Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

El objetivo general de los siguientes experimentos es producir de manera eficiente cantidades de miligramos de Miran Kinlin tres y cultivo de células de insectos, que no se pueden producir en otros huéspedes de expresión. Esto se logra mediante el transecto COT, un vector de transferencia KINLIN tres junto con un virus bao diseñado para crear un virus bao recombinante que lleva el gen KINLIN tres. Como segundo paso, el virus se amplifica dentro de las células de los insectos para producir una cantidad suficiente de viriones para los pasos futuros.

A continuación, las células de los insectos se infectan para producir grandes cantidades de la proteína Kinlin tres con el fin de permitirnos la purificación mediante cromatografía líquida rápida. Se obtienen resultados que muestran que la kinlina funcional tres de alta pureza se puede producir en cantidades de miligramos según el análisis de páginas SDS y la cromatografía de exclusión por tamaño. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la activación de la expresión de tres en bacterias, es que la expresión de células de insectos infectadas con virus maculares aumenta diez veces el rendimiento de proteínas recombinantes.

Las nueve células SF para este procedimiento se cultivan y mantienen en suspensión utilizando medios SF 902 suplementados con 100 microgramos por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina. Para la generación del virus bao, las células deben cultivarse en un rango de densidad de cinco veces 10 a cinco a uno por 10 a seis células por mililitro. Para preparar las nueve células SF para la transfección, vea aproximadamente una vez 10 a las seis células por pocillo de una placa de cultivo de tejido estéril de seis pocillos en dos mililitros de medios SF 902 suplementados con penicilina y estreptomicina, deje las nueve células SF durante unos 20 minutos a temperatura ambiente en la campana extractora para que se adhieran a la base de los pocillos de plástico y así se logre la generación de un virus balo recombinante monocapa mediante la transección de plásmido, ADN y ADN BMid en un cultivo monocapa SF nine.

El vector de expresión de la neurona papina de la firma T tres tiene el gen KINLIN de ratón de la firma T tres. Bajo el control del promotor viral P 10 BAO, posee secuencias virales bao flanqueantes para permitir la recombinación con la parte posterior media y codifica una etiqueta de silbido terminal C seis para la purificación posterior, para cada transfección hace de uno a dos microgramos de MFI T purificado tres con 0,5 microgramos de B mid purificado y 100 microlitros de SF 902 SFM sin antibióticos. Esta es la solución A en un tubo separado, diluir seis microlitros de efecto celular en dos reactivos con 100 microlitros de SF 902 SFM sin antibióticos.

Para cada reacción de transfección, se puede crear una mezcla maestra aquí para reducir el manejo de líquidos si se requieren muchos transfectos. Esta es la solución B. Mezcle las dos soluciones A y B usando aproximadamente 200 microlitros de cada una por transfección e incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar complejos de ADN lipídico después de 20 minutos, diluya los complejos de ADN lipídico con 800 microlitros por transfección de SF 902 SFM sin antibióticos. A continuación, aspire con cuidado el medio monocapa SF de nueve celdas y pipetee cuidadosamente la solución AB y la mezcla de medios sobre la monocapa SF nine.

Incubar las células transfectadas en una incubadora humidificada a 27 grados centígrados durante la noche para crear un ambiente humidificado y evitar que las células se sequen. Coloque el plato de seis pocillos en un recipiente de plástico junto con una toalla de papel húmeda. Al día siguiente, agregue un mililitro adicional de SF 900 a SFM sin antibióticos A cada cultivo monocapa, incube las células a 27 grados centígrados durante cinco días más.

Después de cinco días, recoja el virus bao recombinante directamente del medio de cultivo y transfiéralo a un tubo de centrífuga limpio. Clariclar cualquier residuo de celda SF de nueve celdas por centrifugación a 1000 Gs durante cinco minutos. A temperatura ambiente, se puede suponer que el virus, que se encuentra en los supernombres resultantes y se denota como P uno a un tubo limpio, se puede suponer que tiene un título viral esperado de uno por 10 a siete PFU por mililitro.

