Name: Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprende a monitorear la competencia intraespecies en poblaciones bacterianas mediante cocultivo de cepas de Bacillus subtilis marcadas con fluoróforos. Este método permite visualizar la expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales a lo largo del tiempo.

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El trabajo en el laboratorio de los autores fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), el Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) y el Göttingen Centre for Molecular Biology (GZMB). Los autores desean agradecer a Jörg Stülke por sus útiles comentarios y su lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación de placas de agar, medios de cultivo, criostocks y precultivos
<ol><li>Prepare los medios de crecimiento y los reactivos requeridos (ver tabla de materiales y reactivos).</li>
	<li>Raya las cepas de B. subtilis (por ejemplo. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) y BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) expresando uno y dos GDHs activos, respectivamente)2 que se utilizarán en el experimento de competencia en placas de agar medio SP para obtener colonias individuales. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.</li>
	<li>Tome colonias individuales e inoculte tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de medio líquido LB. Crecen las bacterias durante la noche a 28 °C y 220 rpm.</li>
	<li>Crecer cultivos nocturnos a 28 °C para evitar que las células lise o esporular.</li>
	<li>Mida la densidad óptica de los cultivos a una longitud de onda de 600 nm (OD600)utilizando un espectrofotómetro estándar.</li>
	<li>Si los cultivos han alcanzado un OD600 de 2,0, mezcle 0,75 ml de los cultivos con 0,75 ml de una solución estéril de glicerol al 50% en tubos de reacción de 1,5 ml. El ODfinal 600 debe ser 1.0 para obtener criostocks que contengan aproximadamente 108 células/ml.</li>
	<li>Guarde los tubos a -80 °C.</li>
	<li>Hacer tres precultivos de cada cepa etiquetados con los genes de fluoróforo de codificación cfp e yfp. Inocular los precultivos (tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de lb de medio líquido) con células de 1 μl de criostocks de -80 °C. Incubar los cultivos durante la noche a 28 °C y 220 rpm.</li>
</ol>2. Cocultivación de bacterias, recolección de muestras y almacenamiento de muestras
<ol><li>Preparar recién 100 ml de medio mínimo C-Glc y CE-Glc (ver tabla de reactivos y materiales), y transferir 20 ml de cada medio en matraces estériles de 100 ml.</li>
	<li>Tomar 0,1 ml de los precultivos que se cultivaron durante la noche, diluirlos con 0,9 ml lb medio en una cubeta de 1,5 ml, y determinar el OD600.</li>
	<li>Para el experimento de competición, tome aquellas preculturas de las diferentes cepas que tienen un OD600 similar entre 1.0-1.5.</li>
	<li>Para obtener poblaciones de células mixtas, diluir las células de los precultivos que tenían el OD600 adecuado a un OD600 de 0,05 en 20 ml C-Glc y CE-Glc medio mínimo complementado en matraces de agitación de 100 ml. Para el experimento de competición, las dos cepas deben mezclarse en una proporción de 1:1.</li>
	<li>Tome muestras de 10 ml de los frascos, transfiéralos a tubos de plástico de 15 ml, coseche las células por centrifugación durante 10 min a 4.000 x g en una centrífuga de mesa estándar y deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend las células en 0.5 ml de medio lb fresco, y transferir las células a una taza de reacción estéril de 1.5 ml. Añadir 0,5 ml de glicerol estéril al 50%, mezclar la suspensión mediante un riguroso vórtice y almacenar las muestras en un congelador de -80 °C hasta su posterior tratamiento.</li>
	<li>Incubar las células que quedan en los frascos de agitación durante un máximo de 24 horas a 37 °C y 220 rpm. Mantenga los frascos de agitación en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico de los fluoróforos.</li>
	<li>Tomar muestras adicionales de 0,1 ml después de 7 horas y 24 horas de crecimiento. Mida y observe el OD600 de diluciones 1:10 (en medio mínimo C-Glc o CE-Glc) de las muestras.</li>
	<li>Tome la cantidad apropiada de células de cada cultivo para hacer criostocks que tengan un OD600 de 1.0. Guarde las muestras a -80 °C hasta su posterior tratamiento.</li>
</ol>3. Tratamiento de muestras, revestimiento e incubación para análisis cuantitativos
<ol><li>Después de recoger todas las muestras, descongelar los criostocks, y diluir las células en una solución salina al 0,9% (ver tabla de reactivos y materiales) hasta 10-3.</li>
