Name: Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Aprende a detectar anticuerpos antinucleares mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando células Hep-2. Este protocolo permite identificar autoanticuerpos clínicamente relevantes para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes sistémicas.

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Damos las gracias a Cassandra Bryant para realizar el experimento IIF y Carol Buchner por su revisión técnica de expertos.

1. Preparación de la muestra y la selección del sustrato <ol><li> Extraiga los reactivos del paquete y permitir que cada elemento a la temperatura ambiente. Preparar los reactivos y diluir el suero del paciente de acuerdo con la dirección de inserción. Nota: Las diapositivas NOVA Lite se un código de barras y se puede integrar fácilmente en los sistemas automatizados en conjunto con el Sistema de Información de Laboratorio LIS. Este procedimiento ilustra el procesamiento manual de diapositivas; laboratorios de alto rendimiento, sin embargo, pueden optar por un equipo automático de procesamiento de diapositivas. </li></ol> 2. Adición de controles y muestras <ol><li> Dispensar 1 gota de control positivo y 1 gota de control negativo a los pocillos apropiados de diapositivas. Pipeta 20-25 l de suero diluido de paciente a los pocillos restantes. Procesar una diapositiva a la vez. </li><li> Coloque la diapositiva (s) en un recipiente de tinción con una toalla de papel húmeda en la parte inferior. Cubrir el recipiente y incubar el portaobjetos (s) durante 30 min. Nota: Las condiciones de humedad seevitar que el sustrato se seque. El secado de los pozos podría resultar en artefactos de tinción. Durante este período de incubación, los anticuerpos anti-nucleares en el suero del paciente se unirán a los antígenos de las células que se fijan en cada pocillo. </li><li> Después del periodo de incubación, enjuague el suero utilizando un chorro suave de tampón de lavado. Con el fin de evitar daños en el sustrato y evitar cruzado de las muestras entre los pozos, ángulo de la corredera ligeramente para evitar dirigir la corriente directamente sobre los pocillos. Elimine el exceso de tampón de lavado y colocar la placa en una jarra Coplin con tampón de lavado durante aproximadamente 5 min. </li></ol> 3. Adición de conjugado fluorescente <ol><li> Uno por uno, retire las diapositivas de la solución de lavado y golpear suavemente para eliminar el exceso de tampón de lavado. Aplicar 1 gota de conjugado fluorescente (marcado con FITC anti-IgG humana) a cada pocillo. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en el recipiente humidificado, y asegúrese de reemplazar la tincióntapa del recipiente. Nota: Para la prueba de ANA, se recomienda el uso de un conjugado de IgG específica de Fc. El conjugado es sensible a la luz, y la cubierta protegerá las diapositivas de la exposición a la luz, además de mantener el medio ambiente humidificado. Durante este periodo de incubación, el conjugado se unirá a los anticuerpos anti-nucleares del paciente que se han unido a los antígenos de las células. Este conjugado de unión resultados en la presencia de fluorescencia en los pocillos. </li><li> Enjuagar y lavar el portaobjetos como se describe anteriormente. </li><li> Coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel y aplicar el medio de montaje en línea continua hasta el borde inferior del cubreobjetos. </li><li> Retire cada diapositiva de la solución de lavado y golpee suavemente el portaobjetos para retirar el exceso de tampón de lavado. Toque el borde inferior de la diapositiva en el borde del cubreobjetos. </li><li> Bajar suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de tal manera que el medio de montaje sobre el cubreobjetos fluye hacia el borde superior de la corredera y sin la formación de burbujas de aire. Nota: Coverslipping, incluyendo el uso de la cantidad óptima de medio de montaje, es una técnica que requiere de práctica para perfeccionar. </li></ol> 4. Identificación de los resultados positivos y negativos Interpretación Manual <ol><li> Ver desliza con un microscopio de fluorescencia, que se encuentra en un cuarto oscuro. Realizar el análisis de todo el pozo con un objetivo 20X o 25X para evaluar la distribución de células y la uniformidad de la fluorescencia </li><li> Cambiar a un objetivo de 40X para hacer la interpretación final con respecto a la positividad y el patrón. </li><li> Mira los controles positivos y negativos. Positividad Grado usando una escala de clasificación reactividad de 1 + a 4 +. Nota: El control negativo no puede aparecer completamente a oscuras, pero a menudo mostrará fluorescencia inespecífica de bajo nivel. El control positivo se mostrará manzana brillante fluorescencia verde en el núcleo (Figura 1). </li></ol> Interpretación automatizada Nota: En additien la interpretación manual, carga y diapositivas de escaneo por NOVA Ver Automatizado microscopio de fluorescencia o de otro instrumento de imagen digital automatizado; sin cuarto oscuro es necesario. Después de crear un proyecto mediante la selección del tipo de deslizamiento adecuado, el instrumento adquiere y almacena imágenes digitales de alta resolución de las células en cada pocillo. Además, NOVA Ver mide la intensidad de la luz fluorescente, y clasifica los resultados como positivos o negativos, y proporciona el reconocimiento de patrones para las muestras positivas. Las imágenes se visualizan por el operador en un monitor de ordenador de alta resolución, lo que permite la interpretación final, revisión y confirmación de NOVA Ver resultado. Se pueden generar informes sobre los resultados confirmados. Microscopía digital debe ser usado en conjunción con un técnico de laboratorio experimentado, ya que está destinado a ayudar en la interpretación de los resultados.

