Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante C. elegans Embriogénesis

El objetivo general del siguiente experimento es observar la división de células dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis de C elegance. Con el fin de estudiar los genes que controlan la división celular, esto se logra mediante la creación u obtención de una cepa de C. elgan que expresa de manera estable marcadores transgénicos que etiquetan las células de interés. Como segundo paso, derribar selectivamente un gen de interés alimentando a la larva D-S-R-N-A con L cuatro durante 24 a 48 horas.

Los embriones de ARNA se recolectan de hermafroditas gráficos y se transfieren a una almohadilla aros para obtener imágenes en vivo. A continuación, mediante microscopía de campo amplio o confocal, se obtienen imágenes de los embriones para visualizar los fenotipos de división celular. Los resultados mostrarán cómo se dividen los neuroblastos durante la embriogénesis de la elgina marina y el papel de los genes necesarios para su división.

Este método puede ayudar a revelar preguntas clave en el campo de la biología celular y del desarrollo. Por ejemplo, este método podría revelar genes y mecanismos que están involucrados en la regulación de la mitosis durante el desarrollo de tejidos, la comunicación celular, la migración celular o la polaridad celular. Utilizar gusanos transgénicos que expresen los marcadores apropiados mantenidos en placas de control o RNAI durante 24 a 48 horas.

Escoja de cuatro a seis adultos graves y transfiéralos a 20 a 30 microlitros de tampón M nine en un portaobjetos de depresión Para liberar los embriones, use un bisturí estéril, corte los gusanos a ambos lados de la espermateca o la vulva. A continuación, recoja los embriones utilizando un capilar extraído, que está unido a un bulbo de pipeta y es lo suficientemente ancho como para pasar los embriones. Transfiera los embriones a una almohadilla aros recién preparada con una pestaña pegada a un palillo.

Cree grupos de cinco a 10 embriones empujando los embriones uno al lado del otro. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos y agregue más tampón M nine si es necesario, luego selle el cubreobjetos con valla líquida precalentada. Utilice un microscopio epifluorescente de campo amplio que incluya filtros automatizados.

Objetivos, una cámara CCD de alta resolución y un escenario altamente motorizado. Todo controlado con software. Aunque este sistema no los tiene, el uso de LEDs y un E-M-C-C-D limitará la fototoxicidad al embrión con un aumento bajo.

Concéntrese manualmente en los embriones para obtener una imagen del neuroblasto. Aumentar el aumento y elegir embriones sometidos a intercolado dorsal o cierre ventral temprano en el microscopio de campo amplio. Elija los filtros GFP y rojo de Texas y determine los planos Z óptimos en el sistema de campo amplio.

El uso de menos Zacks y menos puntos de tiempo reducirá la fototoxicidad y también cerrará la apertura al 30% y, si es posible, la disminución de la intensidad de la luz reducirá aún más la fototoxicidad. Alternativamente, utilice un microscopio confocal de campo barrido de barrido de escaneo en vivo o de disco giratorio con software que controle los objetivos de los láseres de escaneo, una cámara E-M-C-C-D y una platina altamente motorizada. Ahora que se han optimizado los ajustes de adquisición, obtenga imágenes de los embriones en el microscopio de campo amplio.

Se recomienda filmar primero los embriones de control antes que los embriones de ARN. Con el sistema de campo barrido. Ajuste los láseres 4 88 y 5 61 de 100 milivatios al 40% de potencia con una rendija de 50 y un tiempo de exposición de 300 milisegundos.

Es importante tener en cuenta que estos ajustes serán diferentes para otros microscopios. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y, a continuación, utilice un objetivo de bajo aumento para encontrar los embriones. A continuación, cambie al objetivo de inmersión en aceite de 60 o 100 veces.

Una vez enfocado, recoja 20 pilas Z a 0,2 micras cada dos minutos durante un total de 10 minutos. Es probable que el tiempo de exposición requiera ajustes. La fototoxicidad debe tenerse en cuenta cuando se obtienen imágenes de embriones vivos mediante microscopía fluorescente cerrando la apertura, eligiendo menos Zacks o puntos de tiempo.