	<li>Placa 0.1 ml de las 10-3 diluciones en placas de agar medio SP y distribuir las células utilizando pipetas de vidrio estériles.</li>
	<li>Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.</li>
</ol>4. Contar a los sobrevivientes por microscopía de fluorescencia estéreo para análisis cuantitativo
<ol><li>Divida la parte inferior de la placa de agar con un bolígrafo negro en cuatro partes para una mejor orientación mientras se cuentan los sobrevivientes bajo el microscopio de fluorescencia estéreo.</li>
	<li>Coloque la placa boca abajo bajo el microscopio y enfoque las colonias usando la fuente de luz fría.</li>
	<li>Una vez que las colonias están en foco, cambie al conjunto de filtros apropiado para CFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada como CFP. Cuente a los sobrevivientes de esta cepa etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.</li>
	<li>Retire las etiquetas con etanol y cambie al conjunto de filtros YFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada con yfp. Cuente a los sobrevivientes nuevamente etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.</li>
</ol>5. Tratamiento de muestras y microscopía para análisis semicuantitativos
<ol><li>Para obtener cifras ilustrativas, spot 10 μl de la dilución10-4 (aproximadamente 100 células) del paso 3.1 en una placa de agar SP (ver Figura 3).</li>
	<li>Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri sin tapa debajo del microscopio y enfoque el punto usando la fuente de luz fría.</li>
	<li>Tome fotos de las manchas para las figuras ilustrativas. Elija un tiempo de exposición apropiado para tomar las fotos de las colonias con la fuente de luz fría.</li>
	<li>Sin mover la placa, cambie al conjunto de filtros CFP, ajuste el tiempo de exposición y tome una foto. Haga lo mismo con el conjunto de filtros YFP y guarde las imágenes para análisis adicionales.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Utilice software como Excel para los análisis de datos cuantitativos. Sobre la base de las colonias contadas, calcular el porcentaje de colonias amarillas y azules con respecto al número total de colonias, que se establecen en 100%.</li>
	<li>Utilice los números calculados para crear un diagrama de barras apiladas (consulte la figura 4 y la figura 5). Utilice un programa de procesamiento de imágenes como Adobe Photoshop para construir imágenes combinadas de las imágenes tomadas desde los diferentes puntos. Alternativamente, el software de libre acceso ImageJ, descargable desde <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> se puede utilizar para el procesamiento de imágenes.</li>
	<li>Abra las imágenes desde un punto que se tomaron con el conjunto de filtros CFP y el conjunto de filtros YFP. Optimice el contraste y el brillo para reducir cualquier fluorescencia de fondo del medio.</li>
	<li>Vaya a una de las imágenes y seleccione todas. Copie la imagen y péguela en la otra imagen.</li>
	<li>Utilice la función "esquivar el color" para combinar las imágenes o superponer las imágenes fluorescentes utilizando la pestaña de canales. Los cuadros combinados de las colonias de diversos medios y de diversos puntos del tiempo representan el crecimiento de las diversas tensiones dentro de la cultura líquida.</li>
</ol>7. Consejos específicos: Experimento de interruptor de tinte y cocultivo de cepas isógenas etiquetadas con cfp y yfp
La expresión de cualquiera de los dos genes que codifican fluoróforos en B. subtilis podría influir en la aptitud y, por lo tanto, en la tasa de crecimiento de las bacterias. Por lo tanto, se recomienda realizar los siguientes experimentos para excluir que la eliminación de una cepa competidora de la población celular durante el cultivo se deba simplemente a un efecto negativo del fluoróforo:
<ol><li>Repita todo el experimento y cocultiva las cepas etiquetadas inversamente(por ejemplo, la cepa etiquetada anteriormente con cfpahora está etiquetada con el gen yfp y viceversa). Aunque inversamente, los resultados obtenidos deben ser comparables a la observación anterior de que una cepa tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre la otra cepa.</li>
	<li>Repita todo el experimento y coculte las cepas isógenas etiquetadas con yfp y cfp (por ejemplo, BP40 (rocG+ gudBCR amyE: :PgudB-yfp) y BP41 (rocG+ gudBCR amyE: :PgudB-cfp)). Estimar el efecto negativo de cualquiera de los dos fluoróforos sobre la aptitud de las bacterias siguiendo la composición de la población celular a lo largo del tiempo.</li>
</ol>

