Name: Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende a visualizar la maduración de fagosomas en macrófagos en tiempo real mediante microscopía confocal. Este método permite cuantificar la entrega de material lisosomal con alta resolución temporal.

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Damos las gracias a los miembros del Laboratorio de Biología Fagosoma para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo es apoyado por una beca de Helmholtz Young Investigator (Iniciativa y los fondos de red de la Asociación Helmholtz) y un Programa Prioritario SPP1580 Grant, del Consejo Alemán de Investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la siguiente sección vamos a discutir los pasos críticos del método presentado y sus limitaciones. Además, vamos a conectar algunos de los problemas comunes con sus soluciones, introducir posibles modificaciones y considerar ventajas de nuestro método, así como métodos complementarios adecuados para este enfoque. La preparación de las perlas, incluyendo el acoplamiento de IgG a la superficie de la perla, es crucial y el uso de preparaciones de filetes debe ser evitado. En adición a eso, t...

Fagocitos profesionales, incluyendo macrófagos, juegan un crítico en el sistema inmunológico. Además de ser la primera línea de defensa en el sistema inmune innato, sino que también desempeñan un papel crítico en la activación de la inmunidad adaptativa a través de su señalización y presentadora de antígeno papel 1-3. Mientras que la función de los fagocitos profesionales es multifacética, la maduración del fagosoma es la columna vertebral crítico de la función de procesamiento bactericida y el antígeno de los fagocitos profesionales 4,5. Después de la inmersión y la captación de un blanco fagocítica, tales como bacterias mediada por el receptor, el fagosoma naciente pasa a través de una secuencia compleja y bien orquestada de la interacción y los intercambios con compartimentos de la red endocítica y varios otros orgánulos celulares 6. La naturaleza de los compuestos intercambia con estas entidades celulares, así como la regulación y el calendario de eventos de fusión determina el medio phagosomal luminal y los fagoscomposición omal membrana y, por tanto, 7, el destino del fagosoma maduración 8. La importancia fisiológica de la maduración del fagosoma se ejemplifica con las diversas estrategias empleadas por diversos patógenos intracelulares escapar, arrestar o subvertir fagosoma maduración 9. La mayoría de estas estrategias de evitar directa o indirectamente la etapa final y crítica del proceso de maduración fagosoma: la fusión de fagosoma con compartimientos endosomal / lisosomales finales de los años, que los dota de la mayor parte de las enzimas hidrolíticas y factores anti-bacterianas de un fagosoma madura 7 , 8,10. El análisis de este paso final y crítico, por tanto, nos puede proporcionar fuertes indicadores sobre el estado de maduración de los fagosomas, y si el estado fisiológico natural está siendo positiva o negativamente afectado bajo las condiciones experimentales particulares que se están utilizando. El compartimento tarde endosomal / lisosomals son generalmente considerados como los compartimentos de terminales de la vía endocítica, definidos y distinguidos de los primeros compartimentos endocítica por la presencia de varios, Escenario, moléculas marcadoras específicas. Por ejemplo enzimas hidrolíticas o componentes de membrana tales como proteínas de la membrana lisosomal asociados (lámparas), entre otros 11. El terminal endocítica que se refiere compartimentos-de ahora en adelante simplemente como lisosomas-también sirven como la ubicación principal para las etapas finales de la digestión en el extremo de la fagocítica / endocítica vía 12. De esta manera, las sondas no digeribles se pueden cargar a través de endocitosis y macropinocitosis desde el medio extracelular y se transportan a través de la vía endocítica a los lisosomas, donde se acumula 13,14 después de seguir un ciclo definido de captación y Chase. Sondas conjugado con fluoróforo para microscopía fluorescente tal como el dextrano polímero orgánico no digerible se utilizan comúnmente como endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En este método, se describe la utilización de microperlas recubiertas con IgG como carga fagocítica para investigar la maduración fagosoma mediante el análisis de la entrega de lisosomal contenido luminal a los fagosomas. Mediante el uso de una sonda de dextrano conjugado con fluoróforo como marcador fácilmente detectable de lisosomas en los macrófagos de la médula ósea en directo derivados (BMM) y time-lapse de imágenes de vídeo con un microscopio de escaneo láser confocal, seguimos el proceso dinámico de la entrega de la carga en los fagosomas con alta resolución temporal. A continuación describimos cómo los datos time-lapse recogidos pueden ser evaluados utilizando el código abierto y el software de análisis de imágenes de libre acceso, Fiji (o ImageJ), estadísticamente analizados usando Microsoft Excel y se presenta utilizando el software GraphPad Prism 14,18. Después de la descripción de nuestro método, experimentos análogos pueden ser diseñados utilizando la configuración y factores modificados para investigar su influencia sobre la maduración fagosoma; prácticamente cualquier OTsu tipo de células fagocíticas primarios o de líneas de células adherentes, la pérdida genética de los experimentos de la función incluyendo genes knock-out y knock-down, mutantes o expresión de proteínas de fusión, fagocíticas-objetivos, compuestos de revestimiento microbead, sondas endosomal / lisosomales y factores como un citoquinas, inhibidores químicos, o ARNsi entre otros son todas las variables que se pueden aplicar para el enfoque básico de este método. Definimos el objetivo y los requisitos básicos de este método de la siguiente manera: <ul type="disc"><li> Objetivo del método: para permitir la observación directa, cuantitativa y cualitativa y el análisis de la maduración del fagosoma con alta resolución temporal en las células fagocíticas viviente. </li><li> Fagocítica de carga: Una micropartícula adecuadamente recubiertos o diana biológica. Aquí se utiliza recubiertas de IgG-3 micras micropartículas esféricas de poliestireno que se internalizan fácilmente mediante el receptor de Fc-γ fagocitosis mediada. Alternativamente, cualquier microorganismo o micrófono revestidoroparticle para que un receptor fagocítico está presente en las células se puede utilizar. </li><li> Las células fagocíticas: células fagocíticas adherentes que expresan los receptores fagocíticas apropiados. Aquí usamos primarias BMMs de ratón que expresan abundantemente los receptores Fc-γ. Alternativamente, se podrían utilizar células dendríticas (DC), monocitos o células epiteliales fagocíticas o sus mutantes o variantes genéticos knock-out. </li><li> Lysosomal de carga: Una sonda lisosómico marcado con fluorescencia. Aquí, Texas conjugado-Rojo 70000 kilodaltons de dextrano (Dex70kD) se utiliza como la carga luminal de los lisosomas. Alternativamente, cualquier marcador fluorescente detectable de un compartimiento celular o de orgánulos, o una sonda apropiada para las propiedades phagosomal tales como la acidez o de degradación de la capacidad, se podría utilizar para estudiar la progresión de la maduración del fagosoma. </li><li> Factores de influencia: por ejemplo, las moléculas de señalización, compuestos químicos, genes knock-down, o la expresión transitoria de proteínas mutantes podían. Aquí, hemos forguno el uso de ese factor en aras de la simplicidad, pero para un ejemplo reciente con la expresión de la proteína mutante y derribo factores que influyen en favor ven Kasmapour et al. 18 Cualquier factor que puede afectar la fagocitosis o por las circunstancias y la movilidad de los fagosomas y / o los compartimentos que interactúan con los fagosomas vencimiento podrían ser utilizadas. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium sin rojo fenol (D-MEM)</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>PAA, Austria</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>PAA, Austria</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Austria</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>PAA, Austria</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Plato con fondo de vidrio (35 mm &vacío;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Países Bajos</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM plato con fondo de vidrio, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Alemania</td><td>627871</td><td>Alternativa: Disponible como</td></tr><tr><td>microesferas de látex carboxilado</td> segmentadas <td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Disponible en diferentes diámetros, utilizamos 3 &mu; m</td></tr><tr><td>Micropartículas de poliestireno</td><td>Kisker Biotech, Alemania</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Alemania</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>ratón entero IgG</td><td>Rockland, EE. UU.</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante EDAC</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 ml Omnifix -F</td><td>B.Braun, Alemania</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; Aguja G (0.45 * 25 mm)</td><td>B.Baun, Alemania</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Austria</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Gibco, EE. UU</td>. <td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato MES</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; M filtro de jeringa</td><td>Sartorius, Alemania</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de fagolisosoma biogénesis en macrófagos en directo

