De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

El objetivo general del siguiente experimento es lograr el mayor número de identificaciones de proteínas del epitelio sensorial coclear utilizando diversas técnicas proteómicas. Esto se logra aislando la cóclea, el epitelio sensorial de ratones adultos y sonicato en tampón de lisis para obtener proteínas como segundo paso. Se aplican diferentes estrategias de digestión al lisado completo o al lisado de proteínas fraccionadas con el fin de mejorar la cobertura de péptidos y secuencias de proteínas.

A continuación, se utilizan diferentes técnicas de separación, como el intercambio catiónico fuerte y la cromatografía de fase inversa para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis de espectrometría de masas. Los resultados muestran la identificación de un gran número de proteínas solubles y de membrana para el epitelio sensorial de la cóclea de ratón mediante el uso de múltiples enfoques proteómicos y un espectrómetro de masas de alta resolución. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el microarray de anticuerpos y la electroforesis en gel bidimensional, es que se identifica un gran número de proteínas solubles y de membrana, lo que aumenta los datos del proteoma coclear.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los biomarcadores relacionados con las deficiencias auditivas y lagrimales, también se puede aplicar a otros sistemas, como la identificación de biomarcadores relacionados con la edad y el cáncer de mama o pulmón. Este método también se puede aplicar al estudio de otras muestras biológicas como la sangre. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos el limitado conjunto de datos proteómicos disponibles en el oído interno de los mamíferos y, en particular, el número limitado de proteínas de membrana que se habían identificado antes de comenzar este procedimiento.

Aísle el epitelio sensorial coclear del día postnatal en ratones del día 30. Después de lavar el tejido con un tampón de fosfato, agregue 100 microlitros de tampón de lisis al tejido y sonique la mezcla durante 30 segundos en hielo usando un desmembrador sónico. Enfríe el lisado en hielo durante un minuto entre cada sonicación y, a continuación, sonique la muestra un total de tres veces.

Centra fusionó la suspensión a 16.000 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Al terminar, conserve el sobrenadante para la digestión. A continuación, añada una alícuota de 30 microlitros de extracto de proteína coclear directamente a un filtro de centrifugado de 30 K y mezcle con 200 microlitros de urea de ocho molares en la centrífuga Riss HCL.

La mezcla a 14.000 veces G durante 15 minutos. Al terminar, diluir el concentrado con 200 microlitros de solución de urea de ocho molares y repetir la centrifugación en las mismas condiciones que antes. A continuación, agregue 10 microlitros de 10 XI oto acetamida y 90 microlitros de solución de urea de ocho molares al concentrado en el filtro y vórtice durante un minuto.

Después de colocar el filtro de centrifugación en una rejilla de microcentrífuga, incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad después de la centrifugación a 14.000 veces G durante 10 minutos a 0,1 microgramos por microlitro de endoproteasa y C en una proporción de enzima a proteína de uno a 50, e incubar la mezcla durante la noche a 30 grados centígrados. Al terminar, agregue 40 microlitros de solución de bicarbonato de amonio 100 milimolares a la unidad de filtro y centrifugue la mezcla a 14.000 veces G durante 10 minutos Después de repetir el paso anterior, lave la unidad de filtro con 40 microlitros de urea de ocho molares. A continuación, lave la unidad de filtro dos veces con 40 microlitros de agua mili Q.

Una vez que la unidad de filtro se haya lavado tres veces con 100 microlitros de solución de bicarbonato de amonio de 50 milimolares, agregue 0,4 microgramos por microlitro de tripsina en una proporción de una enzima a proteína de 1 a 100, e incube la mezcla durante la noche a 37 grados centígrados. Después de la incubación, eluir los péptidos trípticos añadiendo 40 microlitros de solución de bicarbonato amónico de 50 milimolares a la unidad de filtro y centrifugar la mezcla a 14.000 veces G durante 10 minutos. A continuación, repita este paso una vez más.

En este punto, inyecte de 50 a 100 microgramos de muestra de proteína digerida en una columna de intercambio catiónico de 200 por 2,1 milímetros y cinco micrómetros Para separar los péptidos, controle las fracciones peptídicas a 280 nanómetros y recoja las fracciones en intervalos de dos minutos. Usando un colector de fracciones, luego seque las fracciones en un concentrador de vacío. Cuando termine, almacene las fracciones secas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para usar en cromatografía líquida.

Análisis de espectrometría de masas en tándem. En otro enfoque, se utilizó el fraccionamiento sin gel para separar la mezcla de proteínas. Una vez que el sobrenadante de proteína coclear se haya desalado por precipitación de acetona, agregue 30 microlitros de tampón de muestra cinco veces a la proteína desalinizada previamente suspendida en 112 microlitros de agua Milli Q.

A continuación, añade ocho microlitros de un molar de DTT y calienta la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos para reducir los enlaces disulfuro de proteínas. Después de calentar, deje que la mezcla se enfríe. Agregue ocho mililitros de tampón de funcionamiento al depósito de ánodo, 150 microlitros de tampón de funcionamiento a la cámara de recolección de muestras y seis mililitros de tampón de funcionamiento al depósito de cátodo.

