Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar un hidrogel proteico altamente estable que pueda utilizarse como andamio general para la inmovilización de proteínas. Esto se logra sintetizando primero dos bloques de construcción de hidrogel de proteínas en un huésped bacteriano. Cada bloque de construcción contiene una subunidad de una proteína quimérica que sirve como reticulante y la mitad del eno dividido de la NPU.

A continuación, estas proteínas se purifican mediante cromatografía de afinidad en el segundo paso. Los bloques de construcción de proteínas purificadas se mezclan, iniciando reacciones de empalme trans adolescente que constituyen un polipéptido autoensamblable flanqueado por reticulantes que desencadenan la formación de hidrogel. Este hidrogel es altamente estable en la incorporación en solución de un motivo de unión apropiado en el bloque de proteínas.

Los copolímeros permiten la incorporación conveniente de proteínas gulares funcionales en los bloques de construcción del hidrogel, lo que resulta en la formación de un hidrogel, que inmoviliza las proteínas. Las proteínas gulares inmovilizadas exhiben una baja tasa de lixiviación durante tres semanas a temperatura ambiente. Por último, las enzimas inmovilizadas en este hidrogel proteico están protegidas de la desnaturalización por disolventes orgánicos. Por lo tanto, este hidrogel también puede servir como biorreactor para la síntesis orgánica.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes para la inmovilización de proteínas estables, incluidos los que implican la reticulación de la superficie LI o el canto con los andamios sólidos, la encapsulación de enzimas en soportes porosos o la reticulación interenzimática es la capacidad de inmovilizar de manera estable las proteínas objetivo en un entorno poroso y altamente hidratado sin ninguna modificación química de la cadena lateral de la proteína. Esta tecnología también permite el ensamblaje de múltiples enzimas dentro de una vía en una disposición tridimensional predeterminada que puede facilitar la canalización del sustrato entre las enzimas. Antes de iniciar este procedimiento, genere los dos copolímeros de bloque proteico N y C mediante la construcción de plásmidos mediante tecnologías de ADN recombinante seguidas de expresión de proteínas y REIA coli B 21 de tres para purificar y resuspender los gránulos celulares en el tampón A a 10 mililitros por gramo de gránulo húmedo.

A continuación, sumerja la suspensión de pellets en un baño de agua helada e interrumpa las células mediante sonicación a 10 amperios con un pulso de un segundo y una pausa de seis segundos durante un minuto cuando termine. Centrifugar el lisado a 6.000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el tubo de la centrífuga, desechar el sobrenadante S y volver a suspender el pellet en tampón DA después de la centrifugación en las mismas condiciones que antes, pasar el sobrenadante a través de una columna de NTA de cinco mililitros previamente equilibrada con tampón DA utilizando un sistema de cromatografía de baja presión.

A continuación, lavar la columna con 30 mililitros de tampón DA suplementado con 45 milimolares ole elute, la proteína purificada utilizando 20 mililitros de tampón DA suplementado con 150 milimolares ole. Transfiera la proteína purificada a un tubo de centrífuga que contiene una columna de centrifugación de ultrafiltración de 30 kilodalton. Centrifugar la muestra a 2.800 veces G y cuatro grados Celsius hasta que el volumen sea inferior a un mililitro.

Cuando termine, agregue 14 mililitros de tampón DPBS a la columna para diluir la muestra de proteína. Repita los pasos de centrifugación y dilución tres veces más después del intercambio de tampón, agregue DTT a la proteína purificada para obtener una concentración final de dos milimolares. A continuación, concentre la proteína a unos 100 miligramos por mililitro mediante centrifugación a través de una columna de centrifugación de ultrafiltración de 30 kilodalton a 2.800 veces G a cuatro grados Celsius durante aproximadamente 45 minutos a una hora.

