Name: Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a aislar células T de doble negación del riñón murino mediante digestión con colagenasa, gradiente de densidad y selección magnética. Este protocolo permite obtener poblaciones puras para estudiar su función en la inmunología renal.

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Este trabajo es apoyado por el NIH PBS (R21 AI095484). Damos las gracias a instalaciones básicas tetrámero NHI para CD1d tetrámero.

1. Preparación de los instrumentos, los medios de cultivo y reactivos <ol><li> Instrumentos: Preparar los reactivos en condiciones estériles y utilizar bajo una campana de flujo laminar. </li><li> Preparar 1 L de medio de cultivo tisular RPMI, añadir 5% de suero fetal bovino, 2,1 g de bicarbonato, 10 ml de glutamato 100x, 10 mg de HEPES, piruvato de sodio 1 mg y 10 ml de 100X penicilina / estreptomicina. Nota: el medio de cultivo tisular recomendada, RPMI, es intercambiable con DMEM. </li><li> Preparar la solución de 5% de colagenasa &quot;D&quot; (5 ml de colagenasa &quot;D&quot; a 9 ml de medio de cultivo tisular). </li><li> Hacer solución de Percoll a tres concentraciones diferentes: 100%, 80% y 40%. Las siguientes concentraciones se calculan para 1 muestra. Mantenga las soluciones a temperatura ambiente. <ol><li> Solución de Percoll: añadir 9 ml de Percoll (sin diluir de solución madre); añadir 1 ml de PBS 10x. </li><li> Solución de Percoll: añadir 8 ml de Percoll 100%; añadir 2 ml de PBS 1x. </li><li> Solución de Percoll:añadir 4 ml de Percoll al 80%; añadir 4 ml de PBS 1x. </li></ol></li><li> Hacer 1 L de fluorescencia de células activadas por la clasificación tampón (FACS); añadir 5 ml de 10% de BSA (BSA al 0,1%), azida de sodio 1 ml al 10% (0,1%), 2 ml de agente EDTA, completar a 1 000 ml con PBS 1x. </li></ol> 2. Preparación de la digestión de riñón <ol><li> Habiendo adquirido cualquier aprobación institucional necesario, sacrifica y Exsanguinate los ratones con los métodos estándar y siguiendo las normas vigentes y las directrices de cuidado de animales. <ol><li> Se anestesia el ratón con pentobarbital (0,07 mg / kg). </li><li> Continúe con el desangramiento. </li><li> Coloque el ratón en una posición supina sobre una mesa quirúrgica. </li><li> Pulverizar la zona abdominal con etanol al 70%. </li></ol></li><li> Añadir 10 ml de solución de colagenasa D para la placa de Petri. </li><li> Retire y decapsulate ambos riñones de cada ratón. <ol><li> Abra la cavidad abdomimal haciendo una incisión en la línea media a través de la piel abdominal y el peritoneo desde el esternón hastael pubis. </li><li> Exponer el riñón izquierdo moviendo el intestino lateralmente a un lado. </li><li> Separe con cuidado la cápsula a la izquierda con las pinzas. Nota: La cápsula aparece como una capa transparente que rodea el riñón y parcialmente cubierto por el tejido adiposo perirrenal. </li><li> Retire el riñón izquierdo cortando los vasos del pedículo utilizando una tijera quirúrgica. </li><li> Repita mismo procedimiento para el riñón derecho. Nota: El riñón derecho es más craneal y más cerca de la línea media (pedicelos son más cortos). </li></ol></li><li> Coloque el riñón en la placa de Petri. </li><li> Cortar el tejido renal en trozos pequeños (1-2 mm de dimensión) usando una cuchilla regular de la conformación de metales y colocar las piezas en la solución de colagenasa durante 30-45 minutos en la incubadora a 37 ° C (Figura 1). </li></ol> 3. Preparación de las células mononucleares de riñón (KMNC) de la digestión del Riñón <ol><li> Obtener una suspensión de células del riñónla digestión mediante la interrupción mecánicamente el tejido usando un filtro (70 micras) y se resuspende en 25 ml de medio de cultivo tisular y mezclar. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 º C para sedimentar la suspensión de células. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en 4 ml de solución de Percoll 40% y suavemente superponer en 4 ml de solución de Percoll al 80% con una pipeta de plástico de transferencia, muy despacio y con cuidado. Esto dará como resultado dos fases claramente separadas por una capa translúcida. En la parte superior será una capa de color amarillo que corresponde a los lípidos. </li><li> Se centrifuga a 1500 × g durante 30 min a temperatura ambiente con la centrífuga en el modo de freno. </li><li> Quite por aspiración de la capa superior de color amarillo y grueso (unos 1-2 ml). </li><li> Recoger sólo la capa translúcida de color blanquecino ligero de la interfase de las dos fases con una pipeta de transferencia. De transferencia muy cuidadosamente esta suspensión en un tubo cónico de 15 ml que contiene 2 ml de medio de cultivo tisular y a continuación, añadir 13 ml de medio para hacer un volumen total de15 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las muestras en 1 ml del medio. </li><li> Cuente el número de KMNC mediante exclusión con azul de tripano en un hemocitómetro y expresar los resultados como números de KMNC por ml por cada riñón. </li><li> Lavar una vez que el anterior. </li></ol> 4. Aislamiento de hematopoyéticas (CD45 +) las células de KMNC (Paso I) <ol><li> Resuspender las células a 10 7 a 90 l de tampón. </li><li> Añadir 10 l de microperlas CD45 y se incuba durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de tampón de desarrollo para detener la reacción. Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C y resuspender en 500 l de tampón de ejecución. </li><li> Preparar la columna magnética colocando en el imán y enjuague con 3 ml de tampón. </li><li> Pasar la suspensión de células a través de la columna magnética y recoger las células no marcadas que pasan a través de la columna. </li><li> Lavar las células tres veces con 3 ml de runnción tampón. Luego recoger el efluente. </li><li> Retire la columna del separador y una pipeta 5 ml de tampón en las columnas y enjuagar la fracción marcada inmediatamente. Esta fracción contiene las células CD45 +. Contar las células. </li><li> Para calcular el número absoluto de diferentes subconjuntos de células T en los riñones multiplicar el número total de KMNC por el porcentaje de células positivas determinado por citometría de flujo (Figura 2). </li></ol> 5. Aislamiento de DN T Móvil desde CD45 + Preparación por selección negativa (Etapa II) <ol><li> Añadir 2,5 l (0,5 mg / ml, 1,25 microgramos) de cada uno de los siguientes anticuerpos biotinilados anti-CD4, anti-CD8, anti-receptor de Fc (CD16/32), anti-MHC de clase II (IA b), anti- CD1d PBS-57 tetrámero por cada 10 células hematopoyéticas 7. </li><li> Se incuban las células durante 30 min en la habitación fría. </li><li> Añadir 1 microperlas anti-biotina ml. </li><li> Incubar durante 30 minutos en una cámara frigorífica. </li><li> Colocar el tubo en tél imán y proceder al agotamiento. </li><li> Contar las células viables para determinar el número total de células DN T en la fracción negativa mediante el uso de un hemocitómetro. </li><li> Compruebe la pureza de las células T DN con citometría de flujo, siguiendo esta estrategia gating: primero CD45 + puerta, segunda puerta TCRαβ +. Excluir las células CD1d +. Parcela CD4 + CD8 + vs Para identificar las células DN T (Figura 3). </li><li> Multiplique el número total por el porcentaje determinado en la pureza. Nota: El uso de este protocolo resulta en una población de más de 90% de pureza células T DN. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
<li>Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+regulatory+function+of+lymphoproliferative+double+negative+T+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo.</a> J Exp Med. 196, 261-267 (2002).</li>
<li>Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+trogocytosis+as+a+mechanism+of+double+negative+regulatory+T+cell-mediated+antigen-specific+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression.</a> J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).</li>
<li>Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-lymphocyte+infusion+induces+transplantation+tolerance+by+activating+systemic+and+graft-infiltrating+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells.</a> Blood. 100, 3408-3414 (2002).</li>
<li>Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+in+vitro-generated+DN+T+regulatory+cells+induces+permanent+cardiac+allograft+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice.</a> Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).</li>
<li>Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+graft-versus-host+disease+by+double-negative+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells.</a> J Immunol. 171, 134-141 (2003).</li>
