Antinuclear Anticuerpo de detección sistemática mediante células Hep-2

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para detectar anticuerpos antinucleares. Esto se logra incubando suero de paciente con portaobjetos de sustrato hep-2. El suero de paciente no unido se elimina mediante lavado; los autoanticuerpos unidos se incuban entonces con un conjugado específico marcado con fluoresceína, y el reactivo no unido se elimina mediante lavado.

Cuando se observan mediante un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas para autoanticuerpos exhibirán una fluorescencia verde manzana que corresponde a las áreas de la célula o del núcleo donde el autoanticuerpo se ha unido, en un patrón de fluorescencia indicativo de la presencia del antígeno. En última instancia, la detección de ARNA puede utilizarse para ayudar en el diagnóstico de enfermedades del tejido conectivo. La principal ventaja del método de inmunofluorescencia indirecta frente a otros métodos como ELISA en fase sólida es que el sustrato celular Hep-2 contiene más de 100 antígenos expresados en su configuración nativa.

Esto permite la identificación de casi todos los anticuerpos O clínicamente relevantes, lo cual no es posible con las técnicas de fase sólida, ya que el método inmunofluorescente indirecto es una técnica muy especializada. Las personas nuevas en este método necesitan tiempo y práctica para volverse competentes en el procedimiento de procesamiento de portaobjetos. Interpretar las imágenes microscópicas y aprender a identificar los patrones relevantes también es una habilidad que requiere tiempo para dominarla.

Con los reactivos y herramientas adecuados, los resultados son más consistentes y fáciles de interpretar. Quien demostrará el procedimiento será Cassandra Bryant, una tecnóloga del Laboratorio de Desarrollo de Ensayos de Inmunofluorescencia. Retire los reactivos del empaque y deje que cada elemento alcance la temperatura ambiente, prepare los reactivos y diluya el suero del paciente según las instrucciones; las láminas están codificadas con barras y pueden integrarse fácilmente a sistemas automatizados.

Este procedimiento ilustra el procesamiento manual de portaobjetos. Sin embargo, los laboratorios de alto rendimiento pueden optar por equipos automatizados para el procesamiento de portaobjetos con capacidades de escaneo de códigos de barras. Los instrumentos Inova están conectados mediante una red inteligente centralizada que proporciona control sobre los resultados del flujo de trabajo y la generación de informes.

Para IFA. Esto permite la identificación positiva del paciente mediante el procesamiento y la eliminación de errores de transcripción y errores relacionados. Aplique una gota del control positivo y una gota del control negativo sobre el portaobjetos correspondiente.

Las pocilas pipeteen de 20 a 25 microlitros de suero diluido del paciente en las pocilas restantes. Procese un portaobjetos a la vez. Coloque el portaobjetos en un recipiente para tinción con una toalla de papel húmeda en el fondo, cúbralo y incube el portaobjetos durante 30 minutos.

Las condiciones húmedas evitarán que el sustrato se seque, lo cual podría provocar una tinción artefactual. Durante este período de incubación, los anticuerpos antinucleares presentes en el suero del paciente se unirán a los antígenos de las células que están fijadas en cada pocillo. Tras el período de incubación, enjuague el suero utilizando un flujo suave de tampón de lavado para evitar dañar el sustrato.

Incline ligeramente la lámina de modo que el flujo no apunte directamente sobre el sustrato. Esta orientación de las láminas también ayudará a prevenir la contaminación cruzada de muestras entre pozos. Elimine el exceso de tampón de lavado golpeando suavemente y coloque la lámina en un frasco Copeland que contenga tampón de lavado.

El tiempo de incubación para el paso de lavado debe ser aproximadamente de cinco minutos. Retire los portaobjetos del tampón de lavado y sacúdalos suavemente. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, aplique una gota de conjugado fluorescente en cada pocillo.

Para una prueba de AN, se recomienda el uso de un conjugado específico para la fracción Fc de IgG. Incube las laminillas durante 30 minutos en un recipiente humedecido y asegúrese de reemplazar la cubierta de tinción. El conjugado es sensible a la luz y la cubierta protegerá a las laminillas de la exposición a la luz.

Durante este período de incubación, el conjugado se unirá a los anticuerpos anti-nucleares del paciente que se han unido a los antígenos celulares. Esta unión del conjugado da como resultado la presencia de fluorescencia en las pocilas tras la incubación. Lave la placa con tampón de lavado.

Como antes, coloque un cubreobjetos sobre una toalla de papel y aplique medio de montaje en una línea continua en el borde inferior del cubreobjetos. Retire cada portaobjetos del tampón de lavado y golpee suavemente el portaobjetos. Para eliminar el exceso de tampón de lavado, toque el borde inferior del portaobjetos con el borde del cubreobjetos.

Baje suavemente la preparación sobre el cubreobjetos de manera que el medio de montaje presente en el cubreobjetos fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin formar burbujas de aire. Aplicar la cantidad óptima de medio de montaje es una técnica que requiere práctica para lograr una visualización perfecta. Observe las preparaciones con un microscopio de fluorescencia ubicado en una habitación oscura, y realice un barrido de todo el pocillo utilizando un objetivo de 20x o 25x. Para evaluar la distribución celular y la uniformidad de la fluorescencia, cambie a un objetivo de 40x.

