Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

El objetivo general de este procedimiento es observar y caracterizar los movimientos del arco faríngeo en la cabeza de pez cebra en desarrollo. Esto se logra primero incrustando un embrión de pez cebra transgénico en gel anestésico acróst. El segundo paso es montar el embrión incrustado en agarosa en una gota de metilcelulosa en un portaobjetos de microscopio.

A continuación, el embrión se sella entre dos portaobjetos de microscopio con grasa para vacío. En última instancia, la microscopía confocal de lapso de tiempo se utiliza para mostrar las diferencias entre el pez cebra salvaje y mutante y los movimientos morfogenéticos de los arcos faríngeos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de imagen estática es que captura el desarrollo del arco faríngeo en tiempo real, lo que permite al investigador observar directamente los movimientos del tejido que son críticos para la morfogénesis.

Para hacer un cubreobjetos puenteado, pegue un cubreobjetos de 22 por 22 en cada extremo de un cubreobjetos de 24 por 60. Dejando el medio libre. Hacer singles para embriones de menos de un día de edad.

Dobles para embriones de uno a cuatro días de edad o triples para embriones de cinco días o más. Y para cada espécimen, use dos cubreobjetos puenteados. Ahora llene una jeringa de 10 mililitros con grasa de alto vacío.

Prepare anestésico fresco en aros líquidos al 0,2% y manténgalo en un bloque calefactor de 42 grados centígrados. Para desenmascarar manualmente los embriones transgénicos no eclosionados, se abre lentamente el Corian hasta que se libera el embrión. Ahora transfiera los embriones recubiertos a medios limpios que contengan MS 2 22 y estéticos.

Para preparar un cubreobjetos puenteado, empuje lentamente la grasa de la aspiradora fuera de la jeringa, formando un cordón suave y continuo que esté adyacente y dentro de los puentes y el borde del cubreobjetos. Extienda un círculo de 4% de metilcelulosa en el centro del puente para cubrir el deslizamiento. Cuando el embrión esté anestesiado, extráigalo en una pipeta de vidrio.

Sostenga la pipeta verticalmente para permitir que el embrión se hunda hasta el fondo del líquido de la pipeta. A continuación, mueva la pipeta a la agro solución y deje que el embrión caiga en el aros sin expulsar el líquido. Extraiga un poco de solución agrícola y el embrión en la pipeta.

A continuación, expulsar el embrión en una gota de solución de aro. Encima de la metilcelulosa. Empuje el embrión hacia abajo sobre la metilcelulosa y oriente el embrión como desee para obtener imágenes que sellen la muestra.

Coloque un deslizamiento de cubierta puenteado encima del montado mirando hacia abajo. Aplique una presión uniforme a ambos lados de los cubreobjetos intercalados hasta que los puentes hagan contacto directo y los agros dejen caer los sellos en ambos cubreobjetos. Verifica que el embrión esté correctamente orientado.

Frote un aplicador de madera a lo largo del vidrio para suavizar las grietas y los huecos en la velocidad de la grasa de la aspiradora. Limpie el exceso de grasa de los bordes. Active el microscopio confocal y cualquier dispositivo láser externo.

Encienda también el ordenador conectado al microscopio confocal y seleccione iniciar el sistema y el software de adquisición de imágenes confocal. A continuación, baje la plataforma de estadificación del microscopio confocal y retire las lentes del objetivo de su posición. Reemplace la etapa predeterminada con una etapa calentada electrónicamente.

Encienda el controlador de la etapa calentada y ajuste la temperatura a 29,5 grados centígrados. Coloque la muestra montada en la platina calentada. Mueva la lente del objetivo de 20x a su posición y eleve la plataforma de preparación.

A continuación, active el emisor de luz visible y centre la cabeza del embrión en el campo de visión. Para activar los canales de fluorescencia, seleccione la longitud de onda fluorescente que se va a detectar y elija tablas de búsqueda de color para cada canal. Para cada canal de fluorescencia, ajuste la intensidad del láser a 10.0 y el voltaje del fotomultiplicador entre 600 y 700.