<li>Mohamood, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gld+mutation+of+Fas+ligand+increases+the+frequency+and+up-regulates+cell+survival+genes+in+CD25%2BCD4%2B+TR+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells.</a> Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).</li>
<li>Ascon, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+mouse+kidneys+contain+activated+and+CD3%2BCD4-+CD8-+double-negative+T+lymphocytes+with+a+distinct+TCR+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire.</a> J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).</li>
<li>Hamad, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B220%2B+double-negative+T+cells+suppress+polyclonal+T+cell+activation+by+a+Fas-independent+mechanism+that+involves+inhibition+of+IL-2+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production.</a> J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).</li>
<li>Rabb, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+role+of+T+lymphocytes+in+renal+ischemia-reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Renal%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).</li>
<li>Burne, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+CD4%28%2B%29+T+cell+as+a+major+pathogenic+factor+in+ischemic+acute+renal+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure.</a> J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).</li>
<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
<li>Crispin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+double+negative+T+cells+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+produce+IL-17+and+infiltrate+the+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys.</a> J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).</li>
<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Existe un interés creciente en las células T DN ya que están siendo implicados en diferentes condiciones patológicas tales como enfermedades autoinmunes, el cáncer, la tolerancia del injerto, y las enfermedades primarias del riñón incluyendo lesión renal aguda (LRA), glomerulonefritis 8, 13. Por lo tanto, no hay necesidad de entender mejor y caracterizar las funciones fisiopatológicas de las células T DN. Sin embargo, actualmente hay una falta de comprensión de la función de estas células en comparación con C...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Periférico αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doble negativa células (DN) T se dividen en varios subconjuntos que poseen fenotipos y funciones 1-4 distintos. DN células T, son poco conocidos, pero cada vez más implicados en la respuesta inmune fisiopatológicos en diferentes modelos de enfermedad 4-6. Células DN T son un tipo de célula inmune única que está implicada cada vez más en la regulación de diversas respuestas inmunes y autoinmunes y la modulación de la tolerancia alotrasplante. 4-6, 9 son raros en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y los ganglios linfáticos ). Sin embargo, son importantes los residentes del riñón y el intestino epitelio normal 10-12. Muy poco se sabe acerca de su función 7 en el riñón en el estado estacionario y en condiciones patológicas como la lesión renal aguda (LRA) asociado con trasplantación de riñónhormiga. Debido a las funciones complejas de diferentes células inmunes en la regulación de respuestas inmunes incluyendo alloresponses, definir el papel de cada jugador es fundamental para entender alloresponses y el diseño de nuevas terapias. Teniendo en cuenta los números significativos de células DN T presentes en el riñón bajo condiciones fisiológicas y de enfermedad diferentes, las células DN T es probable que desempeñen un papel crítico en la regulación de respuestas inmunes y autoinmunes en ratones y seres humanos, y alloresponses en receptores de trasplante. La acumulación de pruebas, aunque todavía dispersos implica células T DN en ambas funciones patogénicas e inmunosupresores, pero no se comprende bien por qué y cómo se exhiben una función perjudicial o supresora específica y cómo el ambiente influye en ellos. Debido a su baja abundancia en el riñón, mejora de los métodos de aislamiento son necesarios. Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de Tél tejidos no linfoides. Nuestro protocolo describe un nuevo método para el aislamiento de células DN T de los riñones; Sin embargo, el método también se puede utilizar para diversos tejidos no linfoides.