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<li>Salomonsson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serologic+marker+for+fetal+risk+of+congenital+heart+block%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">A serologic marker for fetal risk of congenital heart block.</a> Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).</li>
<li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li>
<li>Raijamkers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM-Scl-75+is+the+main+autoantigen+in+patients+with+the+polymyositis%2Fscleroderma+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome.</a> Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).</li>
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<li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li>
</ol>

Los autores Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, y Anna Eslami son empleados de INOVA Diagnostics.

El cribado mediante células HEp-2 es un primer paso fundamental en el diagnóstico de pacientes con ADRA. Sin embargo, los métodos del IIF carecen de armonización. Las fuentes de variabilidad incluyen la preparación de portaobjetos, la especificidad conjugada y la eficiencia del microscopio fluorescente y la experiencia del lector. A pesar de estas preocupaciones, IIF sigue siendo el "estándar de oro" para las pruebas de ANA. Las células HEp-2 contienen una gran variedad de autoantígenos y proporcionan el sustrato ideal para la detección de estos autoanticuerpos. En algunos laboratorios, el IIF ha sido reemplazado por métodos de detección en fase sólida, como el ensayo multiplex o ELISA. La deficiencia de tales pruebas es que no muestran la gama completa de antígenos para ser lo suficientemente sensibles. Como consecuencia, se pueden pasar por alto pacientes verdaderos positivos, lo que puede tener consecuencias perjudiciales. Además de los problemas de retraso en el tratamiento y diagnóstico incorrecto, pueden producirse costos adicionales de atención médica debido a la repetición de pruebas confirmatorias o investigaciones diagnósticas innecesarias. Dados los desafíos inherentes a la IIF, es primordial realizar esta técnica correctamente para evitar la subjetividad en los resultados.
Para garantizar una interpretación e informes precisos de los resultados para la detección de ANA, es vital utilizar el sustrato de la más alta calidad. Al seleccionar un sustrato HEp-2, es fundamental que las células se optimicen para expresar epítopos clínicamente relevantes en su estado de proteína nativa. Es posible que las líneas celulares HEp-2 transfectadas o modificadas no permitan una unión adecuada entre anticuerpos y antígenos. Además, cuando varios autoanticuerpos diferentes están presentes simultáneamente, las células recombinantes pueden enmascarar uno o más patrones. También debe haber un alto número de células mitóticas en el sustrato. El número adecuado de células mitóticas permite una identificación rápida y precisa de patrones. 
Además de los atributos del sustrato, el objetivo de este protocolo de video es describir la técnica IIF mostrando pasos críticos como la adición de muestra, lavado de portaobjetos, adición de conjugado, deslizamiento de cobertura y determinación de resultados positivos y negativos. Los resultados pueden verse comprometidos si no se utiliza la técnica adecuada para cada uno de estos pasos. Es importante un lavado adecuado para eliminar todos los anticuerpos no unidos. Algunos pacientes muestran cantidades muy altas de autoanticuerpos y en estos casos es importante lavar el suero de los pocillos para que no contamine otros pocillos. 
Aunque el IIF ha sido tradicionalmente un método de laboratorio muy laborioso y subjetivo, las nuevas tecnologías como los procesadores de portaobjetos, los portaobjetos con código de barras y la microscopía digital automatizada pueden simplificar enormemente el flujo de trabajo, aumentar la consistencia y reducir las fuentes de variabilidad de la interpretación.

