Name: Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 6 s
Description: Aprende a sintetizar un hidrogel de proteína altamente estable mediante reacciones de trans-splicing mediadas por inteínas divididas. Este método permite la inmovilización de proteínas funcionales en un entorno poroso e hidratado para aplicaciones biotecnológicas.

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Los autores desean agradecer al Dr. David Tirrell (Caltech), por su amable donación del plásmido pQE9 AC 10 ATRP 12, el Dr. Tom Muir (Universidad de Princeton) por su amable donación del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japón) por su amable donación del plásmido pET30-cuta-Tip1 10, y el Dr. Jay D. Keasling (UC Berkley) por su amable donación del plásmido pJD757 13 . Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias CARRERA, EE.UU. Fuerza Aérea YIP y Programa de Investigación Avanzada Hackman Norman.

1. Construcción de plásmidos NOTA: Todos los genes fueron amplificados bajo reacciones de PCR utilizando Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa según las especificaciones del fabricante. Los cebadores usados ​​para la clonación se han descrito anteriormente 9. Todos los constructos se enumeran en la Tabla 1. <ol><li> Para generar Cuta-NpuN (N, Tabla 1): <ol><li> Amplificar por PCR los genes Cuta y NpuN de plásmidos pET30-cuta-Tip1 10 y kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados. </li><li> Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y una etiqueta 6xHistidine C-terminal para generar N (Figura 2A). </li></ol></li><li> Para generar NPUC-S-cuta (C, Tabla 1): <ol><li> PCR amplificar NPUC, Cuta y S fragmentaciónt [AG 3 (PEG)] 10 del plásmido kanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-cuta-Tip1 10 y pQE9 AC 10 ATRP 12, respectivamente, utilizando los cebadores apropiados. </li><li> Digerir estos fragmentos con las enzimas de restricción apropiadas y secuencialmente insertar estos fragmentos en el vector pET26b entre el promotor T7 y un 6xHistidine C-terminal para generar C (Figura 2B). </li></ol></li><li> Para generar NPUC-S-SH3 lig-cuta (lig C-SH3, Tabla 1): <ol><li> Amplificar por PCR utilizando cebadores Cuta contienen un lig SH3 (PPPALPPKRRR) y un conector flexible (GGGGS) 2 para generar un fragmento SH3 lig-cuta. </li><li> Vuelva a colocar el gen Cuta de C con el fragmento SH3 lig-cuta. </li></ol></li><li> Para generar SH3-GFP (Tabla 1): <ol><li> Amplificar el gen SH3 del plásmido pJD757 13 utilizando elcebadores apropiados. </li><li> Fusible este fragmento con el gen GFP y la inserta en el vector pET26b entre el promotor T7 (Figura 2 C) y una etiqueta 6xHistidine C-terminal. </li></ol></li></ol> 2. Expresión de Proteínas <ol><li> Transformar 50 l de químicamente competente de Escherichia coli BL21 (DE3) con el plásmido de expresión apropiado. </li><li> Después de la transformación, en serie diluir estas células, y la placa de ellos en medio Luria-Bertani (LB) / placas de agar que contienen 50 mg / ml de kanamicina. </li><li> Incubar las placas que contienen células transformadas a 37 ° C durante ~ 15 horas. </li><li> Después de la incubación, recoger una placa que contiene 50 a 100 colonias y volver a suspender todas las colonias en 5 ml de caldo LB. </li><li> Suspensión de transferencia a 1 L de caldo LB que contenía kanamicina (50 mg / ml) y crecer las células a 37 ° C con agitación a 250 rpm. Supervisar la absorbancia a 600 nm (OD 600). Cultive hasta OD 600 ~ 0,8. <ol><li> Para C y C-SH3 LIG, inducir la expresión de la proteína mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo (1 mM de concentración final) y se incuba el cultivo a 37 ° C durante 4 horas mientras se agitaba a 250 rpm. </li><li> Para N y SH3-GFP, enfriar la cultura a ~ 18 ° C por inmersión del matraz de cultivo en un baño de agua con hielo durante ~ 5 min. Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG al cultivo (concentración final 1 mM) y se incuba el cultivo a 18 ° C durante 14-18 horas con agitación a 250 rpm. </li></ol></li><li> Después de la expresión de proteínas, centrifugar el cultivo a 6000 xg durante 20 min a 4 ° C para recoger el sedimento. Sedimento celular Almacenar a -80 ° C hasta su uso. </li></ol> 3. Protein Purification <ol><li> Purificación de N (condiciones de desnaturalización) <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares en tampón A (Tabla 2) en 10 ml / g de sedimento húmedo. </li><li> Immerse la suspensión de pellets en un baño de hielo-agua y romper las células por sonicación (Amp 10, con 1 pulso segundos y 6 segundos de pausa durante 1 min). </li><li> Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en