<table><tbody><tr><td>Campana de flujo laminar&nbsp;</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>o equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de atmósfera controlada</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37 y s&deg; C con 5% de CO2)</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo analítico</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1% azida de sodio (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato tamponado salino (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Tampón EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS columnas&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ microperlas</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas de biotina&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clon: 30-F11)&nbsp; PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clon: 30-F11)&nbsp; APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>anti-TCR Pacific Blue&nbsp; (cadena ab, clon: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biotinilado (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>biotinilado anti-CD8&nbsp; (clon 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC clase II (I-A b) BD biotinilado</td><td></td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td> ratones <td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Riñones - Placa de Petri de Ganglios Linfáticos</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Biociencias</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; Filtro M&nbsp;</td><td>Émbolo</td><td>de 22363548</td><td></td>Fisher</tr><tr><td>Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos GeneMate 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos GeneMate 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>O equipo equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-tetrámero galcer</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de doble negación células t αβ del riñón

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de los tejidos no linfoides a pesar de su participación cada vez informado en varias respuestas inmunes. Células DN T son un tipo de célula inmune única que ha sido implicado en la regulación de las respuestas y la tolerancia inmunes y autoinmunes a alotrasplantes 1-6. Células DN T son, sin embargo, rara en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y nódulos linfáticos), pero son importantes los residentes de la normal del riñón. Muy poco se sabe acerca de su función fisiopatológica 7 debido a su escasez en la periferia. Recientemente hemos descrito un análisis fenotípico y funcional integral de esta población en el riñón 8 en estado estacionario y durante la lesión por isquemia-reperfusión. Análisis de la función de las células T DN se verá muy reforzada por el desarrollo de un protocolo para su aislamiento del riñón. Aquí, se describe un nuevo protocolo que permite isolation de alta pureza + CD8 + células T CD4 AB y las células DN T de riñón murino. En pocas palabras, digerimos tejido renal mediante colagenasa y aislar las células mononucleares de riñón (KMNC) por gradiente de densidad. Esto es seguido por dos pasos para enriquecer las células T hematopoyéticas de 3% a 70% de KMNC. El primer paso consiste en una selección positiva de las células hematopoyéticas CD45 + utilizando un kit de aislamiento. En el segundo paso, las células DN T se aíslan negativamente por la eliminación de células no deseadas utilizando CD4, CD8, MHC de clase II y anticuerpos monoclonales y CD1d α-GalCer tetrámero. Esta estrategia conduce a una población de más de 90% de pureza células T DN. Tinción de la superficie con los anticuerpos mencionados anteriormente, seguido por el análisis FACS se utiliza para confirmar la pureza.

Tipo salvaje C57BL / 6 (B6) riñón contiene aproximadamente 1.5 a 2.1 x 10 6 células mononucleares por el riñón. Aproximadamente menos de 10% son células hematopoyéticas CD45 +. Para la preparación de células mononucleares de riñón (KMNC), los riñones se cortan en trozos pequeños, como se muestra en la Figura 1 seguido por la digestión usando 5% de colagenasa. Esto es seguido por la realización de una centrifugación en gradiente de densidad para recoger ...

Células DNabT son raros entre las células T periféricas; sin embargo, que son abundantes en ciertos tejidos no linfoides. Dificultad de aislar las células T DN de tejidos no linfoides dificulta su análisis funcional a pesar del aumento reconocida importancia fisiopatológica. Se describe un nuevo protocolo para el aislamiento de células DN T altamente purificadas de riñón murino.

Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

El objetivo general de este procedimiento es describir cómo aislar linfocitos T puros y doble negativos del riñón de ratón. Esto se logra primero digiriendo el riñón en una solución de colagenasa. A continuación, las células mononucleares se separan mediante gradiente de densidad, y las células hematopoyéticas positivas para CD45 se recolectan mediante selección positiva.Finalmente, las células T doble negativas pueden aislarse mediante selección negativa. En 1998, nuestro equipo descubrió que las células inmunitarias, particularmente las células T, contrariamente a la doctrina actual, estaban mediando la lesión renal aguda. Había muy pocas de esas células en el riñón y el corazón para su estudio, por lo que desarrollamos una técnica para investigarlas mejor.Nos sorprendió encontrar una población de células, los linfocitos T doble negativos sin CD cuatro ni CD ocho, que estaban en alta proporción tanto en el riñón normal como durante la lesión. En el próximo video se describirá la técnica detallada y mejorada para estudiar mejor estas células y analizar sus mecanismos. Hemos estado estudiando los linfocitos T doble negativos desde 2001, y recientemente nos unimos al laboratorio del Dr. Rob para modificar el método regional de aislamiento de estas células y obtener una población pura que pueda utilizarse en diferentes respuestas inmunitarias biológicas.Aunque este método puede proporcionar información sobre las células inmunitarias en el riñón, también puede aplicarse a otros sistemas, como tejidos no linfáticos. Antes de comenzar la cirugía, primero agregue 10 mililitros de colagenasa D a una placa de Petri para la recolección del tejido. Luego, rocíe el área abdominal de un ratón sacrificado con etanol al 70%.A continuación, realice una incisión media a través de la piel abdominal y el peritoneo desde el esternón hasta la sínfisis púbica, y luego desplace el intestino lateralmente hacia un lado para exponer el riñón izquierdo. Identifique la cápsula izquierda, que aparece como una capa transparente que rodea al riñón y está parcialmente cubierta por tejido adiposo perirrenal, y sepárela cuidadosamente del riñón con pinzas. A continuación, corte el vaso pedículo con tijeras quirúrgicas para extraer el tejido y coloque el riñón en la placa de Petri.Luego de extraer el riñón derecho, utilice una cuchilla metálica común para cortar el tejido renal en pequeños fragmentos de uno a dos milímetros. Digerir los fragmentos en la solución de colagenasa durante 30 a 45 minutos a 37 grados Celsius, y luego, para aislar las células mononucleares del riñón, romper mecánicamente la suspensión de riñón mediante un filtro de 70 micrones. Resuspender la suspensión celular en 25 mililitros de medio de cultivo tisular.Luego, tras una agitación suave, centrifugar las células y resuspender el precipitado en cuatro mililitros de solución al 40 % de Percoll. A continuación, utilizar una pipeta de transferencia de plástico para superponer suavemente la solución celular de Percoll sobre cuatro mililitros de una solución al 80 % de Percoll, creando así dos fases claramente separadas por una capa translúcida. Incubar las células durante 30 minutos a 1500 G y temperatura ambiente sin frenado, y luego aspirar aproximadamente de uno a dos mililitros de la capa superior espesa y amarilla que contiene lípidos.Utilice una pipeta de transferencia nueva para recoger la capa ligeramente blanquecina y translúcida de la interfase de las dos fases en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga dos mililitros de medio de cultivo celular. Luego, agregue 13 mililitros de medio para llevar el volumen total a 15 mililitros. Después de lavar y contar, diluya las células a uno por diez a la siete en 90 microlitros de tampón de corrida.Luego, incubar las células en 10 microlitros de microesferas de CD45 a cuatro grados Celsius. Después de 15 minutos, añadir un mililitro de tampón de lavado para detener la reacción. A continuación, centrifugar las células y reutilizarlas.Suspenda el sedimento en 500 microlitros de tampón de funcionamiento fresco. A continuación, coloque una columna en un imán de separación de perlas y enjuague la columna con tres mililitros de tampón de funcionamiento. Luego, pase la suspensión celular a través de la columna magnética, recolectando las células no marcadas que atraviesan la columna.Lave el tubo que contiene las células tres veces con tres mililitros de tampón de lavado, recolectando el efluente cada vez, y luego retire la columna del imán. Pipetee cinco mililitros de tampón de lavado sobre la columna e inmediatamente eluya la fracción marcada que contiene las células positivas para CD45. Luego, tras contar las células, incúbelas en 2,5 microlitros de cada uno de estos anticuerpos biotinilados por cada 1 × 10⁷ células hematopoyéticas a cuatro grados Celsius.Después de 30 minutos, incube las células durante otra media hora a cuatro grados Celsius en un mililitro de microperlas anti-biotina. Coloque una columna nueva en el imán y luego cargue las células sobre la columna como se acaba de demostrar, recolectando esta vez la fracción negativa. Finalmente, cuente las células viables para determinar el número total de linfocitos T doble negativos en la fracción negativa y multiplique este número por el porcentaje de pureza determinado mediante análisis citométrico de flujo.Mientras que los riñones del tipo C 57, negro seis, contienen aproximadamente de 1,5 a 2,1 veces 10 de las seis células mononucleares por riñón, menos del 10 % son células hematopoyéticas positivas para CD 45. Tras la centrifugación en gradiente de densidad para recoger la capa de células mononucleares del riñón, las células positivas para CD 45 pueden purificarse adicionalmente hasta aproximadamente el 80 al 95 % mediante separación con microesferas magnéticas positivas para CD 45. Entre las células hematopoyéticas enriquecidas positivas para CD 45, aproximadamente del 30 al 60 % son linfocitos T doble negativos.La selección negativa de las células positivas para CD45 para eliminar las células positivas para CD4, positivas para CD8, positivas para MHC clase II y positivas para tetrámero da como resultado linfocitos T doble negativos altamente purificados, con una pureza del 90 al 95 %. Mediante este protocolo, es posible obtener hasta 0,5 × 10⁶ células hematopoyéticas positivas para CD45 marcadas magnéticamente por ratón. Este procedimiento permitirá comprender mejor las funciones biológicas y los mecanismos de acción de las subpoblaciones de linfocitos T doble negativos en diferentes tejidos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aislamiento de linfocitos utilizando el kit de Miltenyi MAC es una manera confiable para purificar las células de todo homogeneizados de tejido linfoide. Células purificadas utilizando el sistema de Miltenyi suelen ser ≥ 96% de pureza. Este sentido, demuestran las medidas adoptadas para aislar las células CD4 + T, uno de los kits que se ofrecen por Miltenyi.

