sensorial coclear mediante diversas técnicas proteómicas. Para ello, se aísla el epitelio sensorial coclear de ratones adultos y se sonicar en tampón de lisis para obtener proteínas en un segundo paso. Se aplican diferentes estrategias de digestión al lisado completo o al lisado proteico fraccionado con el fin de aumentar la cobertura de secuencias peptídicas y proteicas.A continuación se utilizan diferentes técnicas de separación, incluyendo intercambio catiónico fuerte y cromatografía de fase reversa, para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis por espectrometría de masas. Los resultados muestran la identificación de un gran número de proteínas solubles y de membrana del epitelio sensorial de la cóclea de ratón mediante el uso de múltiples enfoques de proteómica y un espectrómetro de masas de alta resolución. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como microarreglos de anticuerpos y electroforesis en gel bidimensional es que se identifica un gran número de proteínas solubles y de membrana, aumentando as

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los cilios primarios influyen en varias vías de señalización. La cóclea de mamíferos es ideal para examinar la señalización de la polaridad de las células planas (PCP). La disfunción de los cilios afecta el crecimiento coclear, el patrón celular y la orientación de las células ciliadas, lecturas de PCP. Nuestro objetivo es analizar la señalización de PCP en la cóclea de ratón mediante análisis fenotípico, inmunohistoquímica y microscopía electrónica de barrido.

Evaluación de planar-Cell-polaridad fenotipos en ciliopatía ratón mutante cóclea

La identificación de moléculas y vías que controlan la plasticidad sináptica y la memoria sigue siendo un desafío importante en la neurociencia. Aquí, se describe un flujo de trabajo que aborda la cuantificación relativa de las proteínas sinápticas supuestamente involucradas en la reorganización molecular de las sinapsis durante el aprendizaje y la consolidación de la memoria en un paradigma de aprendizaje auditivo.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Se describe un protocolo detallado para la separación, identificación y caracterización de proteoforms en muestras de proteínas utilizando la zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS). El protocolo puede utilizarse para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma.

Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Este artículo presenta un método de preparación de superficie coclear modificado que requiere descalcificación y uso de un adhesivo celular y tisular para adherir las piezas de epitelía coclear a 10 mm de resbalones de cubierta redonda para inmunohistoquímica en cocleares de ratón adultos.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Se proporciona un protocolo detallado y tres scripts de Python para operar un sistema robótico de manejo de líquidos de código abierto para realizar la preparación semiautomatizada de muestras de proteínas para experimentos de espectrometría de masas, que cubren la eliminación de detergentes, la digestión de proteínas y los pasos de desalinización de péptidos.

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Aquí describimos una caracterización proteómica basada en espectrometría de masas de linajes celulares con destinos tisulares conocidos en el embrión vertebrado de Xenopus laevis .

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Hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas durante el desarrollo. Encontramos que las células madre hematopoyéticas (HSC), son generados y ampliado en la placenta en el único nichos microambientales. A continuación, describimos las técnicas experimentales necesarias para el aislamiento y la visualización de la CMH en la placenta del ratón.

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Aprende técnicas proteómicas de abajo hacia arriba para identificar proteínas de membrana y solubles en el epitelio sensorial coclear de ratón. Este método maximiza la cobertura del proteoma usando espectrometría de masas de alta resolución.

De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

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