Disminuir el tiempo de exposición puede limitar la fototoxicidad si es posible. El uso de un microscopio confocal de campo SW o un microscopio confocal de disco giratorio puede ayudar a mejorar este problema. Determine su tiempo, puntos y planos Z de interés utilizando el software de adquisición.

Exporte las imágenes deseadas como múltiples tiffs. Abra los planos Z deseados para cada punto de tiempo y canal de interés en el software de procesamiento como Image J y cree una pila de neuroblastos que a menudo abarca solo unos pocos planos. Apile los planos Z para cada punto de tiempo y cree proyecciones de pila Z.

Repita esto para canales adicionales. Una vez que se hayan completado todas las proyecciones de Zack para los puntos de tiempo deseados, abra las proyecciones para hacer una secuencia de tiempo. Haga esto para cada canal por separado.

Para cada canal, realice ajustes en el brillo y el contraste según sea necesario. Gire las imágenes si es necesario. A continuación, seleccione una región de interés y recorte las imágenes.

Ahora haga una imagen combinada usando la función de canales combinados. Seleccionando un color diferente para cada canal. Guarde la imagen combinada como un archivo RGB para visualizar las imágenes con mayor claridad.

Utilice las imágenes TIFF de 16 bits y seleccione la función de inversión en editar para crear imágenes en escala de grises para cada canal. Para determinar el tamaño de un objeto de interés en micras, dibuje una línea y multiplique su longitud por el tamaño de los píxeles, que viene determinado por los parámetros de imagen. Ahora, haz una barra de escala que represente una proporción de la longitud calculada en micras.

En última instancia, guarde las imágenes finales como tiffs de ocho bits. Si lo desea, convierta los tiffs en películas utilizando la imagen J epidérmica. La morfogénesis de C elegance ocurre debido a una combinación de cambios en la forma de las células epidérmicas, migración y adhesión con la ayuda de neuroblastos proliferativos subyacentes.

Las células epidérmicas migran a la línea media ventral y forman una sola capa de células para estudiar la división de neuroblastos. Se obtuvieron imágenes de embriones que expresan coex de manera estable y un marcador específico de neuroblastos marcados con GFP y un marcador de membrana impulsado por la madre marcado con m cherry durante el recinto ventral con mayor aumento. Los neuroblastos se visualizaron en división, los núcleos de los neuroblastos se muestran en verde y las membranas circundantes se muestran en rojo, las imágenes de lapso de tiempo del neuroblasto en división delineadas con la sonda de membrana mCherry en un embrión de control se capturaron utilizando un microscopio de campo amplio para visualizar mejor la división del neuroblasto en los embriones de control. Cada canal se mantuvo en escala de grises y las imágenes se invirtieron utilizando embriones de control de microscopía confocal de campo barrido.

Se obtuvieron imágenes de Coex que expresan GFP de jamón uno y pH de cereza M en una región con neuroblasto en división. Los mismos embriones tratados con ARN para eliminar una expresión enferma se visualizaron mediante microscopía de campo amplio. A diferencia de los embriones de control, muchos neuroblastos se estancaron o retrocedieron durante la división y se volvieron multinucleados utilizando microscopía de campo de barrido.

También estaba claro que muchos neuroblastos se estancaban o retrocedían durante la división y se volvían multinucleados. Esta técnica también se puede utilizar para obtener imágenes de las células migratorias durante la formación de tejidos. Además, si se utilizan los Zacks para permitir una obtención de imágenes más rápidas, se puede obtener más información sobre la dinámica subcelular.

Además, con el equipo adecuado, esta técnica podría utilizarse para la activación de sondas fotosintonizables para realizar optogenética. También, se pueden aplicar técnicas de microscopía como fret o fret para estudiar proteínas, interacciones proteicas o dinámica proteica.