Tampón de DA (que contiene 8 M de urea) y se centrifuga la suspensión a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Pasar el sobrenadante a través de un 5 ácido Ni-nitrilotriacético ml (NTA) columna previamente equilibrada con tampón DA. </li><li> Lavar la columna con 30 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de Tampón DA suplementado con imidazol 150 mM. </li><li> Reducir la concentración de urea en la muestra de proteína a &lt;1 mM ya sea por uno de los siguientes métodos dados en 3.1.7.1 o 3.1.7.2: <ol><li> Se dializa la proteína en tampón DPBS (Tabla 2) a 4 ° C durante la noche utilizando tubos con &lt;20 kDa de corte. </li><li> Centrífuga purificado proteínas en un 30 &amp; #160; columna de centrifugación de ultra-filtración kDa a 2800 xg, 4 ° C hasta que el volumen es menos de 1 ml. Añadir tampón de 14 ml de DPBS a la columna para diluir la muestra de proteína. Repetir la centrifugación / dilución pasos tres veces más. </li></ol></li><li> Después de intercambio de tampón, añadir ditiotreitol (DTT) a la proteína purificada (final de 2 mM) y concentrado de proteína de ~ 100 mg / ml mediante centrifugación a través de una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa a 2800 xg, 4 ° C. </li><li> Alícuota de la proteína concentrada y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Purificación de C y C-SH3 lig (condición nativa) <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares en tampón B (pH 6,0) (Tabla 2) suplementado con 1x cóctel inhibidor de proteasa a 10 ml / g de sedimento húmedo. Utilizar una solución tampón ácida para minimizar la degradación proteolítica de la proteína diana. </li><li> Disrupt suspensión celular por sonicación como se describe en 3.1.2. Centrifugar las Lyscomió a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y mantener el sobrenadante. </li><li> Pasar el lisado soluble a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente con tampón B. </li><li> Lavar la columna con Tampón B suplementado con imidazol 45 mM, y eluir la proteína diana en 20 ml de tampón B complementado con imidazol 150 mM. </li><li> Para C, vaya al paso 3.2.6. Para C-SH3 lig, llevar a cabo un paso adicional de purificación de intercambio iónico para eliminar la proteína parcialmente degradado como se indica en los pasos 3.2.5.1 a 3.2.5.3 <ol><li> Reducir la concentración de NaCl en C-SH3 LIG a &lt;1 mM siguiendo el procedimiento descrito en 3.1.7. </li><li> Carga de la proteína diana en una columna de matriz de 5 ml de aniones de cuentas intercambiador de agarosa previamente equilibrada con tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,0). </li><li> Proteína diana eluyen de la columna mediante la ejecución de un gradiente de una solución que contenía Tris-HCl 10 pH 8,0 Buffer para una solución que contiene el mismo tampón suplementado con 1 M de NaCl. Tomar muestras durante la elución de proteínas y las muestras de la piscina con la más alta pureza basado en sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). </li></ol></li><li> Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS, como se describe en 3.1.7. </li><li> Añadir DTT a la proteína purificada (concentración final 2 mM) y concentrar la proteína a ~ 100 mg / ml utilizando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8. Alícuota y almacenar concentrados de proteínas a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> La purificación de SH3-GFP <ol><li> Resuspender los sedimentos celulares usando tampón A a 10 ml / g de sedimento húmedo. </li><li> Interrumpir la suspensión de pellets por sonicación como se describe en 3.1.2. </li><li> Centrifugar el lisado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante. </li><li> Pasar el sobrenadante (lisado soluble) a través de una columna de 5 ml de Ni-NTA equilibrada previamente conTampón A. </li><li> Lavar la columna con 30 ml de tampón A suplementado con imidazol 45 mM. Eluir la proteína purificada utilizando 20 ml de tampón A suplementado con imidazol 150 mM. </li><li> Intercambio de tampón de la proteína purificada en tampón DPBS usando un enfoque similar al que se describe en 3.1.7 y concentrar la proteína a ~ 150 mg / ml usando una columna de centrifugación de ultra-filtración 30 kDa como se describe en 3.1.8. </li><li> Alícuota y almacenar la proteína purificada a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> El análisis de SDS-PAGE de muestras purificadas que contienen CUTA <ol><li> Diluir cada proteína purificada en agua doblemente destilada para reducir la concentración de NaCl a ~ 1 mM. A esta concentración de NaCl, la mayor parte de las proteínas trímeros CUTA