Aunque se puede realizar una placa SA si es necesario, almacene el stock viral de P one a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que se utilice. Las nueve células SF utilizadas para la amplificación del virus balo recombinante en suspensión deben tener una densidad de 1,4 veces 10 a las seis células por mililitro y el cultivo debe ocupar una vigésima parte del volumen total del matraz. Por ejemplo, 50 mililitros en un matraz de dos litros. En general, para una amplificación óptima del virus vao y la producción de proteínas, la célula SF nueve debe ser de tamaño uniforme y esférica.

Infecte el cultivo de células SF nine con el stock viral P one a una multiplicidad de infección o MOI de 0,1 utilizando la siguiente fórmula. Incubar el cultivo de insectos infectados a 27 grados centígrados con agitación a 100 RPM durante 72 horas. Tres días después, recoja el virus separando las células del medio mediante centrifugación a 1000 Gs durante cinco minutos.

En la transferencia a temperatura ambiente, el medio enriquecido con virus clarificado a un tubo limpio. Este stock viral se denota como P dos y el título viral anticipado es dos veces 10 por 8 PFU por mililitro. Almacene este stock viral a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta su uso, guarde los gránulos de células resultantes a menos 20 grados centígrados para una confirmación posterior de la producción de virus recombinantes.

Para comenzar este procedimiento, cultive un volumen adecuado de nueve cultivos celulares SF en suspensión y SF 902 s fm. Suplementado con 100 microgramos por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina. La relación entre el volumen total de cultivo y el volumen del matraz debe ser de uno a cinco.

Incubar los cultivos en suspensión a 27 grados centígrados con agitación a 100 RPM hasta que alcancen una densidad celular de dos veces 10 a las seis células por mililitro. Cuando los cultivos SF nine están a una densidad de dos veces 10 a las seis células por mililitro, están listos para la infección por el virus balo. Complementar los cultivos con una concentración final de 1% de suero fetal bovino seguido de la cepa viral P dos.

Para obtener un MOI de uno, incube los cultivos infectados a 27 grados centígrados con agitación a 100 RPM 72 horas después de la infección, coseche polihistamina recombinante marcada con tres células que expresan nueve células SF por centrifugación a 1000 GS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Almacene el pellet de celda resultante a menos 20 grados Celsius hasta su uso o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Este procedimiento comienza con la descongelación en hielo.

Los gránulos congelados del virus vao infectaron SF nine que expresan kinlina recombinante tres y Resus suspendiendo los gránulos con tampón de lisis. Después de incubar las células resuspendidas con el tampón de lisis durante cinco a 10 minutos, se agita el vórtice hasta que se logra una suspensión resus homogénea para una mayor disrupción celular. Sonicar la muestra en un baño de hielo.

Clarificar el lisado por centrifugación a 48.000 GS durante una hora a cuatro grados centígrados. Cargue los supernombres resultantes en una columna de trampa hist de cinco mililitros de volumen preequilibrada con tampón de lisis a cuatro grados Celsius a una velocidad de un mililitro por minuto. Los pasos posteriores para la elución de proteínas, el intercambio de tampones y la concentración de proteínas no se demostrarán aquí, pero se detallan en el manuscrito adjunto.

Una vez obtenida la solución proteica de intercambio tampón, aplíquela sobre una columna HP de heparina de alta trampa de alto volumen preequilibrada de cinco mililitros utilizando un FPLC ACTA a una tasa de 0,5 mililitros por minuto. Se alude a la KINLIN tres unida utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio en el mismo tampón que aumenta a una tasa de 10 milimolar por mililitro de etiquetas de histamina recombinantes. Se espera que KINLIN tres eluya alrededor de 0,6 molar cloruro de sodio después de concentrar la proteína, el paso final es intercambiar la proteína mediante cromatografía de exclusión por tamaño, aplicar la proteína purificada en una columna SUEx S 210 30, purificar las proteínas según el tamaño aplicando tampón en la columna a una velocidad de 0,5 mililitros por minuto.