Para hacer una mezcla de hidrogel de 100 microlitros, 42 microlitros de una solución madre de 100 miligramos por mililitro de C con 10 microlitros de azida de sodio al 5%, cinco microlitros de DTT de 100 milimolares y 42 microlitros de una solución madre de 100 miligramos por mililitro de N.In un vial de vidrio de dos mililitros, agregue un microlitro de tampón DPBS al vial para lograr un volumen final de 100 microlitros y mezcle manualmente todos los componentes a través de un Movimiento giratorio con la punta de una pipeta. Después de centrifusionar la mezcla durante dos minutos a 8.000 veces G, incubarla a temperatura ambiente durante la noche para permitir que se complete la reacción de empalme trans ENE. A continuación, confirme la formación de hidrogel girando el tubo al revés para producir 50 microlitros de un hidrogel funcionalizado GFP de 1,2 milimolares.

Combine 17 microlitros de una solución madre que contenga 100 miligramos por mililitro de tres ligandos CSH y nueve microlitros de una solución de 230 miligramos por mililitro de SH 3G FP en una proporción molar de uno a uno en un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros, e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, agregue cinco microlitros de azida de sodio al 5%, 2.5 microlitros de DTT de 100 milimolares y 0.5 microlitros de DPBS al mismo tubo. A continuación, añada 16 microlitros de N para lograr una relación molar de uno a uno de N y CSH tres ligandos y mezcle la muestra mediante un movimiento giratorio con una punta de pipeta, centrifugar la mezcla a 8.000 veces G durante dos minutos.

Cuando termine, incube la mezcla a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad para formar un hidrogel y encapsular SH 3G FP. Para una aplicación adicional, prepare una solución madre de 0,63 milimolares de peroxidasa de rábano picante HRP en DPBS para hacer 30 microlitros de un hidrogel de 1,6 milimolar y HRP atrapante combinado 12 microlitros de una solución madre de 100 miligramos por mililitro de C con dos microlitros de HRP, tres microlitros de azida de sodio al 5% y 0,5 microlitros de DTT de 300 milimolares y un tubo de centrífuga de 1,7 mililitros. Agregue 12 microlitros de una solución de 100 miligramos por mililitro de N y 0,5 microlitros de DPBS y mezcle la solución con un movimiento giratorio con una punta de IPE. Después de centrifusionar la mezcla a 8.000 veces G durante dos minutos, incubarla a temperatura ambiente durante la noche.

Para la reacción enzimática, sumerja el hidrogel en un mililitro de un cóctel de reacción que contenga 5,8 milimolar de NN dimetilPPH fenol diamina, 5,8 milimolar de fenol y 2,9 milimolar de turt butil hidroperóxido en n heptano, interrumpa manualmente el gel con una punta de pipeta para aumentar el área de superficie de contacto del hidrogel y el solvente. Detecte el producto HRP y el colorante de tipo indelfenol tomando muestras del solvente en diferentes momentos y midiendo la absorbancia óptica a 546 nanómetros en un lector de placas mezclando N y C purificados en presencia del agente reductor, DTT induce la formación de una tercera proteína, el producto ligado J individualmente. Los bloques de construcción de hidrogel n NC existen como fluidos viscosos, la mezcla de n NC produce un material semisólido transparente que se retiene en el fondo de un vial de vidrio después de la inversión, lo que indica la formación de un hidrogel.

Este hidrogel proteico mediado por enos exhibe una alta estabilidad en solución. Hay poca o ninguna pérdida de andamio de hidrogel reticulado después de 21 días a 22 grados Celsius en el tampón DPBS. Como la cantidad total de proteína liberada en el tampón DPBS solo supera ligeramente la cantidad teórica del eno empalmado del hidrogel, la citometría densa reveló que durante la formación del hidrogel, las reacciones de empalme trans fueron aproximadamente un 80% eficientes.

análisis del gel de página de SDS mostró que solo había trazas del producto trans empalmado en el tampón circundante de hidrogel. Lo que confirma que la pérdida del andamio de hidrogel reticulado por erosión es mínima. La principal proteína presente en el tampón circundante del hidrogel es el intune empalmado.

