Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

El objetivo general de los siguientes experimentos es producir eficientemente cantidades en miligramos de Miran Kinlin tres y cultivo de células de insecto, que no pueden producirse en otros huéspedes de expresión. Esto se logra mediante la transfección simultánea de un vector de transferencia KINLIN tres junto con un baculovirus modificado para crear un baculovirus recombinante que porta el gen KINLIN tres. Como segundo paso, el virus se amplifica dentro de células de insecto para producir una cantidad suficiente de viriones para pasos futuros.

A continuación, se infectan células de insecto para producir grandes cantidades de la proteína Kinlin tres, lo que permite su purificación mediante cromatografía líquida rápida. Los resultados obtenidos demuestran que se puede producir kinlin tres funcional con alta pureza en cantidades del orden de miligramos, según el análisis por SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la expresión de kindling tres en bacterias, es que la expresión en células de insecto infectadas con virus baculovírico incrementa el rendimiento de proteína recombinante en un factor de diez.

Las células SF nine para este procedimiento se cultivan y mantienen en suspensión utilizando medio SF 902 suplementado con 100 microgramos por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina. Para la generación del virus bao, las células deben cultivarse hasta alcanzar un rango de densidad de cinco veces 10 a la cinco hasta una vez 10 a la seis células por mililitro. Para preparar las células SF nine para la transfección, siembre aproximadamente una vez 10 a la seis células por pocillo en una placa de cultivo celular estéril de seis pocillos con dos mililitros de medio SF 902 suplementado con penicilina y estreptomicina; deje las células SF nine durante unos 20 minutos a temperatura ambiente en la campana extractora para que se adhieran a la base de los pocillos de plástico y formen así una monocapa. La generación del virus balo recombinante se logra mediante la cotransfección de ADN plasmídico y ADN BMid en un cultivo monocapa de células SF nine.

El vector de expresión papina neurona firm T tres contiene el gen murino KINLIN tres firm T tres. Bajo el control del promotor viral P 10 BAO, posee secuencias virales BAO flanqueantes que permiten la recombinación con el bacmid, y codifica una etiqueta hiss seis en el extremo C-terminal para la purificación posterior. Por cada transfección, se preparan uno a dos microgramos de MFI T tres purificado con 0,5 microgramos de bacmid purificado y 100 microlitros de SF 902 SFM sin antibióticos. Esta es la solución A. En un tubo separado, diluya seis microlitros del reactivo cell effect en dos con 100 microlitros de SF 902 SFM sin antibióticos.

Para cada reacción de transfección, se puede preparar aquí una mezcla maestra para reducir el manejo de líquidos si se requieren muchas transfecciones. Esta es la solución B. Mezcle las dos soluciones A y B utilizando aproximadamente 200 microlitros de cada una por transfección e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar complejos de lípidos y ADN. Después de 20 minutos, diluya los complejos de lípidos y ADN con 800 microlitros por transfección de medio SF 902 SFM sin antibióticos. A continuación, aspire cuidadosamente el medio del monocapa de células SF nueve y agregue cuidadosamente mediante pipeta la mezcla de la solución AB y el medio sobre el monocapa de células SF nueve.

Incube las células transfectadas durante la noche en un incubador humedecido a 27 grados Celsius para crear un ambiente humedecido que evite que las células se sequen. Coloque la placa de seis pocillos en un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda. Al día siguiente, añada un mililitro adicional de SF 900 al medio SFM sin antibióticos en cada cultivo de monocapa e incube las células a 27 grados Celsius durante cinco días más.

Después de cinco días, recolecte el virus recombinante bao directamente del medio de cultivo y transfiéralo a un tubo de centrífuga limpio. Clarifique cualquier resto de células SF nine mediante centrifugación a 1000 Gs durante cinco minutos. A temperatura ambiente, transfiera el virus, que se encuentra en el sobrenadante resultante y se denota como P uno, a un tubo limpio. Se puede asumir que la generación del virus P uno tiene una titulación viral esperada de 1 × 10⁷ PFU por mililitro.

