Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos antinucleares. Esto se logra incubando el suero del paciente con dos portaobjetos de sustrato. El suero del paciente no unido se lava, los anticuerpos automáticos unidos se incuban con un conjugado específico marcado con fluoresceína y se lava el reactivo no unido.

Cuando se observan a través de un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas de autoanticuerpos exhibirán una fluorescencia verde manzana correspondiente a áreas de la célula o núcleos donde el autoanticuerpo se ha unido en un patrón de fluorescencia indicativo de la presencia del antígeno. En última instancia, la presencia de arna se puede utilizar para ayudar en el diagnóstico de enfermedades del tejido conectivo. La principal ventaja del método de inmunofluorescencia indirecta sobre otros métodos como Eliza en fase sólida, es que el sustrato de dos células Hep contiene más de 100 antígenos expresados en su configuración nativa.

Esto permite la identificación de casi todos los anticuerpos O clínicamente relevantes, lo que no es posible con las técnicas de cara sólida, ya que el método de inmunofluorescencia indirecta es una técnica muy especializada. Las personas nuevas en este método necesitan tiempo y práctica para dominar el procedimiento de procesamiento de portaobjetos. Interpretar las imágenes del microscopio y aprender a identificar patrones relevantes también es una habilidad que lleva tiempo dominar.

Con los reactivos y las herramientas adecuados, los resultados son más consistentes y fáciles de interpretar. La demostración del procedimiento estará a cargo de Cassandra Bryant, tecnóloga del Laboratorio de Desarrollo de Ensayos de Inmunofluorescencia. Retire los reactivos del empaque y permita que cada artículo alcance la temperatura ambiente, prepare los reactivos y diluya el suero del paciente de acuerdo con la dirección. Los portaobjetos de inserción tienen código de barras y se pueden integrar fácilmente en sistemas automatizados.

Este procedimiento ilustra el procesamiento manual de portaobjetos. Sin embargo, los laboratorios de alto rendimiento pueden optar por equipos de procesamiento de portaobjetos automatizados con capacidades de escaneo de códigos de barras. Los instrumentos Inova están conectados a través de una red inteligente centralizada que proporciona control sobre los resultados del flujo de trabajo y los informes.

Para IFA. Esto da como resultado una identificación positiva del paciente a partir del procesamiento y la eliminación de la transcripción y los errores relacionados. Dispense una gota de control positivo y una gota de control negativo en el portaobjetos apropiado.

Los pocillos pipetean de 20 a 25 microlitros de suero diluido para el paciente en los pocillos restantes. Procese una diapositiva a la vez. Coloque el portaobjetos en un recipiente para manchar con una toalla de papel húmeda en el fondo, cubra el recipiente e incube el portaobjetos durante 30 minutos.

Las condiciones húmedas evitarán que el sustrato se seque, lo que podría dar lugar a manchas artefactuales. Durante este período de incubación, los anticuerpos antinucleares en el suero del paciente se unirán a los antígenos de las células que están fijadas en cada pocillo. Después del período de incubación, enjuague el suero con un chorro suave de tampón de lavado para evitar dañar el sustrato.

Incline ligeramente el portaobjetos para que el chorro no apunte directamente sobre el sustrato. Esta orientación de los portaobjetos también ayudará a evitar el cruce de muestras entre pocillos. Retire el exceso de tampón de lavado y coloque el portaobjetos en un frasco Copeland que contenga tampón de lavado.

El tiempo de incubación para la etapa de lavado debe ser de aproximadamente cinco minutos. Retire los portaobjetos del tampón de lavado y golpee suavemente. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, aplique una gota de conjugado fluorescente en cada pocillo.

Para una prueba de NA, se recomienda el uso de un conjugado específico de IgG FC. Incube los portaobjetos durante 30 minutos en el recipiente humidificado y asegúrese de volver a colocar la cubierta de tinción. El conjugado es sensible a la luz y la cubierta protegerá las diapositivas de la exposición a la luz.

Durante este período de incubación, el conjugado se unirá a los anticuerpos antinucleares del paciente que se han unido a los antígenos celulares. Esta unión conjugada da como resultado la presencia de fluorescencia en los pocillos después de la incubación. Lave el portaobjetos con tampón de lavado.

Al igual que antes, coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel y aplique el medio de montaje en línea continua hasta el borde inferior del cubreobjetos. Retire cada portaobjetos del tampón de lavado y golpee suavemente el portaobjetos. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, toque el borde inferior de la corredera con el borde del cubreobjetos.

Baje suavemente la corredera sobre el cubreobjetos de tal manera que el medio de montaje en el cubreobjetos fluya hacia el borde superior de la corredera sin que la cubierta de burbujas de aire se deslice, incluida la cantidad óptima de medio de montaje es una técnica que requiere práctica para una visión perfecta. Portaobjetos con un microscopio fluorescente ubicado en una habitación oscura, el escaneo de todo el pocillo debe realizarse con un objetivo de 20 x o 25 x. Para evaluar la distribución celular y la uniformidad del cambio de fluorescencia a un objetivo de 40 x.

