Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas

El objetivo general del siguiente procedimiento es examinar la capacidad de los progenitores hematopoyéticos purificados para dar lugar a células dendríticas plasmocitoides en parches de pire intestinal tras la transferencia adoptiva. Esto se logra realizando primero la transferencia hidrodinámica de genes del plásmido, que codifica el factor de crecimiento de la célula dendrítica. FLEJE tres ligandos en el parche de PI en ratones con deterioro de células dendríticas plasmocitoides.

En el segundo paso, las células progenitoras dendríticas comunes se aíslan de la médula ósea de tipo salvaje mediante separación magnética de perlas y clasificación de flujo. En el paso final, las células progenitoras se transfieren adoptivamente por inyección intravenosa a ratones con deterioro de células dendríticas plasmocitoides con parche de piras que fueron tratados mediante transferencia de genes hidrodinámica. En última instancia, la población de células dendríticas plasmocitoides plasmocitoides, derivadas de células progenitoras hematopoyéticas derivadas de células progenitoras hematopoyéticas del donante, se puede evaluar mediante citometría de flujo.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cuál es el origen del desarrollo de las células Cy Dendri plasmáticas que se localizan dentro de los parches piratas. Aunque este método puede proporcionar información sobre el origen de las células dendríticas plasmocitoides del parche de piras. También se puede aplicar para comprender cómo las células dendríticas plasmocitoides afectan a las poblaciones de linfocitos dentro de estos tejidos.

Dos días antes de la transferencia adoptiva, dilatar los vasos sanguíneos de cinco ratones receptores de receptor knockout de interferón alfa CD 45 2 positivos bajo una lámpara de calor durante cinco a 10 minutos. Luego, para cada ratón, coloque al animal en un sujetador y desinfecte la cola con etanol al 70%. A continuación, utilice una aguja de calibre 27 para inyectar cinco microgramos de plasma y recubrir tres ligandos y dos mililitros de PBS estéril en la vena de la cola de cada animal.

Para la cohorte de control, inyecte cinco microgramos de vector vacío. Después de monitorear a los ratones durante 15 a 30 minutos, devuélvalos a su alojamiento. El día del experimento, coloque el fémur y la tibia disecados de 10 ratones CD 45 1 C 57 negros positivos seis en una placa de cultivo que contenga medios completos.

A continuación, inserte una aguja de calibre 27 en un extremo de cada hueso y utilice medios completos para enjuagar la médula ósea en la placa tres veces por hueso. Asegúrese de que se están extrayendo las células de la médula ósea confirmando que el medio expulsado parece turbio. Haga una suspensión de una sola célula pipeteando suavemente los medios hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces en la placa de cultivo.

A continuación, elimine los residuos pasando las células de la médula ósea a través de un colador de células de 40 micrómetros y rompa los grumos de células aplicando suavemente el extremo de un émbolo de jeringa estéril. En el colador, gire las células, elimine los sobrenadantes y pique los glóbulos rojos en dos mililitros de tampón de lisis por cuatro a seis veces 10 a la séptima célula durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 10 mililitros de tampón de fax a las células de la médula ósea y centrifuga durante cuatro minutos a 500 veces G a temperatura ambiente.

Después de aspirar suavemente la natina, lavar el pellet en 10 mililitros de tampón de fax. A continuación, tiñe las células con un marcador de linaje hematopoyético que reconozca los anticuerpos después de la tinción y el lavado de anticuerpos. Incuba las células con microperlas magnéticas anti ratas de cabra.

Durante la incubación de microperlas, cargue una columna de LD máx. en un separador de celdas MIDI máx. y enjuague previamente la columna con dos mililitros de tampón de fax. A continuación, coloque un tubo cónico de 15 mililitros debajo de la columna y cargue hasta cinco veces 10 en la octava celda en 2,5 mililitros de búfer de fax en la columna. Lave la columna tres veces con dos mililitros de tampón de fax por lavado, recogiendo las células negativas de linaje que pasan a través de la columna al tubo de 15 mililitros.

Cuente las celdas eluidas. A continuación, después de teñir las células con los anticuerpos conjugados con fluorescencia adecuados, transfiera la muestra a un tubo de fax para clasificar los progenitores dendríticos comunes en función del perfil de marcador deseado. Recoja las celdas purificadas por fax en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de medios completos y, a continuación, al final de la ejecución del fax, registre el número absoluto de celdas ordenadas.

Después de girar, las células diluyen una vez 10 a la quinta parte de los progenitores dendríticos comunes purificados por cada 100 microlitros de volumen total de PBS estéril por ratón y aspiran las suspensiones celulares en una jeringa equipada con agujas de calibre 27. A continuación, inyecte las células progenitoras CD 45 1 positivas en la vena de la cola de cada ratón receptor receptor CD 45 2 positivo con receptor de interferón alfa knockout, como se acaba de demostrar, siete a 10 días después de la transferencia adoptiva. Retire los intestinos de los ratones progenitores inyectados con células dendríticas comunes, colocando los tejidos sobre toallas de papel empapadas en PBS.