ejecutar como monómeros en los geles de SDS-PAGE. </li><li> Mezclar muestras con 2x tampón de muestra SDS (0,5 M de Tris-HCl, pH 6,8, 20% de glicerol, 10% w / v de SDS, 0,1% w / v-bromo fenol azul, 2% β-mercaptoetanol), se incubaron a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Cargue el sammuestras en un gel de SDS-PAGE al 12%. Llevar a cabo la electroforesis a un voltaje constante de 200 V durante ~ 50 min. </li><li> Observar la proteína en los geles mediante tinción con azul brillante de Coomassie R250 siguiendo los protocolos estándar (Figura 1C). </li></ol></li></ol> 4. Formación de hidrogel NOTA: los hidrogeles de muestras hechas en este estudio contienen 1,6 mM de cada bloque de construcción de hidrogel a menos que se indique lo contrario. Esta concentración de proteína se obtiene un hidrogel suave y estable. PRECAUCIÓN: La azida de sodio (NaN3) se añade al hidrogel hasta una concentración final de 0,5% w / v para evitar la contaminación bacteriana. NaN 3 es altamente tóxica y debe manejarse con sumo cuidado, como se indica en la Hoja de Datos de Seguridad. <ol><li> Calcular el volumen de cada una de las proteínas concentradas necesarios para alcanzar una concentración final de 1,6 mM en un hidrogel 100 l de muestra. Por ejemplo: Concentración de N:100 mg / ml Peso molecular de N: 26,3 kDa (consulte la Tabla 1) Concentración 100 l deseado:: Volumen deseado 1,6 mM <img alt="" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" src="/files/ftp_upload/51202/book.JPG" width="600" /></li><li> Para hacer un hidrogel 100 l (1,6 mM), mezclar C (x l, volumen calculado de acuerdo a 4,1) con 5% de NaN 3 (10 l), 100 mM de DTT (5 l) y N (Y l, volumen calculado según 4.1) dentro de un vial de vidrio de 2 ml. </li><li> Añadir tampón DPBS ((85 - x - y) l) al vial para alcanzar un volumen final de 100 l, y mezclar manualmente todos los componentes a través de un movimiento de torbellino usando una punta de pipeta. Nota: La solución se vuelve muy viscoso tras la mezcla. </li><li> Centrifugar la mezcla durante 2 min a 8000 xg para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Incubar la mezcla a la habitacióntemperatura durante la noche para permitir que la reacción inteína trans-empalme para llegar a la terminación. Confirme la formación del hidrogel por sonda girando al revés. Las proteínas no fluirá si se forma un hidrogel. </li><li> Estimar el rendimiento inteína trans-empalme mediante la comprobación de muestras (0,5 mu l cada uno) recogidos antes del paso 4.2 y después de la etapa 4.5 en un gel de SDS-PAGE, como se describe en 3.4 (Figura 1C). </li></ol> 5. La inmovilización de las buenas prácticas agrarias a través de proteínas Docking (DP) y la estación de acoplamiento de péptidos (DSP) Interacción <ol><li> Para hacer una 50 l de hidrogel de GFP-funcionalizado (1,2 mM), se combinan C-SH3 LIG (x l, calculado de acuerdo con 4.1) y SH3-GFP (l Y, calculado de acuerdo con 4,1) en una relación molar 1:1 en un 1,7 tubo de microcentrífuga ml y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Añadir 5% NaN 3 (5 l), DTT 100 mM (2,5 l), (42,5 - x - &lt;em&gt; y) mu l DPBS al mismo tubo. Añadir N (Y l, calculado de acuerdo a 4,1) para alcanzar una relación molar 1:1 de N y C-SH3 LIG. Mezclar la muestra mediante el uso de una punta de pipeta por un movimiento giratorio. </li><li> Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Un hidrogel encapsular formas SH3-GFP durante la incubación. </li></ol> 6. El uso de 1,6 mM de hidrogel como un andamio para la inmovilización reacción enzimática en Disolvente orgánico <ol><li> Utilice el HRP como enzima modelo. Preparar una solución madre de HRP (28 mg / ml o 0,63 mM) en DPBS. </li><li> Para hacer una 30 l de hidrogel (1,6 mM) atrapando HRP, combinan C (x l, calculado de acuerdo con 4.1) con HRP (2 l), 5% de NaN 3 (3 l) y DTT (1,5 l de 100 mM) dentro de un tubo de centrífuga de 1,7 ml. </li><li> Añadir N (y &lt;/ Em&gt; l, calculado de acuerdo con 4.1) y DPBS (23,5 - x - y) l. Mezclar con una punta de pipeta con un movimiento giratorio. </li><li> Centrifugar la mezcla a 8000 xg durante 2 min y se incuba a temperatura ambiente durante la noche. PRECAUCIÓN: los regentes utilizados para el siguiente ensayo de actividad son altamente tóxicos. Utilice las recomendaciones de seguridad específicas de las correspondientes fichas de datos de seguridad de materiales. </li><li> Para la reacción enzimática, sumergir el hidrogel en 1 ml de cóctel de reacción que contiene N, diamina N-dimetil-p-fenileno (5,8 mM), fenol (5,8 mM) e hidroperóxido de terc-butilo (2,9 mM) en n-heptano 14. Interrumpir manualmente el gel usando una punta de pipeta para aumentar el área de superficie de contacto del hidrogel y el disolvente. </li><li> Detectar producto HRP, un tinte de tipo indofenol, mediante la medición de la absorbancia óptica de las muestras tomadas en diferentes momentos a 546 nm en un lector de placas (Figura 5). </li> &lt;/ Ol&gt;