<ol><li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li>
<li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis%3A+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB%2B+suppressors+are+due+to+growth+under+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li>
<li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm%3A+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li>
<li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li>
<li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li>
<li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li>
<li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+168%2C+W23%2C+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li>
<li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis%3A+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li>
<li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li>
<li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li>
<li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis%3A+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation%2C+glutamate+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li>
<li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li>
<li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li>
<li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis%3A+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li>
<li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li>
<li>Rabatinová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B4+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li>
<li>Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+mutations+that+prevent+crosstalk+enable+the+expansion+of+paralogous+signalling+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families.</a> Cell. 150, 222-232 (2012).</li>
<li>García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Se han desarrollado varios métodos para analizar la aptitud competitiva de las bacterias16. En muchos casos las bacterias fueron etiquetadas con diferentes casetes de resistencia a los antibióticos17. Similar a nuestro enfoque, el etiquetado de las células con casetes de resistencia a antibióticos permite la evaluación de la aptitud competitiva de las bacterias durante el cocultivo en condiciones de crecimiento definidas. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar la aptitud compe...

Las bacterias del suelo suelen estar dotadas de redes reguladoras flexibles y amplias capacidades metabólicas. Ambas características permiten a las células ajustar sus vías catabólicas y anabólicas para competir con sus compañeros y otros microorganismos por los nutrientes, que están disponibles en un nicho ecológico dado1. Sin embargo, si las bacterias son incapaces de adaptarse a su entorno, otros mecanismos pueden explicar la supervivencia de una especie. De hecho, como muchas bacterias proliferan rápidamente y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares, las subpoblaciones pueden haber acumulado espontáneamente mutaciones beneficiosas que proporcionan a las células una ventaja de crecimiento selectivo y, por lo tanto, aumentan su aptitud. Además, los puntos críticos mutacionales y la mutagénesis adaptativa inducida por el estrés pueden facilitar la evolución de una bacteria inadaptada2,3. Así, la acumulación de mutaciones y el crecimiento bajo selección continua es el origen de la enorme diversidad microbiana, incluso dentro del mismo género4,5. Al igual que en la naturaleza, la conformación de genomas bacterianos también ocurre en el laboratorio debido al cultivo continuo bajo selección. Esto se ejemplifica en la domesticación de la bacteria Gram-positiva B. subtilis, que se utiliza en todo el mundo en la investigación básica y en la industria. En la década de 1940, B. subtilis fue tratado con rayos X perjudiciales para el ADN, seguidos de un cultivo bajo una condición de crecimiento específica6. Las mutaciones que se han acumulado en las bacterias durante su domesticación explican la pérdida de muchas características de crecimiento, es decir, la cepa de laboratorio B. subtilis 168 perdió la capacidad de formar colonias complejas7,8.
Hoy en día, para las bacterias modelo mejor estudiadas Escherichia coli y B. subtilis,una variedad de herramientas poderosas está disponible para manipular genéticamente sus genomas con el fin de abordar cuestiones científicas específicas. A veces la inactivación de un gen de interés causa un defecto de crecimiento severo, que luego es claramente visible en el medio de crecimiento estándar9. Por el contrario, las mutaciones que causan un defecto de crecimiento débil y, por lo tanto, solo afectan ligeramente la aptitud de la cepa a menudo se ignoran. Sin embargo, en ambos casos la incubación prolongada y el paso de las cepas mutantes durante varias generaciones suelen dar lugar a la acumulación de mutantes supresores que han restaurado el fenotipo de la cepa madre2,9. La caracterización de mutantes supresores y la identificación de las mutaciones que han restaurado el defecto de crecimiento de la cepa mutante madre es un enfoque muy útil que permite la elucidación de procesos celulares importantes y a menudonovedosos 10,11.
Estamos interesados en el control de la homeostasis del glutamato en B. subtilis12. Similar a E. coli, B. subtilis responde a la perturbación de la homeostasis del glutamato(es decir,bloqueo en la degradación del glutamato2)por la acumulación de mutantes supresores. Se demostró que las alteraciones genómicas en estos mutantes supresores que fueron adquiridos por mutación espontánea restauran rápidamente la homeostasis del glutamato9,13. Por lo tanto, no es sorprendente que la adaptación de B. subtilis a una condición de crecimiento específica durante la domesticación de la bacteria se refleje en la síntesis enzimática y en las actividades enzimáticas evolucionadas, que están involucradas en el metabolismo del glutamato12. Se ha sugerido que la falta de glutamato exógeno en el medio de crecimiento durante el proceso de domesticación fue la fuerza impulsora para la aparición y fijación de la críptica glutamato deshidrogenasa (GDH) del gen GUDBCR en la cepa de laboratorio 1682,14. Esta hipótesis es apoyada por nuestra observación de que la cantidad reducida de actividad de GDH en la cepa de laboratorio proporciona a las bacterias una ventaja de crecimiento selectivo cuando el glutamato exógeno es escaso2. Por otra parte, el cultivo de una cepa de B. subtilis, sintetizando el GDH GudB, en ausencia de glutamato exógeno da lugar a la acumulación de mutantes supresores que han inactivado el gen gudB 2. Obviamente, la presencia de un GDH catabólicamente activo es desventajosa para la célula porque el glutamato producido endógenamente que de otra manera podría ser utilizado para el anabolismo se degrada a amonio y 2-oxoglutarato(Figura 1). Por el contrario, cuando el glutamato es proporcionado por el medio, una cepa de B. subtilis equipada con actividad GDH de alto nivel tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre una cepa que sintetiza solo un GDH funcional. Es razonable suponer que la actividad de GDH de alto nivel permite a las bacterias utilizar el glutamato como segunda fuente de carbono además de otras fuentes de carbono proporcionadas por el medio2 (ver Figura 1). Por lo tanto, la actividad de GDH afecta fuertemente la aptitud de las bacterias, dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno.
Aquí presentamos un método muy ilustrativo para monitorear y visualizar la competencia intraespecípecíta entre dos cepas de B. subtilis que difieren en un solo lugar geométrico en el cromosoma(Figura 2). Las dos cepas fueron etiquetadas con los genes yfp y cfp que codifican los fluoróforos YFP y CFP, y cocultivadas bajo diferentes condiciones nutricionales. Mediante el muestreo a lo largo del tiempo y el enchapado de diluciones apropiadas en placas de agar, los sobrevivientes en cada uno de los cultivos podrían ser fácilmente monitoreados utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo común. El procedimiento descrito en este papel es fácil de realizar y conveniente visualizar la extensión y la eliminación clónicas rápidas de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población de la célula en un cierto plazo.