No se observaron signos visibles de erosión en un hidrogel inalterado, sumergido en solución acuosa a temperatura ambiente durante más de tres meses. El hidrogel también es muy estable a 37 grados centígrados y tanto en tampones ácidos como básicos. Para facilitar la inmovilización de proteínas, se utilizaron una proteína y su ligando peptídico para acoplar proteínas de interés en el andamio de hidrogel.

Elegimos la proteína SH tres, un dominio de homología SAR tres de la proteína adaptadora CRK como proteína de acoplamiento para la fusión a una proteína de interés y su ligando como péptido de la estación de acoplamiento para su incorporación en el andamio de hidrogel. Este par de interacción fue elegido debido al tamaño molecular relativamente pequeño y la alta finitud de afinidad. Se insertó el ligando S SH tres entre NPUC y el corte A para formar el ligando CSH tres.

La proteína S SH tres se fusionó con el extremo final de una proteína globular modelo GFP. El proceso descrito en el protocolo produce un hidrogel que contiene 1,2 milimolares de bloques de construcción de la columna vertebral de hidrogel trans empalmado y 1,2 milimolares de GFP. El hidrogel que contenía GFP exhibió una estabilidad similar al hidrogel que carecía de GFP, con una pérdida total de proteínas de aproximadamente el 35% después de 21 días.

En el tampón DPBS, la mayoría de las proteínas presentes en el tampón de erosión fueron escindidas en adolescentes. La lixiviación de SH 3G FP de un hidrogel que contiene el ligando S SH tres es de aproximadamente el 30% después de tres semanas, significativamente menor que la de un hidrogel que carece del ligando s sh tres, como se ve aquí hidrogel que contiene el péptido de la estación de acoplamiento. El ligando S SH tres retiene la mayor parte de la fluorescencia GFP.

Después de tres semanas, mientras que el hidrogel que carece de ligando SSH tres se vuelve esencialmente no fluorescente. La densidad de GFP inmovilizada en este trabajo es de aproximadamente el 33 por ciento molar del hidrogel. Potencialmente, se puede lograr una mayor densidad de inmovilización cuando se incorporan múltiples péptidos de la estación de acoplamiento en el bloque de construcción del hidrogel.

A continuación, la enzima HRP se incorporó al hidrogel proteico para demostrar su capacidad para apoyar biocatalizadores en disolventes orgánicos. La actividad enzimática se midió mediante el seguimiento del acoplamiento oxidativo de NN dimetilpph, lene diamina y fenol con turt butil hidroperóxido a lo largo del tiempo. La hipótesis era que el ambiente hidratado del hidrogel protegería a la enzima unida del efecto desnaturalizante del solvente orgánico.

Después de sumergir un solvente orgánico, el hidrogel que contenía HRP se interrumpió manualmente en pequeños grupos para aumentar el área de interfaz hidrofóbica hidrofílica. El hidrogel HRP incorporado catalizó eficazmente la rápida reacción de oxidación dando lugar a un producto colormétrico. La acumulación del producto sigue una pendiente lineal que indica poca o ninguna enzima en activación.

Durante el experimento, HRP disolvió primero A-D-P-B-S seguido de la adición al disolvente orgánico, fue capaz de catalizar la conversión, pero a una velocidad de reacción mucho más reducida. La baja tasa de conversión de las enzimas disueltas en DPBS se debe probablemente a la pequeña área interfacial entre el DPBS y el solvente orgánico, lo que limita la tasa de difusión del producto del sustrato. La incorporación del fragmento s altamente hidrófilo en la columna vertebral del hidrogel, que bloquea eficazmente el agua dentro del hidrogel y evita que el disolvente orgánico acceda al interior del hidrogel, permite que el hidrogel resista el efecto desnaturalizante del disolvente orgánico.

Estos resultados indican que el hidrogel proteico mediado por enos puede ser un andamiaje eficaz para las reacciones enzimáticas en disolventes orgánicos. La flexibilidad estructural y la alta estabilidad de este hidrogel autoensamblable permiten su uso no solo en proteínas y movilización, sino también en otras aplicaciones, incluidas celdas de biocombustible, portadores de administración de medicamentos inyectables y andamios de ingeniería de tejidos.