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Las células fagocíticas juegan un papel importante en el sistema inmune innato mediante la eliminación y la eliminación de los microorganismos invasores en sus fagosomas. Maduración Fagosoma es el proceso complejo y estrechamente regulado durante el cual un fagosoma naciente se somete a transformación drástica a través de interacciones bien orquestados con diversos orgánulos celulares y los compartimentos en el citoplasma. Este proceso, que es esencial para la función fisiológica de las células fagocíticas dotando fagosomas con sus propiedades líticas y bactericidas, culmina en la fusión de fagosomas con los lisosomas y la biogénesis de fagolisosomas que se considera ser la última y crucial etapa de maduración de los fagosomas. En este reporte se describe un método basado en imágenes de células vivas para el análisis cualitativo y cuantitativo del proceso dinámico de lisosoma al fagosoma de distribución de contenidos, que es un sello distintivo de la biogénesis fagolisosoma. Este enfoque utiliza microperlas recubiertas con IgG como un modelo para phagocytosis y moléculas de dextrano conjugado con fluoróforo como sonda de carga lisosomal luminal, con el fin de seguir la entrega dinámica de contenidos lisosómica de los fagosomas en tiempo real en los macrófagos en vivo utilizando time-lapse y microscopía confocal de barrido láser. A continuación se describe en detalle los antecedentes, los pasos de preparación y la configuración paso a paso experimental para permitir el despliegue fácil y preciso de este método en otros laboratorios. Nuestro método descrito es simple, robusto, y lo más importante, puede ser fácilmente adaptado para estudiar las interacciones phagosomal y maduración en diferentes sistemas y bajo diferentes condiciones experimentales, como el uso de varios tipos de células fagocíticas, experimentos de pérdida de función, diferentes sondas y partículas fagocíticas.