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</ol>

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En este trabajo, hemos demostrado la síntesis de una gran estabilidad de hidrogel de proteína intein mediada. El uso de una fracción de inteína permite el hidrogel que se forme condicionalmente en respuesta a la mezcla de dos componentes en fase líquida. En concreto, la división inteína covalente une dos bloques de construcción en fase líquida a través de una reacción de trans-empalme, produciendo una unidad polipéptido flanqueada por unidades de reticulación que a su vez auto se ensambla en un hidrogel. La for...

Los hidrogeles hechos enteramente de las proteínas tienen el potencial para avanzar significativamente campos tan diversos como la ingeniería de tejidos, la administración de fármacos y biofabricación 1. Ofrecen ventajas sobre hidrogeles poliméricos sintéticos tradicionales, incluyendo la biocompatibilidad y el potencial para apoyar de forma no invasiva la incorporación de proteínas globulares bioactivos. En este trabajo se describe el desarrollo de una novela de hidrogel de proteína formada por una reacción de trans-empalme proteína dividida intein mediada y su aplicación como un andamio inmovilización de proteínas (Figura 1). Los bloques de construcción para este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína que comprenden cada uno el fragmento N-o C-terminal de una fracción de intein (EN e IC) y una subunidad de una proteína multimérica reticulante. La inteína DnaE de Nostoc punctiforme (Npu) se utilizó como la división inteína 2,3 y una pequeña proteína trimérica (12 kDa) CUTA de Pyrococcus horikoshii &lt;/ Em&gt; se utilizó como 4,5 proteína reticulante. Diferentes agentes de reticulación se unen a través de reacción de trans-empalme inteína catalizada, lo que lleva a la formación de una red de proteínas altamente reticulado (hidrogel). Inteína Npu fue elegido debido a su cinética de reacción rápida (t 1/2 = 63 seg) y alto rendimiento trans-empalme (cerca del 80%) 2,3. La proteína CUTA fue elegido como el agente de reticulación debido a su alta estabilidad. Trímeros CUTA tienen una temperatura de desnaturalización de cerca de 150 ° C y conservan la estructura cuaternaria trimérica en soluciones que contienen tanto como 5 M hidrocloruro de guanidina 4,6. Desde intercambio de subunidades entre diferentes agentes de reticulación es un contribuyente importante de la erosión de la superficie de hidrogel física 7, la fuerte interacción entre la subunidad de Cuta debería desalentar este tipo de intercambios de subunidades, lo que lleva a un hidrogel más estable. Uno de estos bloques de construcción también contiene un péptido S-fragmento altamente hidrofílico como la mitad de la cuadra para facilitar aguaretención 8. La mezcla de los dos bloques de construcción de hidrogel inicia una reacción de trans-empalme entre el EN y IC inteína fragmentos, la generación de una cadena de polipéptido más largo con agentes de reticulación en ambos terminales. Los reticulantes de múltiples tales unidades moleculares interactúan entre sí, formando una red de hidrogel altamente reticulado (Figura 1A). Una &quot;estación de acoplamiento de péptidos&quot; específica (DSP) se incorpora en uno de los bloques de construcción de hidrogel para facilitar la inmovilización estable de una &quot;proteína de acoplamiento&quot; (DP)-etiquetados proteína diana en el hidrogel. El uso de una fracción de inteína para mediar el ensamblaje de hidrogel no sólo proporciona una flexibilidad adicional para la síntesis de hidrogel de proteína, sino que también permite alta densidad, una carga uniforme de la proteína diana a través de todo el hidrogel, como las proteínas diana se cargan antes de la formación de hidrogel. La proteína de hidrogel intein mediada es altamente Stables en solución acuosa con poca o ninguna erosión detectable después de 3 meses a temperatura ambiente. Estabilidad es retenido en una amplia gama de pH (6-10) y temperaturas (4-50 ° C), y el hidrogel también es compatible con disolventes orgánicos. Este hidrogel se usa para la inmovilización de dos proteínas globulares: la proteína fluorescente verde (GFP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP). Hidrogel atrapando la última proteína se utiliza para realizar la biocatálisis en un disolvente orgánico.