El término anticuerpos antinucleares (ANA) describe una variedad de autoanticuerpos que reaccionan con constituyentes de los núcleos de células incluyendo ADN, proteínas y ribonucleoproteínas 1, 2. La célula HEp-2, una matriz de proteína nativa con cientos de antígenos, proporciona un sustrato ideal para la detección de ANA 1. La detección de anticuerpos antinucleares en el suero humano es una herramienta de detección importante para enfermedades del tejido conectivo, y IIF es el método de referencia para la prueba ANA 1. Recientemente, IIF en células HEp-2 ha sido sustituido en algunos laboratorios con inmunoensayos específicos de antígenos y métodos múltiplex. Debido a la preocupación por los resultados negativos falsos y la falta de transparencia de los médicos, el Colegio Americano de Reumatología formó un Grupo de Trabajo que concluyó que IIF utilizando células HEp-2 debe ser el &quot;estándar de oro&quot; para la detección de ANA 1. Debido a la naturaleza subjetiva de la detección de ANA, la calidad de células HEp-2 se encuentra engral de informes precisos y confiado de los resultados. La presencia de un alto número de células mitóticas, la morfología óptima de células, suficiente confluencia, y la expresión de antígenos relevantes son particularmente importantes. IIF reconocimiento de patrones sirve como una herramienta importante para ayudar en el diagnóstico del paciente. Comprender el significado de varios patrones permite a los médicos y personal de laboratorio para llevar a cabo la adecuada prueba de seguimiento para confirmar el diagnóstico. Por ejemplo, el patrón de ANA homogéneo puede ocurrir en la presencia de anticuerpos anti-ADN de doble cadena de la cromatina o, y puede ser asociado con el lupus eritematoso sistémico (LES) 3. Desde el otro lado, recientemente se ha descrito que el llamado patrón denso fino moteado (DFS) que se ve comúnmente en hasta el 12% de las muestras de rutina, sobre todo se ha asociado con anticuerpos anti-DFS70. Estos autoanticuerpos, cuando se encuentran en forma aislada (sin otra ANA específica de la enfermedad) no están asociados con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas &lt;sup&gt; 4-9. De esta manera la prueba confirmatoria de anticuerpos anti-DFS70 puede ayudar a reducir el reflejo de las pruebas innecesarias, ofrecen un considerable ahorro de costes, y calmar la ansiedad del paciente. Dado que el IIF es la primera metodología de selección de línea para detectar autoanticuerpos, es primordial que el usuario entiende cómo la selección de los reactivos y sustratos de tejidos puede afectar los resultados. Dado que la técnica IIF es inherentemente subjetiva, es importante que los reactivos utilizados proporcionan los resultados más altos de calidad. Este objetivo de este protocolo de vídeo es familiarizar al usuario con los pasos correctos necesarios para llevar a cabo el método de IFI, los patrones comunes asociados con ANA, e introducir los nuevos avances que pueden agilizar el flujo de trabajo de laboratorio y estandarizar los resultados.

<table><tbody><tr><td>NOVA Lite HEp-2 IgG (conjugado DAPI)</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>708102</td><td></td></tr><tr><td>NOVA View Instrument</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>NV2000</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA</td><td>Link Workstation INOVA Diagnostics</td><td>LINK010</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation Licencia</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK001</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de códigos de barras</td><td>INOVA Diagnostics INOVA Diagnostics</td><td>LINK019</td><td></td></tr></tbody></table>