La preparación correcta de las células y los granos para la formación de imágenes es crítico. Figura 1 muestra el esquema de la siembra, la sonda de carga y las etapas iniciales de formación de imágenes en este método, basado en nuestro protocolo optimizado para BMMs. Es esencial por lo tanto, que los parámetros del protocolo de ser probados y optimizados en función del tipo de células y sondas que se van a utilizar. Después de la adición de las perlas recubiertas con IgG a ...

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en capturar el proceso dinámico en tiempo real de la maduración del fagosome y la biogénesis del fagolisosoma en los fagocitos. Esto se logra cargando los compartimentos lisosomales de las células con una hebra de dextrano conjugada con un fluoróforo para permitir la visualización de los compartimentos lisosomales y la transferencia de su contenido luminal a los fagosomas. Como segundo paso, se añaden micropartículas, que actúan como un modelo fagocítico.A continuación, se analiza la entrega de material lisosomal a los fagosomas mediante imágenes en vivo y el posterior procesamiento digital de imágenes. Con el fin de cuantificar el proceso de maduración del fagosome, los resultados muestran el efecto de diversos factores sobre este proceso basándose en la entrega del contenido lisosomal a los fagosomas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la evaluación de la maduración de macrófagos en células fijadas, es la obtención de datos cuantitativos con una alta resolución temporal. Comience disolviendo la hebra de DExT marcada con rojo Texas de 70 kilodalton o Dex 70 KD en PBS a 20 miligramos por mililitro y almacene alícuotas a menos 20 grados Celsius.A continuación, diluya el stock de Dex 70 KD en medio de cultivo celular completo Docos, medio de Eagle modificado o DMEM hasta aproximadamente un miligramo por mililitro. Somete la alícuota de la cadena DExT a sonicación en un baño de agua ultrasónico durante cinco minutos. Luego, centrifugue la solución en una microcentrífuga a velocidad máxima durante cinco minutos para eliminar cualquier grumo o contaminante de la solución.Transfiera cuidadosamente el SuperAgent a un tubo nuevo evitando el precipitado en el fondo. Luego, diluya la solución hasta una concentración de trabajo final de 20 microgramos por mililitro en medio completo de cultivo celular. DMEM y filtro. Sterilice la solución mediante un filtro acoplado a jeringa de 0,22 micrómetros. A continuación, siembre dos mililitros de macrófagos derivados de médula ósea de ratón a una concentración de cinco por 10 a la cuarta células por mililitro. Incube las células durante al menos 12 horas a 37 grados Celsius en una atmósfera amortiguada con dióxido de carbono al 5 % en DMEM en un recipiente de vidrio sin recubrimiento con fondo de vidrio.Para garantizar la adhesión y aclimatación después de la adhesión, aspire el medio y añada dos mililitros de DMEM con DExT precalentado al recipiente de fondo de vidrio, y luego incube las células durante dos a ocho horas tras la incubación. Lave las células tres veces con DMEM completo precalentado. Aspire el medio después del último lavado y añada dos mililitros de DMEM completo.Incube las células durante cuatro a doce horas. Luego, enjuague las células con DMEM completo libre de rojo de fenol precalentado y agregue dos mililitros de DMEM completo filtrado libre de rojo de fenol al menos 30 minutos antes del inicio de la adquisición de imágenes. A continuación, lleve un alícuota de la suspensión de remolacha recubierta con IgG al 1% preparada según el protocolo descrito en el texto adjunto a temperatura ambiente.Sonicar la solución en un baño de agua ultrasónico durante dos o tres minutos. Luego, bajo una cabina de seguridad biológica de clase dos, añadir de uno a seis microlitros de la suspensión de perlas a las células. Dispersar la nube densa de perlas utilizando una pipeta para mezclar suavemente la suspensión en el recipiente de fondo de vidrio.Luego lleve la muestra al microscopio y enfoque la región de interés. Antes de la adquisición de imágenes en intervalos de tiempo, optimice los ajustes, incluyendo escaneo, velocidad, aumento y resolución, con el fin de poder capturar un cuadro cada siete a veinte segundos.Ajuste la configuración de excitación y emisión según el sistema de imagen y las sondas utilizadas, y optimice la configuración para evitar el exceso de fotoblanqueo. Luego, capture el video de lapso de tiempo y guárdelo en el formato de archivo nativo de su microscopio. Evite exportar el video en formatos comprimidos como JPG o PNG.A continuación, inicie Fiji y la distribución de Image J que contiene un paquete de procesamiento de imágenes con menús de herramientas reorganizados y complementos nativos adicionales disponibles gratuitamente. Descargue el archivo, ábralo en Fiji y seleccione el video que se va a evaluar. Luego, configure las opciones, filtros y parámetros de medición según se detalla en el protocolo de texto adjunto.A continuación, revise las imágenes y observe el cuadro en el que se forma un fagosome nascente completamente desarrollado y la copa ácida F se cierra. Utilice la herramienta de selección ovalada para seleccionar una región circular de interés o ROI sobre el corpúsculo internalizado. Asegúrese de que la selección ajuste firmemente al borde externo del corpúsculo.Luego, vaya a Analizar y haga clic en Medir para ejecutar la medición. El resultado se mostrará en una ventana separada titulada Resultados. En el siguiente cuadro de interés, ajuste la posición de la ROI en caso de que la perla se haya movido y repita la medición, la cual se agregará a la lista en la ventana de resultados.Cada cuadro analizado puede identificarse según el valor en la columna de etiquetas. Después de completar la medición de todos los cuadros relevantes, copie los valores de la columna int den a una aplicación de hoja de cálculo. La columna int den representa las intensidades del área seleccionada.Mediante estos métodos, se obtuvieron imágenes nítidas de macrófagos derivados de médula ósea que habían sido cargados con las sondas de la hebra DExT. Esta imagen corresponde al tiempo cero, es decir, justo cuando la célula completó la incorporación del corpúsculo codificado con IgG señalado aquí. Las imágenes mostradas aquí fueron coloreadas artificialmente para mejorar la visibilidad y representan el fagosoma desde cero hasta 85 minutos después de la incorporación.El fagosome medido, ROI, se delinea con la línea discontinua y las instancias de entrega y acumulación de dextrano en el fagosome se indican mediante flechas. A continuación, se generaron gráficos a partir de estas imágenes que muestran una tendencia temporal clara de la asociación de la señal con el fagosome a lo largo del tiempo. Este gráfico representa un promedio de 10 fagosomes provenientes de las dos células mostradas aquí.Aunque la intensidad absoluta de la señal varía a menudo entre cada fagosoma analizado, la tendencia temporal normalmente es muy similar. La entrega de Dex 70 KD a los fagosomas alcanzó una meseta entre 35 y 40 minutos después de la fagocitosis. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la maduración del fagosoma utilizando microscopía confocal de lapso de tiempo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