<table><tbody><tr><td> Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad </td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td> </td></tr><tr><td> Competente Escherichia coli BL21 (DE3) </td><td>New England BioLabs</td><td>C2527I</td><td> </tr><tr><td> > Luria Bertani </td><td>VWR</td><<td>p>90003-350</td><td> </td></tr><tr><td> Bacto Agar Media </td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>VWR</td><td></td><td> </td></tr><tr><td> IPTG </td><td>VWR</td><<td>p>EM-5820</td><td> </td></tr><tr><td> Imidazol </td><td>VWR</td><<td>p>EM-5720</td><td> </td></tr><tr><td> Urea </td><td>VWR</td><<td>p>EM-9510</td><td> </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td> </td></tr><tr><td> Cóctel de inhibidores de la proteasa </td><td>Roche Applied Science</td><td>11836153001</td><td> </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>VWR</td><<td>p>82020-066</td><td> </td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td>Acros Organics</td><td>A0297990</td><td> </td></tr><tr><td> Sodium Azide </td><td>Fisher</td><td>AC190380050</td><td> Precaución, altamente tóxico </td></tr><tr><td> Rábano picante peroxidasa </td><td>Sigma</td><td>P8125-5KU</td><td> </td></tr><tr><td>N,N-dimetil-p-fenileno diamina</td><td>Fisher</td><td>AC408460250</td><td> Precaución, altamente tóxico </td></tr><tr><td> fenol </td><td>Fisher</td><td>AC149340500</td><td> Precaución, altamente tóxico </td></tr><tr><td>terc-butil hidroperóxido</td><td>Fisher</td><td>AC180340050</td><td> Precaución, altamente tóxico </td></tr><tr><td> n-heptano </td><td>Acros Organics</td><td>120340010</td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">[encabezado]</td></tr><tr><td> Agitador/Incubadora </td><td>Fisher Scientific</td><td>Max Q 6000</td><td> </td></tr><tr><td> Centrífuga </td><td>Sorvall</td><td>RC 6</td><td> </td></tr><tr><td> Sonicator </td><td>QSonica</td><td>Misonix 200</td><td> </td></tr><tr><td> Tubos de ultrafiltración </td><td>Amicon Ultra</td><td>UFC903024</td><td> </td></tr><tr><td> &nbsp; Columna HisTrap de alto rendimiento de </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5248-01</td><td> </td></tr><tr><td> HiTrap SP Columna de intercambio iónico Sepharose FF </td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5156-01</td><td> </td></tr><tr><td> Lector de placas </td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Gemini EM</td><td> </td></tr></tbody></table>

síntesis de una proteína artificial mediada intein hidrogel

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Se presenta la síntesis de un hidrogel altamente estable de proteínas mediada por una reacción de trans-empalme proteína dividida inteína catalizada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de bloque de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. Una bobina al azar altamente hidrófilo se inserta en uno de los copolímeros de bloque para la retención de agua. La mezcla de los dos copolímeros de bloques de proteína desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido con agentes de reticulación en cada extremo que rápidamente se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es muy estable bajo condiciones ácidas y básicas, a temperaturas de hasta 50 ° C, y en disolventes orgánicos. El hidrogel rápidamente las reformas después de la ruptura inducida por cizalla. La incorporación de una &quot;estación de acoplamiento peptídico&quot; en el bloque de construcción de hidrogel permite la incorporación conveniente de &quot;proteína de acoplamiento&quot;-etiquetados proteínas diana.El hidrogel es compatible con el medio de crecimiento de cultivo de tejidos, apoya la difusión de moléculas de 20 kDa, y permite la inmovilización de proteínas globulares bioactivos. La aplicación del hidrogel de proteína mediada por inteína-como un biocatalizador compatible con disolventes orgánicos se demostró mediante la encapsulación de la enzima peroxidasa de rábano picante y corroborar su actividad.