<table><tbody><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Roth, Alemania</td><td>3746</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco, EE. UU.</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Citrato férrico de amonio (CAF)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>9714</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp; </td><td>Roth, Alemania</td><td>5239</td><td></td></tr><tr><td>Aplicación de glucosa</td><td>, Alemania</td><td>A3617</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth, Alemania</td><td>4043</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&bull; 3H2O</td><td>Roth, Alemania</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Applichem, Alemania</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth, Alemania</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Roth, Alemania</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>Roth, Alemania</td><td>P027</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&nbsp;</td><td>Roth, Alemania</td><td>T881</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; 4H2O</td><td>Merck Millipore, Alemania</td><td>102786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Alemania</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de nutrientes</td><td>Roth, Alemania</td><td>X929</td><td></td></tr><tr><td>Aplicación de glutamato de potasio</td><td>, Alemania</td><td>A3712</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Roth, Alemania</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Aplicación de triptófano</td><td>, Alemania</td><td>A3445</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Roth, Alemania</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubos de reacción</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Tubos de reacción</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos de plástico con tapón de rosca</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Cubetas de poliestireno</td><td>Sarstedt, Alemania</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tubos de cultivo de vidrio&nbsp;</td><td>Marca, Alemania</td><td>7790 22</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de 100 ml con tapones de aluminio</td><td>Marca, Alemania</td><td>928 24</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio estériles de 10 ml</td><td>Marca, Alemania</td><td>278 23</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (28 y 37 &deg; C)</td> <td>Nuevo Brunswick</td><td>M1282-0012</td><td></td></tr><tr><td>Juego de pipetas estándar (2-20 &mu; l, 10-100 &mu; l, 100-1.000 &mu; l)</td><td>Eppendorf, Alemania</td><td>4910 000.034, 4910 000.042,Centrífuga</td><td></td></tr> <tr><td>de sobremesa para tubos de reacción de 1,5 y 2 ml</td><td>Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Alemania</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa para tubos de plástico de 15 ml</td><td>Heraeus Biofuge Primo R, Alemania</td><td>75005440</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro estándar</td><td>Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Alemania</td><td>80-2112-21</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de estereofluorescencia&nbsp;</td><td>Zeiss SteREO Lumar V12, Alemania</td><td>495008-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Congelador (-20 y -80 &deg; C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Nevera (4 & grados; C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Zirbus, LTA 2x3x4,</td> <td>Alemania-Medidor de</td><td></td></tr> <tr><td>pH</td><td>pH-metro 766, Calimatic, Knick, Alemania</td><td>766</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Vórtice 3, IKA, Alemania</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>Balanza</td><td>CP2202S, Sartorius, Alemania</td><td>reemplazado por</td><td></td></tr><tr><td>Pluma negra (marcador permanente)</td><td>Staedler, Alemania</td><td>317-9</td><td></td></tr><tr><td>Programa de Powerpoint</td><td>Microsoft, EE. UU.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Office Programa Excel</td><td>Microsoft, EE. UU.