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

El video explica una forma de purificar las células B mediante la orientación inmunomagnética y la separación de la suspensión de células mononucleares de sangre periférica. El método consiste en etiquetar tipos de células no deseadas con anticuerpos o ligandos específicos (unidos a partículas magnéticas) dirigidos a proteínas específicas de la superficie celular, para ser agotadas de la suspensión celular heterogénea por separación magnética.

Selección inmunomagnética negativa: un método para purificar células B a partir de células mononucleares de sangre periférica

Este video muestra un protocolo para el aislamiento basado en marcaje magnético de una población de baja concentración de células T CD4 + Vδ1 + γδ de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Utilizando una combinación de anticuerpos anti-Vδ1 conjugados con FITC, microesferas magnéticas anti-FITC y perlas superparamagnéticas recubiertas de anticuerpos anti-CD4, las células T CD4 + Vδ1 + se pueden purificar con éxito a partir de la población de PBMC.

Aislamiento selectivo de células T CD4+ Vδ1+ γδ de células mononucleares de sangre periférica humana

Aquí, proporcionamos un protocolo optimizado para el aislamiento y clonación de la escasa entidad de células T periféricas Vδ1+CD4+ que es, como demostramos recientemente, un progenitor de células T αβ extratímicas. Esta técnica permite aislar, clonar y expandir eficientemente estas células en cultivo ex vivo.

Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

Se necesitan técnicas fiables y eficientes para el aislamiento de las células inmunitarias renales para aplicaciones posteriores. Esto requiere el marcaje de anticuerpos de superficie de una pequeña cantidad de células inmunitarias renales. En este artículo, describimos un método conciso para el aislamiento de células inmunitarias renales que aparentemente logra este objetivo.

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Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

Aquí presentamos un método de aislamiento y de la cultura de grado clínico novela para riñón células estromales perivasculares (kPSCs) basado en perfusión de órgano entero con enzimas digestivas y células NG2 enriquecimiento. Con este método, es posible adquirir un número suficiente de células para terapia celular.

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Presentamos un protocolo sencillo para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica a partir de sangre total obtenida de pacientes diagnosticados con Síndrome de Sézary, seguido de selección de linfocitos T CD4+, su estimulación con forbol12-miristato13-acetato e ionóforo A23187, y preparación de ARN para el perfil transcriptómico.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana y células T CD4 + de pacientes con síndrome de Sézary para perfiles transcriptómicos

Después de la infección viral, el riñón alberga un número relativamente grande de células CD8+ T y ofrece la oportunidad de estudiar las células TRM no mucosas. Aquí, describimos un protocolo para aislar linfocitos renales de ratón para el análisis de citometría de flujo.

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Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de alta calidad de riñones de ratones congelados que mejoran la representación de los tipos de células renales medulares y evitan los artefactos de expresión génica de la disociación enzimática del tejido.

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Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía renal bilateral murina segura y bien tolerada.

Linfodenectomía renal bilateral murina

Aprende a aislar células T de doble negación del riñón murino mediante digestión con colagenasa, gradiente de densidad y selección magnética. Este protocolo permite obtener poblaciones puras para estudiar su función en la inmunología renal.

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