Un esquema para la formación de hidrogel de proteína intein mediada se presenta en la Figura 1A. Los bloques de construcción de hidrogel son la proteína copolímeros Cuta-NpuN (N) y NPUC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabla 1). NpuN / C son las N-/C-fragments del DnaE dividir naturalmente inteína de Nostoc punctiforme (Npu). Cuta es una proteína trimérica estable de Pyrococcus horikoshii 4,5. La mezcla de purificado N y C en la presencia del agente reductor TDT induce la form...

Se presenta la síntesis de un hidrogel de proteína dividida intein mediada. Los bloques de construcción de este hidrogel son dos copolímeros de proteína conteniendo cada uno una subunidad de una proteína trimérica que sirve como un agente de reticulación y una media de un intein dividida. La mezcla de los dos copolímeros de proteínas desencadena una reacción de trans-empalme inteína, produciendo una unidad de polipéptido que se auto-ensambla en un hidrogel. Este hidrogel es altamente pH y temperatura estable, compatible con disolventes orgánicos, y fácilmente incorpora proteínas globulares funcionales.

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar un hidrogel de proteína altamente estable que pueda utilizarse como andamiaje general para la inmovilización de proteínas. Esto se logra primero sintetizando dos bloques estructurales de hidrogel proteico en un huésped bacteriano. Cada bloque estructural contiene una subunidad de una proteína quimérica que actúa como agente de reticulación y una mitad de la ena dividida NPU.Estas proteínas se purifican luego mediante cromatografía de afinidad en el segundo paso. Los bloques de construcción proteicos purificados se mezclan, iniciando reacciones de transespliceo que reconstituyen un polipéptido autoensamblable flanqueado por entrecruzadores, lo que desencadena la formación de un hidrogel. Este hidrogel es altamente estable en solución mediante la incorporación de un motivo de unión adecuado en el bloque proteico.Los copolímeros permiten la incorporación conveniente y específica en sitios determinados de proteínas funcionales en los bloques constitutivos del hidrogel, lo que resulta en la formación de un hidrogel que inmoviliza proteínas; las proteínas inmovilizadas exhiben una baja tasa de lixiviación durante tres semanas a temperatura ambiente. Finalmente, las enzimas inmovilizadas en este hidrogel proteico están protegidas frente a la desnaturalización por disolventes orgánicos. Por lo tanto, este hidrogel también puede servir como un biorreactor para la síntesis orgánica.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para la inmovilización estable de proteínas, incluidos aquellos que implican entrecruzamiento en superficie, unión con andamios sólidos, encapsulación de enzimas en soportes porosos o entrecruzamiento interenzimático, es la capacidad de inmovilizar establemente proteínas diana en un entorno poroso y altamente hidratado sin necesidad de realizar modificaciones quím游戏副本as en las cadenas laterales de la proteína. Esta tecnología también permite el ensamblaje de múltiples enzimas dentro de una vía metabólica en una disposición tridimensional predeterminada que podría facilitar el canalización de sustratos entre enzimas. Antes de comenzar este procedimiento, genere los dos copolímeros proteicos N y C mediante la construcción de plásmidos por tecnologías de ADN recombinante, seguida de la expresión proteica y purificación en *E. coli* B 21 de tres a cinco, y resuspenda los pellet celulares en tampón A a 10 mililitros por gramo de pellet húmedo.Luego, sumerja la suspensión del pellet en un baño de hielo y agua y rompa las células mediante sonicación a 10 amperios con un pulso de un segundo y una pausa de seis segundos durante un minuto. Centrifugue el lisado a 6.000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Después de retirar el tubo del centrifugador, deseche el sobrenadante S y resuspenda el pellet en tampón DA siguiendo la centrifugación usando las mismas condiciones que antes, pasando el sobrenadante a través de una columna de NTA de cinco mililitros previamente equilibrada con tampón DA utilizando un sistema de cromatografía de baja presión.Luego, lave la columna con 30 mililitros de tampón DA suplementado con 45 milimolar de ole. Eluya la proteína purificada utilizando 20 mililitros de tampón DA suplementado con 150 milimolar de ole. Transfiera la proteína purificada a un tubo de centrífuga que contenga una columna de ultrafiltración centrífuga de 30 kilodalton. Centrifugue la muestra a 2.800 × g y 4 grados Celsius hasta que el volumen sea