</td><td>-</td><td>Programa para el procesamiento de datos</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5</td><td>Adobe, EE. UU</td><td>. reemplazado por CS6, descargar</td><td>Programa informático para el procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>Computadora</td><td>PC o Mac-ZEN</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pro 2011 software para el microscopio</td> <td>de fluorescencia estereoscópicaZeiss, Alemania</td><td>410135 1002 110</td><td>AxioCam MRc Rev. Obtenido a través de Zeiss</td></tr><tr><td colspan="4">Recetas de solución específicas</td></tr><tr><td colspan="4">SP Medio</fuerte></td></tr><tr><td>8 g Caldo</td><td></td><td></td><td></td>de nutrientes</tr><tr><td>0,25 mg MgSO4&bull; 7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g de KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g de agar para medio</td><td></td><td></td> SP sólido<td>, si es necesario</td></tr>, <tr><td>agregue 1 L con autoclave H2O</td><td></td><td></td><td>durante 20 min a 121 & C</td></tr><tr><td>1 ml de CaCl2 (0,5 M), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml de MnCl2 (10 mM), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml de citrato férrico amónico (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>LB Medio</fuerte></td></tr><tr><td>10 g Triptona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 g de extracto</td><td></td><td></td><td></td>de levadura</tr><tr><td>10 g de NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 g de agar para medio</td><td></td><td></td> LB sólido <td>si es necesario</td></tr><tr><td>añadir 1 L con autoclave H2O</td><td></td><td></td><td>durante 20 min a 121 & deg; C</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>C-Glc Mínimo Medio</fuerte></td></tr><tr><td>200 ml 5 x sales C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml L-Triptófano (5 mg/ml), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml de citrato férrico de amonio (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml de</td><td></td><td></td><td></td>sales III'</tr><tr><td>25 ml de glucosa (20%)</td><td></td><td></td><td>esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 121 ° C</td></tr><tr><td>añadir 1 L con estéril H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">CE-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x sales</td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>10 ml L-Triptófano (5 mg/ml), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml de citrato férrico amónico (CAF, 2,2 mg/ml), esterilizado por filtración</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml III&rsquo; sales</td> 20 ml de glutamato (40%)25 ml de <td></td><td></td><td></td></tr> glucosa <tr><td></td> (20%), esterilizado en autoclave durante 20 min a 121 & deg;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>añadir 1 L con sales estériles H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 x C &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 g KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 g K2HPO4&bull; 3H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16,5 g (NH4)2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>add 1 L con autoclave estéril H2O</td><td></td><td></td><td>durante 20 min a 121 &00; C</td></tr><tr><td>III' sales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,232 g MnSO4&bull; 4H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12,3 g MgSO4&bull; 7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>añadir 1 L con H2O estéril, autoclave durante 20 min a 121 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40% Solución</td><td></td><td></td><td></td>de glutamato</tr><tr><td>200 g de ácido</td><td></td><td></td><td></td>L-glutámico</tr><tr><td>ajuste el pH a 7.0 agregando aproximadamente 80 g de KOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agregue 0.5 L con autoclave estéril H2O</td><td></td><td></td><td>durante 20 min a 121 & deg; C</td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>0.9% solución salina (NaCl)</fuerte></td></tr><tr><td>añadir 1 L con autoclave estéril H2O</td><td></td><td></td><td>durante 20 min a 121 &°; C</td></tr><tr><td>50% Solución</td><td></td><td></td><td></td>de glicerol</tr><tr><td>295 ml Glicerol (87%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>añadir 0,5 L con autoclave estéril H2O</td><td></td><td></td><td>durante 20 min a 121 &deg; C</td></tr><tr><td colspan="4">Bacteria (Todas las cepas se basan en la cepa Bacillus subtilis cepa 168)</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)&nbsp;</td><td>Recolección</td><td></td><td></td> de cepas</tr> <tr><td>de laboratorioBacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo de la competencia intraespecies en una población de células bacterianas por cocultivación de cepas marcadas fluorescentemente

