El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

El objetivo general de este procedimiento es estirar las células patrón en una membrana elástica de polidimetilsuboxano o PDMS. Esto se logra a través de la laminación de la hoja A-P-D-M-S, seguida de la aplicación de un micro patrón en el PDMS. A continuación, la lámina de PDMS microestampada se monta en el dispositivo de estiramiento y se coloca una piscina de retención mediana en la parte superior.

A continuación, las células se colocan en la superficie de la lámina de PDMS microestampada y se dejan adherir al patrón antes de lavarlas para eliminar las células no adheridas. El paso final es aplicar una elongación a la célula que contiene PDMS para estirar las células. En última instancia, la microscopía de video se utiliza para mostrar que la aplicación de fuerzas sobre las fibras de retracción de las células mitóticas de mamíferos en el estiramiento celular da como resultado la deformación de la célula.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biomecánica, como ¿cuáles son los efectos de las fuerzas externas en los procesos celulares como la división? Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando quisimos aplicar fuerzas sobre una celda divisoria para comenzar a cortar una pieza de PDMS de aproximadamente 35 por 20 milímetros de una hoja prefabricada. En este caso, se utiliza una lámina delgada de PDMS disponible en el mercado porque es más reproducible y es menos probable que se rompa en comparación con la hecha a medida. PDMS.

Retire las capas protectoras superior e inferior de plástico y use pinzas para colocar el PDMS en una placa de Petri de plástico. A continuación, lavar el PDMS con etanol al 70% durante cinco minutos en un rotador a 30 oscilaciones por minuto. Después del lavado, seque la superficie haciendo fluir aire sobre ella.

A continuación, ilumine el PDMS con luz ultravioleta profunda durante cinco minutos a una distancia de las bombillas ultravioleta de unos cinco centímetros. Mientras tanto, prepare una solución E-D-C-N-H-S como se describe en el protocolo de texto. La solución debe prepararse justo antes de su uso porque la reactividad de la solución decae en cuestión de horas.

Transfiera las hojas de PDMS de la placa de Petri a la tapa de la placa de Petri, que no se ha iluminado. Esto asegurará que el entorno del PDMS sea muy hidrofóbico y facilite. El siguiente paso.

Pipetear la solución E-D-C-N-H-S sobre el PDMS e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación. Enjuague el exceso de E-D-C-N-H-S con agua.

A continuación, agregue la solución de PEG injertada con PLL e incube desde tres horas hasta toda la noche a temperatura ambiente después de la incubación, enjuague el exceso de clavija injertada de PLL del PDMS con agua. El PDMS ahora está pasivado o funcionalizado con PEG injertado con PLL y se puede almacenar durante varios días a cuatro grados centígrados. Para modelar el lugar PDMS, A-P-D-M-S se coloca en una máscara fotográfica de cuarzo sintético que lleva las micro características para el patrón.

Coloque el lado PDMS que lleva el PEG injertado PLL frente al lado cromado de la máscara fotográfica. A continuación, ilumine durante siete minutos a través de la fotomascarilla a una distancia de las bombillas ultravioleta de unos cinco centímetros. Después de la iluminación.

Agregue agua a la mascarilla y al PDMS, luego despegue el PDMS lentamente de la mascarilla, monte el PDMS previamente pasivado en el dispositivo de estiramiento. Fije un lado del PDMS a la parte fija de la camilla. Fije el otro lado a la parte móvil de la camilla sin sujetar demasiado la hoja de PDMS.

Si el PDMS se sujeta demasiado, se acorta y esto puede provocar un frenazo, ya que la tensión será mayor para la misma distancia de estiramiento. Asegúrese de que los tornillos estén bien apretados, o la hoja de PDMS se deslizará tan pronto como comience el estiramiento, o más adelante durante el experimento. A continuación, incube el PDMS con la solución de fibronectina durante una hora.

A temperatura ambiente, es posible utilizar otras proteínas de la matriz extracelular, pero estas no han sido probadas con este protocolo. Como paso final, enjuague el PDMS con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, corte un rectángulo de PDMS en una losa gruesa de PDMS.

A continuación, corta otro rectángulo en el interior. Para tener una piscina que retenga las celdas y el medio, agregue grasa de silicona debajo de este PDMS de corte rectangular y colóquelo encima de la hoja de PDMS para crear una piscina de retención mediana. La grasa permitirá el deslizamiento de la piscina sobre la lámina de PDMS durante el estiramiento para modelar las celdas.

En primer lugar, separar las células de un matraz de cultivo al 50% de fluidez. Una vez que las células estén en suspensión, pipetelas varias veces con una punta de 200 microlitros para romper los agregados, lo que asegurará que las células individuales se unan al patrón. A continuación, agregue un mililitro de la suspensión de celdas a la piscina.

Deje que las células se unan a los patrones durante 10 a 30 minutos, dependiendo de la célula. Escriba una incubadora a 37 grados centígrados. Una vez que las células se hayan adherido a los patrones, enjuague suavemente las células flotantes con un medio equilibrado para enjuagar las células.

Retire el medio con una pipeta de aspiración mientras agrega el medio simultáneamente. Es fundamental mantener suficiente flujo para lavar las células no adheridas mientras se mantienen las células sumergidas en el medio. A continuación, agregue un cubreobjetos en la parte superior de la piscina para evitar la evaporación y las fugas medias en caso de que el PDMS se rompa y permita que las células se extiendan durante unas horas en los patrones.

A continuación, coloque el dispositivo en un microscopio invertido y comience a tomar imágenes. Evite el uso de objetivos de inmersión en aceite, ya que no funcionarán debido a problemas de enfoque. Para estirar las celdas del micropatrón, gire el tornillo micrométrico mientras corrige la posición de la etapa en los ejes x, y y Z.

Es necesario corregir la posición del escenario para contrarrestar el ensanchamiento del PDMS y la pérdida de enfoque. La técnica presentada en este protocolo de video permitió la aplicación de fuerzas sobre las fibras de retracción de células mitóticas de mamíferos mediante el estiramiento del sustrato al inicio de la metafase. Algunas de estas fibras de retracción se separaron del cuerpo celular, lo que resultó en una fuerza mecánica aplicada sobre la corteza de las células mitóticas antes de estirarse, la célula se coloca en un patrón ovalado para lograr esto.

El patronaje se realiza con el PDMS estirado durante la impresión de patrones redondos a través de la máscara fotográfica. Después de estirar, el sustrato se estira de tal manera que el patrón se convierte en un círculo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo puede placar celdas en macropatrones y luego aplicar fuerzas de estiramiento al sustrato.