La proteína alusiva de la columna se fracciona y se monitorea utilizando el absorbente a 280 nanómetros. El éxito de la generación de virus recombinante se verificó evaluando la presencia de Kinlin tres recombinantes y las células COT TRANSFECTED SF nine mediante la página SDS y el análisis occidental como se ve en esta sangre occidental representativa de seis cultivos SF nueve a pequeña escala utilizando un anticuerpo anti silbido seis, una banda clara correspondiente a una proteína marcada con silbido de 75 kilodalton fue visible en cada muestra una vez que el virus se había amplificado y utilizado para infectar SF nueve células en experimentos a gran escala. El KINLIN 3 recombinante se purificó parcialmente mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados.

La imagen principal del gel en esta figura muestra la página SDS de la afinidad del níquel purificada con kinlina murina recombinante tres expresada en la proteína absorbida de nueve células SF infectadas con el virus BAO utilizando un gradiente ole que se muestra encima de la imagen del gel. MW indica que el marcador de peso molecular LYS es el lisado de toda la célula, FT es el flujo a través de WI es el lavado uno y WII es el lavado dos. También se realizó un análisis de Western blot utilizando las fracciones de elución para confirmar la presencia de la marca his modificada en la proteína recombinante.

A continuación, el KINLIN 3 parcialmente purificado se purificó aún más hasta casi la homogeneidad mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de heparina. Este panel muestra el perfil eluciano observado a 280 nanómetros en azul, mostrando un solo pico simétrico eludiendo bajo un gradiente lineal de cloruro de sodio indicado en verde, utilizando un rango de concentración de cloruro de sodio de 0.05 molar a 1.0 molar. El panel inferior muestra los resultados del análisis de la página SDS de la elución fraccionada que demuestra la presencia de la proteína Kinlin tres de 75 kilodalton.

Como paso final, se pulió KINLIN three purity mediante cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar los agregados y lograr la homogeneidad. Este perfil representativo de filtración en gel es de Kinlin tres purificado utilizando un SUEx S 200 en Tris HCL pH 7.5 150 milimolar de cloruro de sodio y un milimolar DTT a 20 grados Celsius. Sobre la base del volumen de elución, KINLIN tres migra como se esperaba para una proteína de 75 kilodalton, lo que sugiere que es predominantemente monomérica.

La siguiente figura muestra los resultados de la página SDS de kinlin recombinante purificado altamente concentrado tres etiquetados como K tres a 14,5 miligramos por mililitro. La producción de cantidades de miligramos de kinlin tres de ratón de longitud completa de alta pureza y cultivo de células de insectos permitirá extensos estudios estructurales y análisis bioquímicos de la proteína. En este estudio también se realizó un ensayo de desplazamiento térmico basado en suelo térmico para determinar qué tampones estaban estabilizando para KINLIN tres.

KINLIN 3 se diluyó en varios tampones, que comprenden una pantalla bidimensional del pH frente a la concentración de cloruro de sodio. El panel superior es un histograma 3D de las temperaturas de transición y el panel inferior muestra el cambio en la temperatura de transición desde el promedio calculado de 50,4 grados Celsius. Las barras se colorean según el rango de temperaturas al que corresponden.

Se observó que KINLIN tres era estable a altas concentraciones de cloruro de sodio dentro del rango de PA de 7.0 a 9.0 con una temperatura de transición constante de 55 grados Celsius. También se observó que la temperatura de transición de Kinlin 3 fue de aproximadamente 55 grados Celsius dentro del rango de PA de 7.0 a 7.5. Independientemente de la concentración de cloruro de sodio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir leña recombinante funcional altamente pura. Tres para la caracterización biofísica en profundidad y la investigación posterior. Se pueden utilizar enfoques similares con otras muestras de proteínas difíciles de preparar, y recomendamos su aplicación en tales casos.