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Muchos microorganismos como las bacterias proliferan extremadamente rápido y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares. Pequeñas fracciones de células en una población siempre tienen mutaciones acumuladas que son perjudiciales o beneficiosas para la célula. Si el efecto de aptitud de una mutación proporciona a la subpoblación una fuerte ventaja de crecimiento selectivo, los individuos de esta subpoblación pueden superar rápidamente e incluso eliminar por completo a sus compañeros inmediatos. Así, los pequeños cambios genéticos y la acumulación selección-impulsada de células que han adquirido mutaciones beneficiosas pueden llevar a un cambio completo del genotipo de una población de la célula. Aquí presentamos un procedimiento para supervisar la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población celular bacteriana a lo largo del tiempo por cocultivación de individuos marcados fluorescentemente de la bacteria modelo Gram-positiva Bacillus subtilis. El método es fácil de realizar y muy ilustrativo para mostrar la competencia intraespecies entre los individuos en una población celular bacteriana.

El método descrito aquí se aplicó con éxito para visualizar la competencia intraespecies en una población celular que consiste en cepas de B. subtilis que fueron etiquetados con los genes cfp e yfp que codifican los fluoróforos CFP y YFP, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3,el método se puede utilizar para visualizar la competencia intraespecies de una manera muy ilustrativa. Al detectar las muestras en áreas pequeñas, la composición clonal de la población celular s...

Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.

Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

Este método utiliza el cocoltivo de Bacillus subtilis marcado con fluorescencia para monitorear la expansión clonal rápida y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales en una población bacteriana a lo largo del tiempo. Primero, prepare los pre-cultivos de las bacterias para el experimento de competencia. Mezcle cantidades iguales de las cepas marcadas con fluorescencia y cocoltive las bacterias bajo diferentes condiciones nutricionales.Luego, recolecte las muestras en diferentes momentos, dilúyalas adecuadamente y propague las células en placas de agar. Ahora, visualice y cuente las cepas sobrevivientes mediante microscopía estereoscópica de fluorescencia. Finalmente, los resultados pueden determinar el porcentaje de bacterias sobrevivientes con respecto al número total de colonias contadas.A diferencia de la monitorización de la competencia intraespecífica mediante el uso de diferentes casetes de resistencia a antibióticos para la etiquetado de cepas, en este método las cepas competidoras marcadas con fluorescencia son casi completamente isotónicas y capaces de crecer en las mismas placas de AGA. El procedimiento previo será presentado por Lorena, quien es estudiant

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Speare, L., et al. Ensayo de coincubación para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri . J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra un ensayo de coincubación utilizado para estudiar cómo compiten las cepas bacterianas en un entorno compartido. Se aplica ampliamente en microbiología para identificar mecanismos, como la muerte dependiente o independiente del contacto, que impulsan estas interacciones.

Ensayo de coincubación para estudiar interacciones competitivas entre cepas bacterianas

Este video muestra un método basado en microscopía de fluorescencia para estudiar la competencia bacteriana a nivel de una sola célula. Este método proporciona información sobre la estructura y función de las comunidades bacterianas.

Ensayo de co-incubación bacteriana: una técnica basada en microscopía de fluorescencia para visualizar la competencia bacteriana intraespecífica a nivel de una sola célula

Se describe un ensayo cualitativo para supervisar la competencia bacteriana mediada por...

Un ensayo visual para monitorear T6SS mediada por la competencia bacteriana

Las bacterias producen compuestos secretados que tienen el potencial de afectar a la fisiología de sus vecinos microbianos. Aquí se describe una pantalla de co-cultivo que permite la detección de este tipo de interespecies mediadas químicamente interacciones mediante la mezcla de los microbios del suelo con cepas reportero transcripcional fluorescentes de Bacillus subtilis en medios sólidos.

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

El papel de surtido (segregación espacial) en escenarios de evolución puede ser examinada usando sistemas microbianos simples en el laboratorio que permiten el ajuste de la distribución espacial controlada. Mediante la modificación de la densidad celular fundador, varios niveles de surtido pueden ser visualizados utilizando cepas bacterianas marcadas con fluorescencia en las biopelículas de colonias de Bacillus subtilis.

Monitoreo Segregación Espacial en la superficie colonizadores microbianos Poblaciones

Las bacterias codifican diversos mecanismos para participar en la competencia interbacteriana. Aquí, presentamos un protocolo basado en el cultivo para caracterizar las interacciones competitivas entre los aislados bacterianos y cómo afectan a la estructura espacial de una población mixta.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

Este protocolo de imágenes celulares de células bacterianas vivas permite visualizar las interacciones entre múltiples especies bacterianas a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo. Las imágenes de lapso de tiempo permiten la observación de cada especie bacteriana en monocultivo o cocultura para interrogar las interacciones entre especies en comunidades bacterianas multiespecies, incluida la motilidad celular individual y la viabilidad.

Visualización cinética de interacciones bacterianas entre especies de una sola célula

Este manuscrito describe un método para utilizar la microscopía de fluorescencia unicelular para visualizar y cuantificar la competencia bacteriana en el cocultivo.

Cuantificación de la competencia interbacteriana utilizando imágenes de fluorescencia unicelular

Título encapsulación celular a través de gotitas

La capacidad de las células madre embrionarias humanas de auto-renovación y diferenciación en todos los tipos celulares del cuerpo sugiere que una gran promesa para aplicaciones médicas y como herramienta de investigación para abordar las cuestiones fundamentales en el desarrollo y la enfermedad. Aquí, ofrecemos un breve paso a paso el protocolo para la derivación de células madre embrionarias humanas a partir de embriones por el aislamiento immunosurgical de la masa celular interna.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

Aprende a monitorear la competencia intraespecies en poblaciones bacterianas mediante cocultivo de cepas de Bacillus subtilis marcadas con fluoróforos. Este método permite visualizar la expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales a lo largo del tiempo.

Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente (Video) | JoVE Journal

Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

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