Describimos un método para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el centro celular en células vivas infectadas con o sin el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, utilizando microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio para identificar células infectadas fluorescentes y microscopía de campo claro para detectar fagosomas.

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

Aquí describimos una técnica basada en microscopio para visualizar y cuantificar las cascadas tempranas de eventos durante la fagocitosis de patógenos como los hongos Candida albicans y partículas que miden más de 0,5 μm, incluyendo zymosan y perlas recubiertas de IgG.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Aquí describimos un método simple y rápido para el aislamiento de Salmonella typhimurium-con fagosomas de los macrófagos en cubriendo las bacterias con biotina y estreptavidina.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

El mecanismo asociado con la fagocitosis en la infección por Leishmania sigue siendo poco conocido. Aquí, describimos métodos para evaluar los eventos tempranos que ocurren durante la interacción de Leishmania con las células huésped.

Investigación de la fagocitosis de Leishmania mediante microscopía confocal

Este estudio dilucida el procesamiento fagocítico de las partículas de Godanti Bhasma (GB) en células de mamíferos, caracterizando su absorción celular, dinámica de vacuolas, acidificación y degradación. Estos hallazgos no solo avanzan en nuestra comprensión de los mecanismos fundamentales de la fagocitosis, sino que también establecen a la GB como un sistema modelo prometedor para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Explorando los eventos celulares secuenciales de fagocitosis desencadenados por Godanti Bhasma en células de mamíferos

Aprende a visualizar la maduración de fagosomas en macrófagos en tiempo real mediante microscopía confocal. Este método permite cuantificar la entrega de material lisosomal con alta resolución temporal.

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

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