antinuclear anticuerpo de detección sistemática mediante células hep-2

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

El Colegio Americano de Reumatología declaración de posición sobre las pruebas de ANA estipula el uso de la IFI como el método estándar de oro para ANA proyección 1. Aunque IIF es una excelente prueba de detección en manos expertas, las dificultades técnicas de procesamiento y lectura IIF diapositivas - tales como el procesamiento de mano de obra intensiva de diapositivas, la lectura manual, la necesidad de experiencia, los técnicos capacitados y el uso de la cámara oscura - hacer que el método IIF difícil de encajar en el flujo de trabajo de, laboratorios automatizados modernos. El primer y crucial paso para la detección de ANA es de alta calidad de procesamiento de diapositivas cuidado. Este procedimiento es laborioso y requiere una comprensión completa del proceso, así como la atención a los detalles y la experiencia. Slide lectura se realiza mediante microscopía de fluorescencia en habitaciones oscuras, y se lleva a cabo por técnicos capacitados que están familiarizados con los diversos patrones, en el contexto del ciclo celulary la morfología de la interfase y las células en división. Siempre que IIF es la primera herramienta de líneas para la ADRS, la comprensión de los pasos para realizar correctamente esta técnica es fundamental. Recientemente, los sistemas de imágenes digitales se han desarrollado para la lectura automatizada de diapositivas IIF. Estos sistemas, como el NOVA Ver automatizada fluorescente Microscopio, están diseñados para agilizar el flujo de trabajo de rutina IIF. NOVA Ver adquiere y almacena de alta resolución las imágenes digitales de los pozos, separando de este modo la adquisición de imágenes de la interpretación; imágenes se ven un interpretados en los monitores de ordenador de alta resolución. Almacena imágenes para futuras referencias y apoyan la interpretación del operador, proporcionando datos de intensidad de luz fluorescentes en las imágenes. También clasifica preliminarmente resultados como positivos o negativos, y proporciona el reconocimiento de patrones para las muestras positivas. En resumen, se elimina la necesidad de cuarto oscuro, y automatiza y agiliza el readi IIFng / flujo de trabajo de interpretación. Lo más importante, aumenta la coherencia entre los lectores y las lecturas. Por otra parte, con el uso de diapositivas con códigos de barras, los errores de transcripción se eliminan, proporcionando trazabilidad de las muestras y la identificación positiva del paciente. Esto se traduce en una mayor integridad de los datos y seguridad del paciente. El objetivo general de este video es para demostrar el procedimiento IIF, incluyendo el procesamiento de diapositivas, la identificación de patrones comunes IIF, y la introducción de nuevos avances para simplificar y armonizar esta técnica.