inferior a un mililitro.Una vez finalizado, agregue 14 mililitros de tampón DPBS a la columna para diluir la muestra de proteína. Repita los pasos de centrifugación y dilución otras tres veces tras el intercambio de tampón, y agregue DTT a la proteína purificada para obtener una concentración final de dos milimolar. A continuación, concentre la proteína hasta aproximadamente 100 miligramos por mililitro mediante centrifugación a través de una columna de ultrafiltración centrífuga de 30 kilodalton a 2.800 × g a cuatro grados Celsius durante aproximadamente 45 minutos a una hora.Para preparar una mezcla de hidrogel de 100 microlitros, combine 42 microlitros de una solución stock de C al 100 miligramos por mililitro con 10 microlitros de azida sódica al 5%, cinco microlitros de DTT 100 milimolar y 42 microlitros de una solución stock de N al 100 miligramos por mililitro. En un vial de vidrio de dos mililitros, añada un microlitro de tampón DPBS al vial para alcanzar un volumen final de 100 microlitros y mezcle manualmente todos los componentes mediante un movimiento giratorio usando la punta de una pipeta. Tras centrifugar la mezcla durante dos minutos a 8.000 × g, incúbela a temperatura ambiente durante la noche para permitir que la reacción de transespliceo ENE se complete. A continuación, confirme la formación del hidrogel invirtiendo el tubo para obtener 50 microlitros de un hidrogel funcionalizado con GFP 1,2 milimolar.Combine 17 microlitros de una solución stock que contiene 100 miligramos por mililitro del ligando CSH tres y nueve microlitros de una solución de SH 3G FP al 230 miligramos por mililitro en una relación molar uno a uno en un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros, e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, agregue cinco microlitros de azida sódica al 5%, 2,5 microlitros de DTT 100 milimolar y 0,5 microlitros de DPBS al mismo tubo. Luego, agregue 16 microlitros de N para obtener una relación molar uno a uno de N y el ligando CSH tres y mezcle la muestra mediante un movimiento giratorio usando la punta de una pipeta; centrifugue la mezcla a 8.000 × g durante dos minutos.Una vez finalizado, incubar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche, al resguardo de la luz, para formar un hidrogel e inmovilizar la SH 3G FP. Para una aplicación adicional, preparar una solución stock de 0,63 milimolar de peroxidasa de rábano picante HRP en DPBS para obtener 30 microlitros de un hidrogel de 1,6 milimolar e inmovilizar HRP; combinar 12 microlitros de una solución stock de 100 miligramos por mililitro de C con dos microlitros de HRP, tres microlitros de azida sódica al 5 % y 0,5 microlitros de DTT 300 milimolar en un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros. Añadir 12 microlitros de una solución de 100 miligramos por mililitro de N y 0,5 microlitros de DPBS, y mezclar la solución mediante un movimiento giratorio usando una punta de IPE. Tras centrifugar la mezcla a 8.000 × g durante dos minutos, incubarla a temperatura ambiente durante la noche.Para la reacción enzimática, sumerja el hidrogel en un mililitro de una mezcla de reacción que contiene 5,8 milimolar de NN-dimetil PPH fenol diamina, 5,8 milimolar de fenol y 2,9 milimolar de hidroperóxido de terc-butilo en n-heptano; interrumpa manualmente el gel utilizando la punta de una pipeta para aumentar el área de superficie de contacto entre el hidrogel y el disolvente. Detecte el producto de la HRP y el tinte tipo indofenol tomando muestras del disolvente en diferentes momentos y midiendo la absorbancia óptica a 546 nanómetros en un lector de placas. La mezcla de N y C purificadas en presencia del agente reductor DTT induce la formación de una tercera proteína, el producto ligado J individualmente. Los bloques constitutivos del hidrogel n NC existen como fluidos viscosos; la mezcla de n NC produce un material semisólido transparente que se mantiene en el fondo de un vial de vidrio tras la inversión, lo que indica la formación de un hidrogel.Este hidrogel proteico mediado por ene presenta una alta estabilidad en solución. No se observa pérdida, o apenas una pérdida mínima, del andamiaje de hidrogel reticulado tras 21 días a 22 grados Celsius en tampón DPBS. Dado que la cantidad total de proteína liberada en el tampón DPBS apenas supera ligeramente la cantidad teórica de la ene empalada, la citometría densa reveló que, durante la formación del hidrogel, las reacciones de trans-empalme tuvieron una eficiencia de aproximadamente el 80 %.El análisis por gel SDS-PAGE mostró que solo había cantidades traza del producto