Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

El objetivo general del siguiente experimento es capturar el proceso dinámico en tiempo real de la maduración del fagosoma y la biogénesis del fagolisosoma en los fagocitos. Esto se logra cargando los compartimentos lisosomales de las células con una hebra dex conjugada fluorescente para permitir la visualización de los compartimentos lisosomales y la transferencia de su carga luminal a los fagosomas. Como segundo paso, se añaden micropartículas, que actúan como modelo fagocítico.

A continuación, se analiza la entrega de material lisosomal a los fagosomas mediante imágenes de venta en vivo y posterior procesamiento digital de imágenes. Con el fin de cuantificar el proceso de maduración de los fagosomas, los resultados muestran el efecto de diversos factores sobre el proceso de maduración de los fagosomas en función de la entrega de contenido lisosomal a los fagosomas. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como la evaluación de la maduración de los macrófagos en células fijas, es la lectura cuantitativa con una alta resolución temporal: Comience por disolver la hebra DExT de 70 kilodalton marcada con rojo de Texas o Dex 70 KD en PBS a 20 miligramos por mililitro y almacene las alícuotas a menos 20 grados centígrados.

A continuación, diluya el stock de Dex 70 KD en Docos de cultivo celular completo, medio de águilas modificado o DMEM hasta aproximadamente un miligramo por mililitro. Sonicar la alícuota de la hebra DExT en un baño de agua ultrasónico durante cinco minutos. A continuación, centrifugar la solución en una microcentrífuga a máxima velocidad durante cinco minutos para eliminar los grumos o contaminantes de la solución.

Mueva con cuidado el SuperAgent a un tubo nuevo mientras evita el pellet en la parte inferior. A continuación, diluir la solución hasta una concentración de trabajo final de 20 microgramos por mililitro en un cultivo celular completo. DMEM y filtro.

Esterilice la solución a través de un filtro montado en una jeringa de 0,22 micrómetros. A continuación, observe dos mililitros de macrófagos de ratón derivados de la médula ósea a una concentración de cinco veces 10 a la cuarta célula por mililitro. En DMEM en un plato con fondo de vidrio sin recubrimiento, incube las células durante al menos 12 horas a 37 grados Celsius en una atmósfera tamponada con 5% de dióxido de carbono.

Para asegurar la fijación y la aclimatación después de la fijación, aspire el medio y agregue dos mililitros de DMEM de hebra DExT de antes de la guerra al plato con fondo de vidrio, y luego incube las células durante dos a ocho horas después de la incubación. Lave las celdas tres veces con DMEM completo precalentado. Aspire el medio después del enjuague final y agregue dos mililitros de DMEM completo.

Incuba las células de cuatro a 12 horas. A continuación, enjuague las células con DMEM completo sin rojo de fenol precalentado y agregue dos mililitros de DMEM sin rojo de fenol filtrado completo al menos 30 minutos antes del inicio de la toma de imágenes. A continuación, lleve una alícuota de suspensión de remolacha recubierta al 1% de IgG preparada como se describe en el protocolo de texto adjunto a temperatura ambiente.

Sonicar la solución en un baño de agua ultrasónico durante dos o tres minutos. Luego, en un gabinete de bioseguridad de clase dos, agregue de uno a seis microlitros de la suspensión de perlas a las celdas. Difunda la densa nube de cuentas usando una pipeta para mezclar suavemente la suspensión en el plato con fondo de vidrio.

A continuación, lleve la muestra al microscopio y concéntrese en la región de interés. Antes de la obtención de imágenes de lapso de tiempo. Optimice la configuración, incluido el escaneo, la velocidad, la ampliación y la resolución, para poder capturar un fotograma cada siete a 20 segundos.

Ajuste la configuración de emisión de excitación en función del sistema de imágenes y las sondas utilizadas, y optimice la configuración para evitar un fotoblanqueo excesivo. A continuación, capture el vídeo de lapso de tiempo y guárdelo en el formato de archivo nativo de su microscopio. Evite exportar el video en formatos comprimidos como JPG o PNG.

A continuación, inicie la distribución Fiji e Image J que contiene un paquete de procesamiento de imágenes con menús de herramientas reorganizados y complementos nativos adicionales disponibles de forma gratuita. Descargar. Abra el archivo en Fiji y seleccione el video que se va a evaluar. A continuación, configure las opciones, los filtros y los parámetros de medición como se detalla en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, escanee las imágenes observando el marco en el que se forma un fagosoma de perlas nacientes completamente formado y se cierra la copa ácida F. Utilice la herramienta de selección Óvalo para seleccionar una región circular de interés o ROI en el cordón internalizado. Asegúrese de que la selección se ajuste bien al borde exterior de la cuenta.

A continuación, vaya a analizar y haga clic en medir para ejecutar la medición. El resultado se mostrará en una ventana separada titulada resultados. En el siguiente cuadro de interés, ajuste la posición del ROI en caso de que la cuenta se haya movido y repita la medición, que se agregará a la lista en la ventana de resultados.

Cada fotograma analizado se puede identificar en función del valor de la columna de etiqueta. Después de completar la medición de todos los fotogramas relevantes, copie los valores de la columna int den en una aplicación de hoja de cálculo. La columna int den representa las intensidades del área seleccionada.

Con estos métodos, se capturaron imágenes claras de macrófagos derivados de la médula ósea que habían sido cargados con las sondas de hebra DExT. Esta imagen es del tiempo cero, que es justo cuando la célula completó la absorción de la perla codificada IgG que se señala aquí. Las imágenes que se muestran aquí fueron pseudocoloreadas para una mejor visibilidad y representan el fagosoma de cero a 85 minutos después de la absorción.

El fagosoma medido, el ROI, se delinea con la línea discontinua y las instancias de entrega y acumulación de dextrano en el fagosoma se señalan con las flechas. A partir de estas imágenes se generaron gráficos que muestran una clara tendencia temporal de la asociación de la señal con el fagosoma a lo largo del tiempo. Este gráfico representa un promedio de 10 fagosomas de las dos celdas que se muestran aquí.

Si bien la intensidad absoluta de la señal a menudo varía entre cada fagosoma analizado, la tendencia temporal suele ser muy similar. Entrega de Dex 70 KD a los fagosomas, se alcanzó una meseta dentro de los 35 a 40 minutos después de la fagocitosis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la maduración del fagosoma utilizando la microscopía confocal de lapso de tiempo.