Para realizar la interpretación final sobre la positividad y el patrón, observe los controles positivo y negativo. El control negativo puede no aparecer completamente oscuro, pero a menudo mostrará una fluorescencia inespecífica de bajo nivel. El control positivo mostrará una fluorescencia verde manzana brillante en el núcleo.

La positividad puede calificarse utilizando una escala de reactividad que va de uno más a cuatro más. Además de la interpretación manual, las laminillas pueden cargarse y escanearse mediante el microscopio de fluorescencia automatizado. No es necesario un cuarto oscuro.

Después de crear un proyecto seleccionando el tipo de portaobjetos adecuado, el instrumento adquiere y almacena imágenes digitales de alta resolución de las células en cada pocillo. Además, Nova View mide la intensidad de la luz fluorescente y clasifica los resultados como positivos o negativos, y proporciona reconocimiento de patrones para muestras positivas. Las imágenes son visualizadas por el operador en un monitor informático de alta resolución, lo que permite la interpretación final, revisión y confirmación de Nova View.

Los informes de resultados pueden generarse a partir de resultados confirmados. La unión de autoanticuerpos a las estructuras proteicas constituyentes dentro del núcleo da lugar a cinco patrones nucleares principales, incluyendo homogéneo, moteado, centromérico, nucleolar y punto nuclear. Para identificar un patrón homogéneo como el mostrado aquí, identifique células mitóticas o en división.

Las células mitóticas presentan una fluorescencia uniforme y sólida, que a menudo es más pronunciada que en las células en reposo. Los núcleos de las células en reposo deben ser uniformes con tinción difusa. Este patrón característico es muy probablemente el resultado de autoanticuerpos contra el ADN de doble cadena.

Una característica clave del patrón moteado es la apariencia de ranura de monedas en las células mitóticas en metafase. La región cromosómica de estas células es negativa. Las células en reposo muestran un patrón moteado en todo el núcleo.

La fluorescencia en manchas puede definirse como gruesa o fina. La fluorescencia en manchas gruesa es el resultado de autoanticuerpos contra SM y RNP. La fluorescencia en manchas fina puede deberse a autoanticuerpos contra S-S-A-S-S-B, así como contra la ARN polimerasa.

El patrón DFS se denomina moteado denso y fino, y es indicativo de autoanticuerpos contra DFS 70. Las células mitóticas muestran tinción moteada, mientras que las células en reposo presentan motas finas uniformemente distribuidas en todo el núcleo. En estos casos, se deben realizar pruebas confirmatorias, ya que los autoanticuerpos anti-DFS 70 son prevalentes en individuos sanos en comparación con pacientes que padecen enfermedades del tejido conectivo.

Para identificar el patrón del centrómero, examine las pocilas e identifique las células mitóticas o en división. Las células en división presentan numerosos puntos discretos en estrecha asociación entre sí, comúnmente denominados barra de metafase. Las células en reposo muestran aproximadamente de 40 a 60 puntos discretos distribuidos a lo largo del núcleo.

El patrón centromérico está asociado con autoanticuerpos contra proteínas centroméricas con el patrón nucleolar. La tinción de la región cromosómica en células mitóticas es variable. El patrón nucleolar se asocia con tinción homogénea o en manchas de los núcleos, junto con tinción débil, en manchas o homogénea del nucleoplasma de los núcleos de células en reposo.

Este patrón está asociado con autoanticuerpos contra la polimerasa de ARN tres, la fibrilina y los anticuerpos PM-Scl. El patrón de puntos nucleares se asocia con células mitóticas negativas en metafase y con pocos puntos discretos en los núcleos de células en reposo. Este patrón característico suele ser el resultado de autoanticuerpos contra SP-100, PML o colina P-80.

Estos anticuerpos están asociados con la cirrosis biliar primaria y la hepatitis autoinmune. En la imagen mostrada, el patrón de puntos nucleares muestra tinción citoplasmática debido a autoanticuerpos contra antígenos mitocondriales. La detección de anticuerpos antinucleares y el reconocimiento de patrones sirven como una herramienta importante para ayudar en el diagnóstico del paciente.

Comprender la importancia de los diversos patrones permite a los clínicos y al personal de laboratorio realizar pruebas de seguimiento adecuadas. Los factores más importantes para identificar correctamente los patrones de anticuerpos antinucleares son seleccionar un sustrato celular de alta calidad y procesar las laminillas con una técnica constante y adecuada. La lectura de las laminillas se realiza tradicionalmente mediante microscopía de fluorescencia en habitaciones oscuras, y la llevan a cabo tecnólogos capacitados que están familiarizados con los distintos patrones en el contexto del ciclo celular y la morfología celular.

En los últimos años, se han desarrollado sistemas de imagen digital para la lectura automatizada de las láminas; estos instrumentos automatizan el flujo de trabajo y aumentan la consistencia en la lectura e interpretación. Además, con el uso de láminas con código de barras, la trazabilidad de las muestras durante todo el proceso elimina errores potenciales de transcripción y mejora la integridad de los datos y la seguridad del paciente. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar cada paso del procedimiento de inmunofluorescencia indirecta y cómo identificar los patrones de anticuerpos antinucleares clínicamente relevantes.