Después de esta carga, se introducen 150 microlitros de la mezcla de proteínas cocleares en la cámara de carga de muestras, utilizando un cartucho de acetato de tris al 8% con un rango de masa de 3,5 a 150 kilodaltons. Después de comenzar la ejecución, recoja la muestra de la cámara de recolección de muestras en cada intervalo de pausa en el instrumento con una pipeta y agréguela a un microtubo recién etiquetado. A continuación, lave la cámara de recogida dos veces con 150 microlitros de tampón corriente y deséchela.

Después de la electroforesis en gel 1D de las fracciones libres de gel. Agregue cada fracción individual directamente a una unidad de filtro de 30 K. A continuación, mezcle cada fracción con 200 microlitros de urea de ocho molares en tris HCL después de la centrifugación a 14.000 veces G durante 25 minutos, añada 10 microlitros de 10 XI oto acetamida en solución de urea al concentrado en cada unidad de filtro y vórtice durante un minuto.

Después de colocar los filtros de centrifugación en una rejilla de microcentrífuga, incube las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, agregue 0,1 microgramos por microlitro de LY C para una proporción de enzima a proteína de uno a 50 a las unidades de filtro después de la incubación nocturna a 30 grados Celsius, agregue 40 microlitros de solución de bicarbonato de amonio de 100 milimolares a los filtros de centrifugación y centrifugue las muestras a 14,000 veces G durante 10 minutos después de repetir el paso anterior una vez, Lave los filtros de centrifugado tres veces con 100 microlitros de solución de bicarbonato de amonio de 50 milimolares y agregue 0,4 microgramos por microlitro de tripsina en una proporción de una enzima a proteína de 1 a 100 después del lavado final. Una vez que las muestras se hayan incubado durante la noche a 37 grados centígrados, eluir los péptidos trípticos de cada unidad de filtro agregando 40 microlitros de solución de bicarbonato de amonio de 50 milimolares y centrifugar las muestras a 14.000 veces G durante 10 minutos.

Después de repetir esto, paso una vez, analice las muestras por cromatografía líquida en espectrometría de masas en tándem. Se utilizaron dos procedimientos de doble digestión. La primera fue una digestión tríptica, seguida de una segunda digestión con tripsina, que se agruparon fraccionadas en una columna de intercambio catiónico fuerte en 18 fracciones, y se analizaron mediante cromatografía nanolíquida en espectrometría de masas en tándem.

Se identificaron un total de 1.485 proteínas con un 1%FDR al realizar una espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de una sola ejecución. Utilizando este enfoque experimental. Entre las proteínas identificadas, 324 y 258 proteínas se clasificaron en mitocondria y membrana plasmática, respectivamente.

El segundo procedimiento de doble digestión consistió en la digestión de lys C, seguida de la digestión con tripsina. Cada digestión se cargó individualmente y se separó en la columna de intercambio catiónico fuerte en 18 fracciones, y se analizó mediante cromatografía nanolíquida en espectrometría de masas en tándem. Los resultados de las digestiones de LY C y tripsina produjeron un total de 3.503 proteínas con un 1%FDR.

Además, se categorizaron 605 y 617 proteínas en mitocondria y membrana plasmática respectivamente. Este enfoque proporcionó el mayor número de identificaciones de proteínas asociadas a la membrana. Análisis duplicado del LY C y tripsina.

Las fracciones mostraron que más de 65 de las proteínas identificadas se compartían entre los experimentos. Sin embargo, también se identificaron proteínas recién identificadas en el análisis de réplicas. Los péptidos y proteínas adicionales se identificaron debido a pequeños cambios en la cromatografía, lo que dio lugar a diferentes péptidos para la fragmentación.

Se preparó un gel de tinte de plata para visualizar los resultados del fraccionamiento sin gel como se ilustra. Aquí, el gel mostró la separación de proteínas al aumentar el peso molecular para cada fracción consecutiva. Por lo tanto, las 12 fracciones líquidas libres de gel se digirieron utilizando dos enfoques de digestión multifacéticos diferentes y se analizaron mediante cromatografía líquida por espectrometría de masas en tándem.

El primer abordaje de la digestión se realizó mediante una digestión doble de tripsina, lo que llevó a la identificación de 2.165 proteínas con un 1%FDR al realizar una espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de una sola corrida. En este experimento, se categorizaron 516 y 399 proteínas en mitocondria y membrana plasmática respectivamente. El segundo abordaje de digestión se realizó utilizando endoproteinasa C seguido de digestión con tripsina, cromatografía líquida de una sola tirada.

análisis de espectrometría de masas en tándem identificó 2.211 proteínas con un 1%FDR. Este enfoque mostró un número similar de proteínas asociadas a la membrana que cuando se utiliza el enfoque de tripsina tripsina, los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en el Proteome Exchange Consortium con el identificador del conjunto de datos PXD 0 0 0 2 3 1. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar la contaminación en cada paso y mantener el tejido en hielo al realizar la extracción de proteínas para evitar la degradación de las proteínas.