Aunque se puede realizar un ensayo de placas SA si es necesario, almacene el stock vírico P a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta su uso. Las células SF nueve utilizadas para la amplificación del virus recombinante balo en suspensión deben tener una densidad de 1,4 × 10⁶ células por mililitro y el cultivo debe ocupar un veinteavo del volumen total del matraz. Por ejemplo, 50 mililitros en un matraz de dos litros. En general, para una amplificación óptima del virus vao y la producción de proteínas, las células SF nueve deben ser uniformes en tamaño y esféricas.

Infecte el cultivo celular SF nueve con el stock vírico P uno a una multiplicidad de infección o MOI de 0,1 utilizando la siguiente fórmula. Incube el cultivo de insectos infectado con P uno a 27 grados Celsius con agitación a 100 RPM durante 72 horas. Tres días después, recoja el virus separando las células del medio mediante centrifugación a 1000 Gs durante cinco minutos.

Transfiera a temperatura ambiente el medio enriquecido con virus clarificado a un tubo limpio. Este stock vírico se denomina P dos, y la titulación vírica esperada es de dos veces 10 a la ocho PFU por mililitro. Almacene este stock vírico a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta su uso, y conserve los pellets celulares resultantes a veinte grados Celsius bajo cero para su posterior confirmación de la producción de virus recombinante.

Para comenzar este procedimiento, cultive un volumen adecuado de cultivos celulares SF nine en suspensión y SF 902 s fm, suplementados con 100 microgramos por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina. La relación entre el volumen total del cultivo y el volumen del matraz debe ser de uno a cinco.

Incubar los cultivos en suspensión a 27 grados Celsius con agitación a 100 RPM hasta que alcancen una densidad celular de dos veces 10 a la seis células por mililitro. Cuando los cultivos de SF nine alcancen una densidad de dos veces 10 a la seis células por mililitro, estarán listos para la infección con el virus balo. Suplementar los cultivos con una concentración final de 1% de suero bovino fetal seguido del stock viral P dos.

Para obtener una MOI de uno, incubar los cultivos infectados a 27 grados Celsius con agitación a 100 RPM. 72 horas postinfección, recolectar las células SF9 que expresan lin tres recombinante con etiqueta polihistidina mediante centrifugación a 1000 ×g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Almacenar el pellet celular resultante a menos 20 grados Celsius hasta su uso o a menos 80 grados Celsius para almacenamiento a largo plazo. Este procedimiento comienza con la descongelación sobre hielo.

Los pellet congelados de virus vao infectados en SF nueve que expresan kinlin tres recombinante y Resus suspendiendo los pellet con tampón de lisis. Después de incubar las células resuspendidas con el tampón de lisis durante cinco a 10 minutos, agitar por vórtex hasta obtener una suspensión homogénea para continuar con la ruptura celular. Someter la muestra a sonicación en un baño de hielo.

Aclare el lisado mediante centrifugación a 48.000 ×g durante una hora a cuatro grados Celsius. Cargue el sobrenadante resultante en una columna HisTrap de cinco mililitros de volumen, previamente equilibrada con tampón de lisis a cuatro grados Celsius, a una velocidad de un mililitro por minuto. No se demostrarán aquí los pasos posteriores de intercambio del tampón de elución, ni la concentración de la proteína, pero se describen en detalle en el manuscrito adjunto.

Una vez obtenida la solución de proteína tras el intercambio de tampón, aplíquela sobre una columna de heparina HP de alta captura, pre-equilibrada, de cinco mililitros de volumen, utilizando un sistema ACTA FPLC a una velocidad de 0,5 mililitros por minuto. La KINLIN tres retenida se eluye utilizando un gradiente lineal de cloruro de sodio en el mismo tampón, que aumenta a una velocidad de 10 milimolares por mililitro, en presencia de etiquetas recombinantes de histamina. Se espera que la KINLIN tres se eluya alrededor de 0,6 molar de cloruro de sodio. Tras concentrar la proteína, el paso final consiste en realizar un intercambio de tampón de la proteína mediante cromatografía de exclusión por tamaño: aplique la proteína purificada sobre una columna SUEx S 210 30 y purifique las proteínas según su tamaño, aplicando tampón sobre la columna a una velocidad de 0,5 mililitros por minuto.