Al evaluar los resultados de la tinción de células de HEp-2, cinco grandes patrones nucleares son más comúnmente reportados: homogénea, pintados centrómero, nucleolar, y los puntos nucleares. Estos patrones son el resultado de la unión de autoanticuerpos con constituyentes específicos del núcleo. Aunque la detección de ANA es específica a las estructuras nucleares, también se pueden observar los patrones citoplasmáticas asociadas con autoanticuerpos contra estructuras citoplasmáticas. En algunos casos, varios autoanticuerpos pueden estar presentes en una muestra, y la imagen pueden aparecer como un patrón mixto. Hay otra, observado con menos frecuencia y, a menudo patrones específicos del ciclo celular que pueden ser detectados por el método IIF; más recientemente, una llamada densa patrón moteado fino con significado clínico especial ha sido descrita en algunos sueros ANA positiva. Homogénea Patrón Para identificar un patrón homogéneo, escanee el bien e identificar mitótico o divisoriacélulas. La cromatina condensada de las células mitóticas (Figura 2, flecha naranja) exhibe fluorescencia sólido, uniforme que a menudo es más pronunciada que en la célula en reposo nuclei.In el patrón homogéneo, la exposición uniforme de las células en reposo, la fluorescencia difusa de todo el núcleo (Figura 2, flecha blanca). Este patrón característico es a menudo el resultado de los anticuerpos anti-dsDNA 10. Patrón moteado En el patrón moteado grueso, las células mitóticas muestran ninguna tinción de las regiones cromosómicas condensadas (Figura 3, flecha naranja). Las células en reposo exhiben fluorescencia granular a través de todo el núcleo. El moteado nuclear puede ser definido como grueso o fino. El patrón moteado grueso es a menudo el resultado de anti-Sm y anti-RNP 11. En el patrón moteado fino, las células en reposo muestran un moteado fino o difusa a través de los núcleos, por lo general en uniforme dISTRIBUCIÓN (Figura 4, flecha blanca). El patrón moteado fino es a menudo el resultado de la lucha contra SSAand anti-SSB 12. Dense Pattern Fine manchada Ahora se reconoce que el denso patrón moteado fino (DFS) es común en las pruebas de rutina, y hasta un 12% de las muestras son positivas para autoanticuerpos anti-DFS70. Sin embargo, estos autoanticuerpos, cuando se encuentran en forma aislada, no se asocian con enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas 4 -6. Estos anticuerpos son frecuentes en las personas y los pacientes portadores de enfermedades no relacionadas con la ADRS 6 sanas. Las pruebas de confirmación para los anticuerpos anti-DFS70 puede ayudar a reducir el reflejo de las pruebas innecesarias, ofrecen un considerable ahorro de costes, y calmar la ansiedad del paciente. Dado el patrón de DFS es difícil de identificar y la positividad de ANA puede causar ansiedad a los pacientes y médicos, es muy recomendable realizar una prueba de confirmación al cabo de identificación<html> ficar un patrón sugestivo de anticuerpos anti-DFS70 para aclarar el significado clínico de ANA positivty 5,6. En este modelo, las células mitóticas (Figura 5, naranja de flecha) muestran tinción positiva moteada de la cromatina metafase, mientras descansa núcleos de las células (Figura 5, flecha blanca) exhiben manchas finas uniformemente distribuidas por todo el núcleo. Patrón Centrómero Para identificar el patrón centrómero, mira los pozos e identificar mitótico o células en división. En células mitóticas (Figura 6, naranja de flecha), estos se convierten en manchas aisladas estrechamente asociados en lo que a menudo se describe como un &quot;bar metafase&quot;. En el patrón de centrómero, células en reposo (Figura 6, flecha blanca) muestran aproximadamente 40-60 manchas discretas distribuidas a lo largo de los núcleos. El patrón centrómero es el resultado de anti-CENP A, B, C anticuerpos 13. paso &quot;&gt; Nucleolar Patrón Algunos patrones nucleolar se asocian con la tinción citoplásmica difusa en las células mitóticas (Figura 7, flecha naranja) y la región cromosómica negativo, mientras que otros patrones nucleolear muestran tinción positiva de la región cromosómica. El patrón nucleolar se asocia con la tinción homogénea o moteado de los nucleolos (figura 7, flecha blanca), junto con moteado débil o tinción homogénea de la nucleoplasma. Estos patrones están asociados con anti-ARN polimerasa III, anti-fibrilarina, anti-Th/To y anti-PM/Scl anticuerpos 14,15. Modelo de punto Nuclear El modelo de punto nuclear se asocia con células mitóticas en metafase negativos (Figura 8, naranja de flecha) y con pocas manchas discretas en los núcleos de las células en reposo (Figura 8, flecha blanca). Este patrón característico es a menudo el resultado de la sp-100, PML, o p80 autoanticuerpos colin. Estos anticuerpos son como<html> asociadas con la cirrosis biliar primaria y la hepatitis autoinmune 16. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Figura 1 Control negativo (izquierda): Las células muestran bajo nivel de fluorescencia no específica, pero sin tinción nuclear específico de control positivo (derecha):. Las células muestran fluorescencia nuclear de manzana verde. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Patrón homogéneo. Células mitóticas (orangearrow) muestran fluorescencia sólido. Las células en reposo muestran incluso, la tinción difusa (whitearrow). &quot;Width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 3. Gruesa moteado patrón. Células mitóticas (flecha naranja) muestran tinción negativa. Las células en reposo muestran una mancha moteado distinta (flecha blanca). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Patrón moteado fino. Células mitóticas (flecha naranja) muestran tinción negativa. Las células en reposo muestran una tinción moteada fina distinta (flecha blanca). <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Patrón denso fino moteado. Células mitóticas (flecha naranja) muestran una tinción sólida granular fino. Las células en reposo muestran un muy fino, mancha moteado difuso (whitearrow). Figura 6. Patrón centrómero. Células mitóticas (orangearrow) Mostrar uniforme, manchas aisladas. Descansar células (whitearrow) muestra 40-60 manchas aisladas por núcleo celular. <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Patrón nucleolar. Células mitóticas (orangearrow) aparecen como grandes grupos de tinción granular. Descansar celular nucleishows fluorescencia en los nucleolos (whitearrow). <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. Patrón de puntos Nuclear. Células mitóticas (orangearrow) parece negativo. Las células en reposo muestran algunos DISCRmotas ete en el núcleo (whitearrow). Además, el patrón de puntos nucelar pueden coexistir con tinción citoplásmica asociada con autoanticuerpos a antígenos mitocondriales (flecha roja).

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se han utilizado tradicionalmente para la detección de anticuerpos antinucleares (ANA) en el suero humano. La presencia de estos anticuerpos puede ayudar en el diagnóstico de enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ADRS). Este protocolo se muestra cómo realizar efectivamente la técnica de IFI para detectar con precisión estos autoanticuerpos.

Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos antinucleares. Esto se logra incubando suero de paciente con portaobjetos de sustrato hep-2. El suero de paciente no unido se elimina mediante lavado; los autoanticuerpos unidos se incuban entonces con un conjugado específico marcado con fluoresceína, y el reactivo no unido se elimina mediante lavado.Cuando se observan mediante un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas para autoanticuerpos exhibirán una fluorescencia verde manzana que corresponde a las áreas de la célula o del núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido, en un patrón de fluorescencia indicativo de la presencia del antígeno. En última instancia, la detección de ARNA puede utilizarse para ayudar en el diagnóstico de enfermedades del tejido conectivo. La principal ventaja del método de inmunofluorescencia indirecta frente a otros métodos como ELISA en fase sólida es que el sustrato celular Hep-2 contiene más de 100 antígenos expresados en su configuración nativa.Esto permite la identificación de casi todos los anticuerpos O clínicamente relevantes, lo cual no es posible con las técnicas de fase sólida, ya que el método inmunofluorescente indirecto es una técnica muy especializada. Las personas nuevas en este método necesitan tiempo y práctica para volverse competentes en el procedimiento de procesamiento de portaobjetos. Interpretar las imágenes microscópicas y aprender a identificar los patrones relevantes también es una habilidad que requiere tiempo para dominarla.Con los reactivos y herramientas adecuados, los resultados son más consistentes y fáciles de interpretar. Quien demostrará el procedimiento será Cassandra Bryant, una tecnóloga del Laboratorio de Desarrollo de Ensayos de Inmunofluorescencia. Retire los reactivos del empaque y deje que cada elemento alcance la temperatura ambiente, prepare los reactivos y diluya el suero del paciente según las instrucciones; las láminas están codificadas con barras y pueden integrarse fácilmente a sistemas automatizados.Este procedimiento ilustra el procesamiento manual de portaobjetos. Sin embargo, los laboratorios de alto rendimiento pueden optar por equipos automatizados para el procesamiento de portaobjetos con capacidades de escaneo de códigos de barras. Los instrumentos Inova están conectados mediante una red inteligente centralizada que proporciona control sobre los resultados del flujo de trabajo y la generación de informes.Para IFA. Esto permite la identificación positiva del paciente mediante el procesamiento y la eliminación de errores de transcripción y errores relacionados. Aplique una gota del control positivo y una gota del control negativo sobre el portaobjetos correspondiente.Las pocilas pipeteen de 20 a 25 microlitros de suero diluido del paciente en las pocilas restantes. Procese un portaobjetos a la vez. Coloque el portaobjetos en un recipiente para tinción con una toalla de papel húmeda en el fondo, cúbralo y incube el portaobjetos durante 30 minutos.Las condiciones húmedas evitarán que el sustrato se seque, lo cual podría provocar una tinción artefactual. Durante este período de incubación, los anticuerpos antinucleares presentes en el suero del paciente se unirán a los antígenos de las células que están fijadas en cada pocillo. Tras el período de incubación, enjuague el suero utilizando un flujo suave de tampón de lavado para evitar dañar el sustrato.Incline ligeramente la lámina de modo que el flujo no apunte directamente sobre el sustrato. Esta orientación de las láminas también ayudará a prevenir la contaminación cruzada de muestras entre pozos. Elimine el exceso de tampón de lavado golpeando suavemente y coloque la lámina en un frasco Copeland que contenga tampón de lavado.El tiempo de incubación para el paso de lavado debe ser aproximadamente de cinco minutos. Retire los portaobjetos del tampón de lavado y sacúdalos suavemente. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, aplique una gota de conjugado fluorescente en cada pocillo.Para una prueba de AN, se recomienda el uso de un conjugado específico para la fracción Fc de IgG. Incube las laminillas durante 30 minutos en un recipiente humedecido y asegúrese de reemplazar la cubierta de tinción. El conjugado es sensible a la luz y la cubierta protegerá a las laminillas de la exposición a la luz.Durante este período de incubación, el conjugado se unirá a los anticuerpos anti-nucleares del paciente que se han unido a los antígenos celulares. Esta unión del conjugado da como resultado la presencia de fluorescencia en las pocilas tras la incubación. Lave la placa con tampón de lavado.Como antes, coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel y aplique medio de montaje en una línea continua en el borde inferior del cubreobjetos. Retire cada portaobjetos del tampón de lavado y golpee suavemente el portaobjetos. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, toque el borde inferior del portaobjetos con el borde del cubreobjetos.Baje suavemente la preparación sobre el cubreobjetos de manera que el medio de montaje presente en el cubreobjetos fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin formar burbujas de aire. Aplicar la cantidad óptima de medio de montaje es una técnica que requiere práctica para lograr una visualización perfecta. Observe las preparaciones con un microscopio de fluorescencia ubicado en una habitación oscura, y realice un barrido de todo el pocillo utilizando un objetivo de 20x o 25x. Para evaluar la distribución celular y la uniformidad de la fluorescencia, cambie a un objetivo de 40x.Para realizar la interpretación final sobre la positividad y el patrón, observe los controles positivo y negativo. El control negativo puede no aparecer completamente oscuro, pero a menudo mostrará una fluorescencia inespecífica de bajo nivel. El control positivo