El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

El objetivo general de este procedimiento es estirar células dispuestas en patrones sobre una membrana elástica de poli(dimetilsiloxano) o PDMS. Esto se logra mediante la preparación de una lámina de PDMS, seguida por la aplicación de un micro patrón sobre el PDMS. La lámina de PDMS con micro patrón se monta luego en el dispositivo de estiramiento y se coloca una cámara de retención de medio encima.

A continuación, las células se siembran sobre la superficie de la lámina de PDMS con microdiseño y se dejan adherir al patrón antes de lavar para eliminar las células no adheridas. El paso final consiste en aplicar una elongación a la lámina de PDMS que contiene células, con el fin de estirarlas. En última instancia, se utiliza microscopía de video para demostrar que la aplicación de fuerzas sobre las fibras de retracción de células mitóticas de mamífero durante el estiramiento celular provoca la deformación de la célula.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biomecánica, como ¿cuáles son los efectos de las fuerzas externas sobre procesos celulares como la división? Tuvimos la idea original de este método cuando deseábamos aplicar fuerzas sobre una célula en división para comenzar a cortar un trozo de PDMS de aproximadamente 35 por 20 milímetros a partir de una lámina preexistente. Aquí se utiliza una lámina delgada de PDMS disponible comercialmente porque es más reproducible y tiene menos probabilidades de romperse en comparación con el PDMS fabricado personalmente.

Retire las capas protectoras superior e inferior de plástico y use pinzas para colocar el PDMS en una placa de Petri de plástico. Luego, lave el PDMS con etanol al 70 % durante cinco minutos en un rotador a 30 oscilaciones por minuto. Después del lavado, seque la superficie haciendo pasar aire sobre ella.

A continuación, ilumine el PDMS con luz ultravioleta profunda durante cinco minutos a una distancia de aproximadamente cinco centímetros de las lámparas ultravioleta. Mientras tanto, prepare una solución de E-D-C-N-H-S según se describe en el protocolo del texto. La solución debe prepararse justo antes de usarla porque la reactividad de la solución decae en cuestión de horas.

Transfiera las láminas de PDMS desde la placa de Petri a la tapa de la placa de Petri, que no ha sido iluminada. Esto garantizará que el entorno del PDMS sea muy hidrofóbico y facilitará el siguiente paso.

Pipetee la solución E-D-C-N-H-S sobre el PDMS e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, enjuague el exceso de E-D-C-N-H-S con agua.

A continuación, agregue la solución de PEG injertado con PLL e incube de tres horas a toda la noche a temperatura ambiente. Tras la incubación, enjuague el exceso de PEG injertado con PLL de la PDMS con agua. La PDMS ya está pasivada o funcionalizada con PEG injertado con PLL y puede almacenarse varios días a cuatro grados Celsius. Para hacer el patrón en la PDMS, coloque la hoja de P-D-M-S sobre una máscara fotográfica de cuarzo sintético que contenga las microestructuras para el grabado.

Coloque el lado de PDMS con el PEG injertado con PLL frente al lado de cromo de la máscara fotográfica. Luego, ilumine durante siete minutos a través de la máscara fotográfica a una distancia de aproximadamente cinco centímetros de las lámparas de luz ultravioleta. Tras la iluminación.

Agregue agua sobre la máscara y el PDMS, luego desprenda lentamente el PDMS del soporte de la máscara. Monte el PDMS previamente pasivado sobre el dispositivo de estiramiento. Fije un extremo del PDMS a la parte fija del estirador. Sujete el otro extremo a la parte móvil del estirador sin sujetar demasiada parte de la lámina de PDMS.

Si el PDMS se sujeta demasiado, se acorta y esto puede provocar roturas, ya que la tensión será mayor para la misma distancia de estiramiento. Asegúrese de que los tornillos estén bien apretados, o la lámina de PDMS se deslizará tan pronto como comience el estiramiento, o más adelante durante el experimento. A continuación, incube el PDMS con la solución de fibronectina durante una hora.

A temperatura ambiente, es posible utilizar otras proteínas de matriz extracelular, aunque estas no se han probado con este protocolo. Como paso final, enjuague el PDMS con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, corte un rectángulo de PDMS en un bloque grueso de PDMS.

Luego corte otro rectángulo en el interior. Para obtener una cámara que retenga las células y el medio, agregue grasa de silicona debajo de este corte rectangular de PDMS y colóquelo encima de la lámina de PDMS para crear una cámara que retenga el medio. La grasa permitirá el deslizamiento de la cámara sobre la lámina de PDMS durante el estiramiento para alinear las células.

Primero, desprenda las células de un matraz de cultivo al 50% de confluencia. Una vez que las células estén en suspensión, aspire y expulse varias veces con una punta de 200 microlitros para romper los agregados, lo que garantizará que las células individuales se unan al patrón. A continuación, agregue un mililitro de la suspensión celular en el pozo.

Deje que las células se unan a los patrones durante 10 a 30 minutos, según el tipo celular, en un incubador a 37 grados Celsius. Una vez que las células se hayan adherido a los patrones, lave suavemente las células flotantes con medio equilibrado para eliminarlas.

Retire el medio con una pipeta de aspiración mientras simultáneamente añade medio nuevo. Es fundamental mantener un flujo suficiente para lavar las células no adheridas, al tiempo que se mantiene a las células sumergidas en el medio. A continuación, coloque un cubreobjetos sobre la gota para evitar la evaporación y la fuga del medio en caso de que el PDMS se rompa, y permita que las células se extiendan durante varias horas sobre los patrones.

Luego coloque el dispositivo en un microscopio invertido e inicie la adquisición de imágenes. Evite el uso de objetivos de inmersión en aceite, ya que no funcionarán debido a problemas de enfoque. Para estirar las células del patrón microscópico, gire el tornillo micrométrico mientras corrige la posición de la platina en los ejes x, y y Z.

Es necesario corregir la posición del portaobjetos para contrarrestar el ensanchamiento del PDMS y la pérdida de enfoque. La técnica presentada en este protocolo en video permitió la aplicación de fuerzas sobre las fibras de retracción de células mitóticas de mamífero mediante el estiramiento del sustrato al inicio de la metafase. Algunas de estas fibras de retracción fueron separadas del cuerpo celular, lo que resultó en una fuerza mecánica aplicada sobre la corteza de las células mitóticas antes del estiramiento; para lograr esto, la célula se siembra sobre un patrón ovalado.

El patrón se realiza estirando el PDMS durante la impresión de patrones redondos mediante la máscara fotográfica. Después del estiramiento, el sustrato se estira de tal manera que el patrón adquiere forma circular. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo puede sembrar células en patrones macroscópicos y luego aplicar fuerzas de estiramiento al sustrato.