Monitoreo De La Competencia Intraespecies En Una Población De Células Bacterianas Por Cocultivación De Cepas Marcadas Fluorescentemente

Este método utiliza el cultivo conjunto de bacillus sutilis marcado con fluorescencia para monitorear la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo. En primer lugar, prepare los precultivos de las bacterias para el experimento de competición. Mezcle cantidades iguales de las cepas marcadas con fluorescencia y cocultive las bacterias en diferentes condiciones nutricionales.

A continuación, recoja las muestras en diferentes puntos temporales, diluya adecuadamente y propague las células en placas de agar. Ahora visualice y cuente las cepas supervivientes mediante microscopía de fluorescencia estereoscópica. En última instancia, los resultados pueden determinar el porcentaje de bacterias supervivientes con respecto al número total de colonias contadas.

A diferencia del monitoreo, la competencia intraespecie utiliza diferentes casetes de antibióticos para el etiquetado de cepas. En este método, las cepas de la competencia marcadas con fluorescencia son casi completamente isotónicas y capaces de elaborarse en las mismas placas de AGA. El procedimiento previo será presentado por Lorena, quien es estudiante de doctorado en mi laboratorio, inocule los cuatro mililitros de medio LB con un microlitro de bacterias a menos 80 grados Celsius, cepas criogénicas y cultive los precultivos durante la noche a 28 grados Celsius y 220 RPM diluya 0.1 mililitros de cultivo en 0.9 mililitros de medio LB en un recipiente de 1.5 mililitros, y determinar la densidad óptica.

Luego, para obtener poblaciones celulares mixtas para los experimentos de competencia, inocular matraces de 100 mililitros que contienen 20 mililitros de CGLC y CGLC. Medio mínimo en una proporción de uno a uno, transfiera 10 mililitros de los cultivos a tubos de plástico de 15 mililitros. Recoja las células por centrifugación durante 10 minutos a 4.000 veces la gravedad y deseche el sobrenadante.

A continuación, vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de medio LB fresco y transfiera las células a una taza de reacción estéril de 1,5 mililitros, añada 0,5 mililitros de glicerol estéril al 50%. Mezcle la suspensión mediante un riguroso vórtice y almacene las muestras en un congelador a menos 80 grados centígrados. En el siguiente cultivo, las bacterias restantes en los matraces de batido.

Mantenga los matraces de agitación en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de la muestra de fuerza de flora 0,1 mililitros de los cultivos después de siete horas y 24 horas de medición de crecimiento y observe la densidad óptica de una a 10 dilución de las muestras hacer que las existencias criogénicas de las muestras se almacenen a menos 80 grados centígrados. Después de recoger todas las muestras, descongele las cepas criogénicas y diluya las células en una solución salina al 0,9% para cada placa de tensión. 0,1 mililitros de la dilución de 10 a la quinta dilución negativa en una placa de agar medio SP, y distribuir las células utilizando una pipeta de vidrio estéril.

Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales con un corral negro. Divida la parte inferior de la placa de agar en cuatro partes para una mejor orientación mientras cuenta los supervivientes bajo el microscopio de fluorescencia estereoscópica. Ahora, coloque la placa boca abajo bajo el microscopio y enfoque las colonias con la fuente de luz fría.

Una vez que las colonias estén enfocadas, cambie al conjunto de filtros apropiado para CFP Flora cuatro. Para visualizar las células supervivientes de la cepa marcada con CFP, cuente las supervivientes de esta cepa marcando las colonias con un bolígrafo. Y anote el número.

Retire las etiquetas con etanol. A continuación, cambie al conjunto de filtros YFP. Para visualizar las células supervivientes de la cepa marcada con YFP.

Vuelve a contar a los supervivientes etiquetando las colonias con un bolígrafo. Y anote el número. Abra las fotografías de un punto que se tomaron con el conjunto de filtros CFP y el conjunto de filtros YFP.

Optimice el contraste y el brillo para reducir la fluorescencia de fondo de los medios. Ve a una de las imágenes y selecciona todas. Copia la imagen y pégala en la otra imagen.

Fusiona las imágenes seleccionando en el menú de capas la opción color más claro. En este experimento, una población celular que consta de dos cepas BCI se marcaron con Fluor CFP e YFP para evaluar el efecto de diferentes fuentes de nitrógeno en el crecimiento mediante la dilución adecuada en placas de agar. La composición clonal de una población celular a lo largo del tiempo se puede determinar con precisión simplemente contando las colonias fluorescentes amarillas y azules.

La actividad de la enzima glutamato deshidrogenasa afecta fuertemente la aptitud de otus dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno. En ausencia de glutamato exógeno, la actividad de alto nivel de GDH es desventajosa para las bacterias, ya que las enzimas G y B buenas degradan el glutamato que se necesita en el anabolismo. Por el contrario, la síntesis de dos gdhs funcionales es ventajosa para las bacterias cuando se dispone de glutamato exógeno porque, además de la glucosa G, el glutamato se utiliza como fuente de carbono.

Resultados similares se obtuvieron en un experimento de cambio de troquel. Una vez más, las bacterias equipadas con un alto nivel de actividad de GDH fueron superadas por las células con actividad reducida de GDH en medios de crecimiento que carecían de glutamato. Por el contrario, las bacterias que sintetizaron solo una GDH activa se eliminaron del cultivo.

Cuando el medio se suplementó con glutamato, claramente la composición inicial de la población de células mixtas se mantuvo casi constante a lo largo del tiempo. Independientemente del flúor tomado en conjunto. El uso de Flora Force es una herramienta poderosa para monitorear la competencia intraespecie en una población de células bacterianas una vez que se generaron las fortalezas de la competencia.

Esta técnica se puede realizar en cinco días si se realiza correctamente.