mostrará una fluorescencia verde manzana brillante en el núcleo.La positividad puede calificarse utilizando una escala de reactividad que va de uno más a cuatro más. Además de la interpretación manual, las laminillas pueden cargarse y escanearse mediante el microscopio de fluorescencia automatizado. No es necesario un cuarto oscuro.Después de crear un proyecto seleccionando el tipo de portaobjetos adecuado, el instrumento adquiere y almacena imágenes digitales de alta resolución de las células en cada pocillo. Además, Nova View mide la intensidad de la luz fluorescente y clasifica los resultados como positivos o negativos, y proporciona reconocimiento de patrones para muestras positivas. Las imágenes son visualizadas por el operador en un monitor informático de alta resolución, lo que permite la interpretación final, revisión y confirmación de Nova View.Los informes de resultados pueden generarse a partir de resultados confirmados. La unión de autoanticuerpos a las estructuras proteicas constituyentes dentro del núcleo da lugar a cinco patrones nucleares principales, incluyendo homogéneo, moteado, centromérico, nucleolar y punto nuclear. Para identificar un patrón homogéneo como el mostrado aquí, identifique células mitóticas o en división.Las células mitóticas presentan una fluorescencia uniforme y sólida, que a menudo es más pronunciada que en las células en reposo. Los núcleos de las células en reposo deben ser uniformes con tinción difusa. Este patrón característico es muy probablemente el resultado de autoanticuerpos contra el ADN de doble cadena.Una característica clave del patrón moteado es la apariencia de ranura de monedas en las células mitóticas en metafase. La región cromosómica de estas células es negativa. Las células en reposo muestran un patrón moteado en todo el núcleo.La fluorescencia en manchas puede definirse como gruesa o fina. La fluorescencia en manchas gruesa es el resultado de autoanticuerpos contra SM y RNP. La fluorescencia en manchas fina puede deberse a autoanticuerpos contra S-S-A-S-S-B, así como contra la ARN polimerasa. El patrón DFS se denomina moteado denso y fino, y es indicativo de autoanticuerpos contra DFS 70. Las células mitóticas muestran tinción moteada, mientras que las células en reposo presentan motas finas uniformemente distribuidas en todo el núcleo. En estos casos, se deben realizar pruebas confirmatorias, ya que los autoanticuerpos anti-DFS 70 son prevalentes en individuos sanos en comparación con pacientes que padecen enfermedades del tejido conectivo.Para identificar el patrón del centrómero, examine las pocilas e identifique las células mitóticas o en división. Las células en división presentan numerosos puntos discretos en estrecha asociación entre sí, comúnmente denominados barra de metafase. Las células en reposo muestran aproximadamente de 40 a 60 puntos discretos distribuidos a lo largo del núcleo.El patrón centromérico está asociado con autoanticuerpos contra proteínas centroméricas con el patrón nucleolar. La tinción de la región cromosómica en células mitóticas es variable. El patrón nucleolar se asocia con tinción homogénea o en manchas de los núcleos, junto con tinción débil, en manchas o homogénea del nucleoplasma de los núcleos de células en reposo.Este patrón está asociado con autoanticuerpos contra la polimerasa de ARN tres, la fibrilina y los anticuerpos PM-Scl. El patrón de puntos nucleares se asocia con células mitóticas negativas en metafase y con pocos puntos discretos en los núcleos de células en reposo. Este patrón característico suele ser el resultado de autoanticuerpos contra SP-100, PML o colina P-80.Estos anticuerpos están asociados con la cirrosis biliar primaria y la hepatitis autoinmune. En la imagen mostrada, el patrón de puntos nucleares muestra tinción citoplasmática debido a autoanticuerpos contra antígenos mitocondriales. La detección de anticuerpos antinucleares y el reconocimiento de patrones sirven como una herramienta importante para ayudar en el diagnóstico del paciente.Comprender la importancia de los diversos patrones permite a los clínicos y al personal de laboratorio realizar pruebas de seguimiento adecuadas. Los factores más importantes para identificar correctamente los patrones de anticuerpos antinucleares son seleccionar un sustrato celular de alta calidad y procesar las laminillas con una técnica constante y adecuada. La lectura de las laminillas se realiza tradicionalmente mediante microscopía de fluorescencia en habitaciones oscuras, y la llevan a cabo tecnólogos capacitados que están familiarizados con los distintos patrones en el contexto del ciclo celular y la morfología celular.En los &uacute;ltimos a&ntilde;os, se han desarrollado sistemas de imagen digital para la lectura automatizada de las l&aacute;minas; estos instrumentos automatizan el flujo de trabajo y aumentan la consistencia en la lectura e interpretaci&oacute;n. Adem&aacute;s, con el uso de l&aacute;minas con c&oacute;digo de barras, la trazabilidad de las muestras durante todo el proceso elimina errores potenciales de transcripci&oacute;n y mejora la integridad de los datos y la seguridad del paciente. Tras ver este video, deber&iacute;a tener una buena comprensi&oacute;n de c&oacute;mo realizar cada paso del procedimiento de inmunofluorescencia indirecta y c&oacute;mo identificar los patrones de anticuerpos antinucleares cl&iacute;nicamente relevantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Autoanticuerpos DFS70 imitan patrones de anticuerpos antinucleares asociados a enfermedad comunes haciendo interpretación desafiante al usar sustratos convencionales de HEp-2. El protocolo describe ventajas de sustrato de HEp-2 Ingeniería novela sobre HEp-2 convencional en ANA screening y distinguir patrones de DFS70 con alta confianza en monoespecíficas y mixtas en casos positivos de ANA.