Luego, use un par de pinzas finas y tijeras para recoger todos los parches de piras visibles a lo largo de la pared del intestino delgado. Tenga en cuenta que los parches de piras a menudo son estructuralmente distintos incluso dentro de un solo ratón, así que asegúrese de asegurarse de que todos los parches de P estén identificados y diseccionados. Lave los parches aislados de P'S tres veces en una placa de Petri que contenga PBS usando fórceps para eliminar las heces.

Luego digiere los parches de P ́S con un miligramo por mililitro, colagenasa cuatro en 10 mililitros de HBSS en un matraz de 50 mililitros con agitación vigorosa a 37 grados centígrados. Después de una hora, vierta los parches de PI digeridos en un colador de células de 40 micrómetros y use un émbolo de jeringa estéril para forzar las células en un tubo cónico de 15 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular filtrada, vuelva a suspender el pellet en seis mililitros de solución al 37% por llamada y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros.

A continuación, coloque suavemente seis mililitros de solución al 70% por llamada debajo para formar un gradiente de pasos por llamada. Ahora separe las celdas durante 20 minutos a 800 veces G a temperatura ambiente con la ruptura. A continuación, recoja la población de células mononucleares en la interfaz.

Después de peletizar las células recolectadas, lávelas dos veces en 50 mililitros de medio completo. A continuación, tíñelos con los anticuerpos adecuados para detectar el parche PYS CD 45 1 positivo. Células dendríticas plasmocitoides que derivan de los progenitores positivos para CD 41 transferidos adoptivamente.

Analice las células por citometría de flujo. Las células dendríticas plasmocitoides se pueden identificar por su fenotipo CD 11 C positivo, clec H positivo, PDCA un B positivo, dos 20 CD 11 B negativos. Finalmente, determine el número absoluto de células dendríticas plasmocitoides usando esta ecuación.

Estos diagramas de puntos indican la estrategia de compuerta para el aislamiento de progenitores dendríticos comunes. En el caso de las células de la médula ósea de ratón, como se acaba de demostrar, los progenitores dendríticos comunes comprenden aproximadamente el 0,1% del total de células de la médula ósea y aproximadamente de cuatro a seis veces 10 por la cuarta. De estas células se pueden aislar de un ratón para identificar las células dendríticas plasmocitoides del parche de PI mediante citometría de flujo.

Se utiliza una estrategia inicial de compuerta de dispersión frontal y lateral, seguida de una compuerta para las células CD 11 C positivas clec H positivas. Los ratones knockout del receptor alfa de interferón exhiben una reducción significativa en las células dendríticas plasmocitoides del parche pys en relación con los ratones de tipo salvaje. Las células progenitoras dendríticas comunes también se diferencian en células dendríticas convencionales.

A diferencia de las células dendríticas plasmocitoides, las células dendríticas convencionales CD 11 C positivas, las células dendríticas convencionales negativas se observan en cantidades similares tanto en ratones de tipo salvaje como en ratones knockout. Por lo tanto, los ratones knockout del receptor alfa de interferón brindan la oportunidad de examinar la reconstitución de las células dendríticas plasmocitoides, sin los efectos de la irradiación letal. La transferencia adoptiva de progenitores dendríticos comunes de tipo salvaje a ratones knockout del receptor alfa de interferón, como se acaba de demostrar, estimula un aumento de las células dendríticas plasmocitoides del parche de PI.

Además, el pretratamiento con la transferencia hidrodinámica de genes de tres ligandos de FL mejora aún más la expansión de las células dendríticas plasmocitoides en los parches de PI, lo que implica que los progenitores dendríticos comunes transferidos y posiblemente los progenitores positivos de FL tres responden al ligando FL tres induciendo células dendríticas plasmocitoides del parche de piro. Ambas condiciones también estimulan la producción de células dendríticas convencionales CD11 C positivas, clec H negativas, consistentes con el origen del desarrollo de las células dendríticas convencionales. Las células dendríticas plasmocitoides del parche PYS expresaron marcadores tradicionales de células dendríticas plasmocitoides, incluidos clec H, PDCA uno y B dos 20 y LAC CD 11 B.In además, el análisis de los parches PYS de ratones knockout del receptor alfa de interferón que reciben transferencia de genes hidrodinámicos tanto del ligando FL tres como de progenitores dendríticos comunes transferidos muestra que aproximadamente el 70% de las células dendríticas plasmocitoides se derivan de progenitores dendríticos comunes positivos CD 45 1 del donante.

En conjunto, estos datos demuestran que la transferencia adoptiva de progenitores dendríticos comunes induce la población de células dendríticas plasmocitoides del parche PIs en respuesta a las señales mediadas por tres ligandos FL in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar e identificar las células D plasmocitoides del parche pars.