transpuesto presente en el tampón que rodea el hidrogel, lo que confirma que la pérdida del andamiaje de hidrogel reticulado debido a la erosión es mínima. La proteína principal presente en el tampón que rodea el hidrogel es la inteína eliminada.No se observaron signos visibles de erosión en un hidrogel no perturbado, sumergido en solución acuosa a temperatura ambiente durante más de tres meses. El hidrogel también es altamente estable a 37 grados Celsius y en tampones ácidos y básicos. Para facilitar la inmovilización de proteínas, se utilizó una proteína y su ligando peptídico para anclar proteínas de interés en el andamiaje del hidrogel.Seleccionamos la proteína SH3, un dominio de homología SAR tres del proteína adaptadora CRK, como la proteína de anclaje para la fusión a una proteína de interés, y su ligando como el péptido de estación de anclaje para su incorporación en el andamiaje de hidrogel. Este par de interacción fue seleccionado debido a su tamaño molecular relativamente pequeño y su alta afinidad. El ligando SH3 fue insertado entre NPUC y cutA para formar CSH3 ligando.La proteína S SH tres fue fusionada al extremo terminal de una proteína globular modelo, GFP. El proceso descrito en el protocolo produce un hidrogel que contiene 1,2 milimolares de bloques de construcción del armazón del hidrogel con empalme trans y 1,2 milimolares de GFP. El hidrogel que contenía GFP mostró una estabilidad similar a la del hidrogel sin GFP, con una pérdida total de proteína de aproximadamente el 35 % tras 21 días.En el tampón DPBS, la mayoría de las proteínas presentes en el tampón de erosión fueron escindidas en las proteínas enzimáticas. La lixiviación de SH 3G FP desde un hidrogel que contiene el ligando S SH tres es de aproximadamente el 30 % después de tres semanas, significativamente menor que la de un hidrogel que carece del ligando s sh tres, como se observa aquí en el hidrogel que contiene el péptido de la estación de acoplamiento. El ligando S SH tres retiene la mayor parte de la fluorescencia de GFP.Después de tres semanas, mientras que el hidrogel que carece del ligando SSH tres se vuelve esencialmente no fluorescente. La densidad de GFP inmovilizada en este trabajo es aproximadamente del 33 por ciento molar del hidrogel. Una densidad de inmovilización más alta podría lograrse potencialmente cuando se incorporan múltiples péptidos de estación de acoplamiento en el bloque constitutivo del hidrogel.A continuación, la enzima HRP se incorporó al hidrogel proteico para demostrar su capacidad de soportar biocatalizadores en disolventes orgánicos. La actividad enzimática se midió mediante el seguimiento del acoplamiento oxidativo de la NN-dimetil-pfenilendiamina y el fenol con peróxido de terbutilo a lo largo del tiempo. La hipótesis era que el entorno hidratado del hidrogel protegería a la enzima unida de los efectos desnaturalizantes del disolvente orgánico.Después de sumergir un disolvente orgánico, el hidrogel que contenía HRP se desintegró manualmente en pequeños agregados para aumentar el área de la interfase hidrofílica-hidrofóbica. El HRP incorporado en el hidrogel catalizó eficazmente la reacción rápida de oxidación, dando lugar a un producto colorimétrico. La acumulación del producto sigue una pendiente lineal, lo que indica poca o ninguna inactivación enzimática.Durante el experimento, la HRP disuelta en A-D-P-B-S primero, seguida por la adición al disolvente orgánico, fue capaz de catalizar la conversión, pero a una velocidad de reacción mucho menor. La baja velocidad de conversión de las enzimas disueltas en DPBS se debe probablemente al pequeño área interfacial entre el DPBS y el disolvente orgánico, lo que limita la velocidad de difusión del sustrato y del producto. La incorporación del fragmento s altamente hidrofílico en la estructura del hidrogel, que atrapa eficazmente el agua dentro del hidrogel y evita que el disolvente orgánico acceda al interior del hidrogel, permite que el hidrogel resista el efecto desnaturalizante del disolvente orgánico.Estos resultados indican que el hidrogel proteico mediado por ene puede ser un andamiaje eficaz para reacciones enzimáticas en disolvente orgánico. La flexibilidad estructural y la alta estabilidad de este hidrogel autoensamblable permiten su uso no solo en proteínas y movilización, sino también en otras aplicaciones, incluyendo celdas de combustible biológicas, sistemas inyectables de entrega de fármacos y andamiajes para ingeniería de tejidos.

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Bioengineering

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