Distinción simultánea de monoespecíficas y patrones mixtos DFS70 durante la proyección de ANA con un sustrato de la novela nocaut en ELITE/DFS70 HEp-2

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para realizar experimentos 3D "hígado-en-un-chip" infección con el virus de la hepatitis B.

"Hígado-en-un-Chip" cultivos de hepatocitos primarios y células de Kupffer para infección del Virus de la Hepatitis B

El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

Presentamos un método robusto, rentable y flexible para medir los cambios en el número de hepatocitos y la ploidía nuclear dentro de muestras de tejido fijo/crioconservado que no requieren citometría de flujo. Nuestro enfoque proporciona una poderosa firma de citología hepática en toda la muestra ideal para rastrear la progresión de las lesiones y enfermedades hepáticas.

Un método in situ de alto rendimiento para la estimación de la ploideide nuclear de hepatocitos en ratones

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en células 293T de ingeniería novedosa (293T-NE-3NR, expresando NTCP humano, HNF4, RXR y PPAR) y células hepáticas tradicionales (HepG2-NE, expresando NTCP humano).

Modelado de la infección por el virus de la hepatitis B en células no hepáticas 293T-NE-3R

Presentamos un protocolo para detectar compuestos contra el virus de la hepatitis B (VHB) dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada pre y post-viral, utilizando calorimetría de titulación isotérmica para medir la afinidad de unión (KD) con el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio del huésped. La eficacia antiviral se determinó a través de la supresión de los marcadores del ciclo de vida viral (formación de ADNcc, transcripción y ensamblaje viral).

Un modelo competente de hepatocitos que examina la entrada del virus de la hepatitis B a través del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio como objetivo terapéutico

Este protocolo presenta una técnica automatizada de alto rendimiento basada en imágenes para identificar compuestos que modulan la destrucción de células de cáncer de mama mediada por células asesinas naturales en presencia de un anticuerpo terapéutico anti-HER-2.

Ensayo de cribado de alto contenido para la identificación de compuestos modificadores de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos

Los hepatocitos derivados de células madre pluripotentes se pueden purificar a través de la clasificación celular, utilizando una combinación de tinción de moléculas de adhesión de células leucocitarias mitocondriales y activadas (ALCAM, también conocida como CD166).

Aplicación de la tinción de mitocondrias vivas en la clasificación celular para purificar hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas

No existe un ensayo estándar de neutralización viral disponible para el virus de la hepatitis E (HEV), un virus de ARN de cadena positiva no citopático. Aquí, se describe una prueba de neutralización de reducción de fluorescencia (FRNT) basada en la cuantificación de la proteína cápside viral marcada con fluorescencia para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-HEV.

Prueba de neutralización de reducción de fluorescencia del virus de la hepatitis E para medir títulos neutralizantes de anticuerpos

Aprende a detectar anticuerpos antinucleares mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando células Hep-2. Este protocolo permite identificar autoanticuerpos clínicamente relevantes para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes sistémicas.

Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2

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