La proteína que emerge de la columna se fracciona y se monitorea utilizando el absorbente a 280 nanómetros. El éxito de la generación del virus recombinante se verificó evaluando la presencia del Kinlin recombinante tres y las células SF nueve TRANSFECTADAS CON COT mediante electroforesis SDS-PAGE y análisis Western, como se observa en este representativo análisis Western de seis cultivos pequeños de células SF nueve, utilizando un anticuerpo anti his seis. Una banda clara correspondiente a una proteína marcada con his de 75 kilodalton fue visible en cada muestra una vez que el virus se amplificó y se utilizó para infectar células SF nueve en experimentos a gran escala. El Kinlin recombinante tres se purificó parcialmente mediante cromatografía de afinidad por quelación de metales inmovilizados.

La imagen principal del gel en esta figura muestra una electroforesis SDS-PAGE de la proteína recombinante murina kinlin tres purificada mediante afinidad al níquel, expresada en células SF9 infectadas con el virus BAO. La proteína absorbida fue eluida utilizando un gradiente de urea mostrado encima de la imagen del gel. MW indica el marcador de peso molecular, LYS es el lisado total de células, FT es el flujo pasante, WI es el lavado uno y WII es el lavado dos. También se realizó un análisis por inmunotransferencia (Western blot) utilizando las fracciones de elución para confirmar la presencia de la etiqueta his diseñada en la proteína recombinante.

A continuación, la KINLIN tres parcialmente purificada se purificó adicionalmente hasta alcanzar una homogeneidad casi completa mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna de heparina. Este panel muestra el perfil de elución observado a 280 nanómetros en azul, que presenta un único pico simétrico eluyendo bajo un gradiente lineal de cloruro de sodio indicado en verde, utilizando un rango de concentración de cloruro de sodio de 0,05 molar a 1,0 molar. El panel inferior muestra los resultados del análisis por SDS-PAGE de la elución fraccionada, que demuestra la presencia de la proteína de 75 kilodalton, Kinlin tres.

Como paso final, la pureza de KINLIN tres se mejoró mediante cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar agregados y lograr homogeneidad. Este perfil representativo de filtración en gel por elución corresponde a KINLIN tres purificado, utilizando una columna SUEx S 200 en Tris HCl pH 7,5, 150 milimolar de cloruro de sodio y un milimolar de DTT a 20 grados Celsius. Basado en el volumen de elución, KINLIN tres migra como se esperaría para una proteína de 75 kilodaltones, lo que sugiere que es predominantemente monomérica.

La siguiente figura muestra los resultados de un gel SDS-PAGE de kinlina recombinante tres altamente purificada y concentrada, etiquetada como K3, a 14,5 miligramos por mililitro. La producción de cantidades en miligramos de kinlina tres de ratón de longitud completa y alta pureza en cultivo de células de insecto permitirá extensos estudios estructurales y análisis bioquímicos de la proteína. Asimismo, en este estudio se realizó un ensayo de desplazamiento térmico basado en termofluor para determinar qué tampones estabilizaban a la kinlina tres.

KINLIN tres se diluyó en varios tampones, que comprenden una pantalla bidimensional de pH frente a la concentración de cloruro de sodio. El panel superior es un histograma tridimensional de las temperaturas de transición y el panel inferior muestra el cambio en la temperatura de transición respecto al promedio calculado de 50,4 grados Celsius. Las barras están coloreadas de acuerdo con el rango de temperaturas al que corresponden.

KINLIN tres mostró ser estable a altas concentraciones de cloruro de sodio dentro del rango de PA de 7,0 a 9,0 con una temperatura de transición constante de 55 grados Celsius. También se observó que la temperatura de transición de Kinlin tres fue aproximadamente de 55 grados Celsius dentro del rango de PA de 7,0 a 7,5, independientemente de la concentración de cloruro de sodio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir kinasa recombinante funcional altamente pura. Tres para caracterización biofísica detallada e investigaciones posteriores. Se pueden utilizar enfoques similares con otras muestras proteicas difíciles de preparar, y recomendamos su aplicación en tales casos.