Para hacer la interpretación final con respecto a la positividad y el patrón, observe los controles positivos y negativos. Es posible que el control negativo no aparezca completamente oscuro, pero a menudo mostrará fluorescencia inespecífica de bajo nivel. El control positivo mostrará una fluorescencia verde manzana brillante en el núcleo.

La positividad se puede calificar mediante el uso de una escala de calificación de reactividad de uno más a cuatro más. Además de la interpretación manual, los portaobjetos pueden cargarse y escanearse con el microscopio de fluorescencia automatizado. No es necesario un cuarto oscuro.

Después de crear un proyecto seleccionando el tipo de portaobjetos adecuado, el instrumento adquiere y almacena imágenes digitales de alta resolución de las células de cada pozo. Además, Nova view mide la intensidad de la luz fluorescente y categoriza los resultados como positivos o negativos, y proporciona reconocimiento de patrones para muestras positivas. Las imágenes son vistas por el operador en un monitor de computadora de alta resolución, lo que permite la interpretación final, la revisión y la confirmación de Nova View.

Se pueden generar informes de resultados sobre los resultados confirmados. La unión de autoanticuerpos a las estructuras proteicas constituyentes dentro del núcleo da como resultado cinco patrones nucleares principales, que incluyen centrómero homogéneo, moteado, nucleolar y punto nuclear. Para identificar un patrón homogéneo como se muestra aquí, identifique las células mitóticas o en división.

Las células mitóticas muestran una fluorescencia sólida y uniforme, que a menudo es más pronunciada que en las células en reposo. Los núcleos de las células en reposo deben ser uniformes con tinción difusa. Lo más probable es que este patrón característico sea el resultado de autoanticuerpos contra el ADN bicatenario.

Una característica clave del patrón moteado es la apariencia de ranura de moneda de las células mitóticas en metafase. La región cromosómica de estas células es negativa. Las células en reposo muestran un patrón de moteado a lo largo de los núcleos.

El moteado se puede definir como grueso o fino. El moteado del curso es el resultado de los autoanticuerpos contra SM y RNP. El moteado fino puede deberse a los autoanticuerpos contra S-S-A-S-S-B, así como a la ARN polimerasa.

El patrón DFS se conoce como denso, finamente moteado y es indicativo de autoanticuerpos contra DFS 70. Las células mitóticas muestran tinciones moteadas, mientras que las células en reposo muestran motas finas distribuidas uniformemente por todo el núcleo. En estos casos, se deben realizar pruebas confirmatorias, ya que los autoanticuerpos DFS 70 son prevalentes en individuos sanos frente a pacientes con enfermedad del tejido conectivo.

Para identificar el patrón del centrómero, escanee los pocillos e identifique las células mitóticas o en división. Las células que se dividen tienen numerosas motas discretas en estrecha asociación entre sí, a menudo llamadas barra de metafase. Las células en reposo muestran aproximadamente de 40 a 60 motas discretas distribuidas por todo el núcleo.

El patrón del centrómero se asocia con los autoanticuerpos contra las proteínas del centrómero con el patrón nucleolar. La tinción de la región cromosómica en las células mitóticas es variable. El patrón nucleolar se asocia con una tinción homogénea o moteada de los núcleos, junto con una tinción débil, moteada u homogénea del nucleoplasma de los núcleos celulares en reposo.

Este patrón se asocia con autoanticuerpos contra la ARN polimerasa tres, la fibrilina y los anticuerpos PM SCL. El patrón de puntos nucleares se asocia con metafase negativa, células mitóticas y pocos puntos discretos en los núcleos de las células en reposo. Este patrón característico suele ser el resultado de autoanticuerpos contra SP 100 PML o P 80 colan.

Estos anticuerpos se asocian con la cirrosis biliar primaria y la hepatitis autoinmune. En la imagen mostrada, el patrón de puntos nucleares muestra tinción citoplasmática debido a los autoanticuerpos contra los antígenos mitocondriales. La detección de anticuerpos antinucleares y el reconocimiento de patrones sirven como una herramienta importante para ayudar en el diagnóstico del paciente.

La comprensión de la importancia de varios patrones permite a los médicos y al personal de laboratorio realizar pruebas de seguimiento adecuadas. Los factores más importantes para identificar correctamente los patrones de anticuerpos antinucleares son la selección de un sustrato celular de alta calidad y el procesamiento de los portaobjetos con una buena técnica consistente. La lectura de portaobjetos se realiza tradicionalmente mediante microscopía fluorescente en cuartos oscuros y es realizada por tecnólogos capacitados que están familiarizados con los diversos patrones en el contexto del ciclo celular y la morfología celular.

En los últimos años, se han desarrollado sistemas de imágenes digitales para la lectura automatizada de las diapositivas, dichos instrumentos automatizan el flujo de trabajo y aumentan la consistencia de la lectura y la interpretación. Además, con el uso de portaobjetos con códigos de barras, la trazabilidad de las muestras durante todo el proceso elimina los posibles errores de transcripción y aumenta la integridad de los datos y la seguridad del paciente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar cada paso del procedimiento de inmunofluorescencia indirecta y cómo identificar patrones de anticuerpos antinucleares clínicamente relevantes.