Para reducir el fondo y aumentar la información fluorescente recopilada, establezca el promedio en dos o cuatro y la profundidad de bits en 16 bits. Active los módulos de pila ZS y series temporales. Ajuste el orificio si es necesario.

Establezca el intervalo de tiempo y la duración del experimento. Ponga la cámara en modo en vivo. Ajuste el enfoque y aumente la intensidad del láser si es necesario.

Para ver fluorescencia. Establezca el zoom digital en 0,6 para una vista más amplia. Si lo desea.

Coloque el escenario de manera que todas las estructuras de interés sean visibles y haya espacio en el campo de visión para el crecimiento. Se enfocan dorsal y antecesormente a través del embrión hasta los límites superior e inferior de fluorescencia. Establezca la primera y la última posición de corte de Zack al menos 100 micrómetros o más por encima de estos límites.

A continuación, configure la tabla de búsqueda de pantalla en indicadores de rango para que las estructuras fluorescentes aparezcan en un tono de gris y el resto del campo sea azul o negro. Si es necesario, aumente el voltaje del multiplicador de fotos a un nivel justo por debajo de donde aparecen los píxeles rojos saturados. Si las estructuras fluorescentes aparecen rojas, reduzca la intensidad del láser y/o la ganancia hasta que adquieran un tono gris.

Si es necesario, ajuste el desplazamiento. Por lo tanto, las áreas fuera de la muestra son azules. Establezca el diámetro más pequeño que permita recopilar imágenes de manera oportuna.

El intervalo Z siempre debe establecerse a la distancia óptima sugerida para el diámetro del agujero de alfiler, realice escaneos cortos para probar los ajustes, siempre utilizando la intensidad de láser más baja posible. Ahora ejecute el experimento durante el período de tiempo deseado. Después, retire el embrión de la etapa calentada y separe lentamente los cubreobjetos, sumerja la funda, el engobe y el embrión en ellos en una placa de Petri de 30 milímetros.

Con una pipeta de vidrio, lave suavemente el embrión del cubreobjetos y retírelo de la placa de Petri. Coloque el embrión en una incubadora a 28,5 grados centígrados para que continúe desarrollándose. Al final de los experimentos, tome imágenes individuales de Zack de embriones hermanos montados en agros que se escenificaron de manera similar al espécimen al comienzo de los experimentos, pero se criaron con un EM y una incubadora de 28,5 grados Celsius.

Mida los arcos faríngeos según sea necesario utilizando software confocal u otro software de procesamiento de imágenes en embriones de tipo salvaje. Después de la población de la cresta neurológica, los arcos faríngeos se alargan a lo largo de los EA anteroposteriores y dorsales ventrales mientras se mueven en dirección rostral. En su extremo anterior, el primer arco faríngeo forma dominios maxilar y mandibular separados por el ectodermo oral, los movimientos morfogenéticos clave se ven muy alterados en los mutantes suavizados.

En este caso, el séptimo arco faríngeo no migra para superponerse con más arcos anteriores a las 48 horas después de la fertilización. Los cinco mutantes del pez cebra SM tienen numerosos defectos faciales craneales. En estas imágenes confocales estáticas.

Las fusiones en los dominios ventrales del segundo y tercer arco son evidentes a las 32 horas después de la fertilización. Mediante microscopía confocal time-lapse, analizamos la morfogénesis de los arcos faríngeos. En Smad, las fusiones de cinco mutantes entre el segundo y el tercer arco aparecen primero a las 32 horas después de la fertilización.

Coherente con el análisis estático. Si bien la expresión de los miembros de la familia PDGF sugiere que puede estar ampliamente involucrado en la morfogénesis del arco faríngeo, el movimiento de los arcos posteriores parece normal. En los mutantes P-D-G-F-R-A, es la morfogénesis del primer arco faríngeo lo que aparece específicamente alterado.

Este procedimiento es susceptible de otras técnicas de pez cebra comúnmente utilizadas, como la morfoinyección o la generación de mosaicos genéticos. Los análisis de lapso de tiempo permiten el análisis directo de las consecuencias de estas manipulaciones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar imágenes in vivo de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos mediante la anestesia y el montaje adecuados de las muestras y el ajuste de los parámetros ideales para la microscopía confocal.