Medición de los cambios en la sensibilidad táctil en la pata trasera de ratones utilizando un aparato electrónico de von Frey
19 de diciembre de 2013
Las mediciones electrónicas de von Frey son una alternativa eficaz y mejorada a los filamentos clásicos de von Frey, ya que permiten una medición rápida y precisa de los cambios en los umbrales de retirada mecánica de los roedores a los estímulos de presión aplicados continuamente antes y después de un evento inflamatorio.
El objetivo general de este procedimiento es medir las respuestas no susceptibles a la presión mecánica en la pata trasera de ratones. Esto se logra primero colocando a los animales sobre un piso de malla metálica y permitiéndoles habituarse cuando estén listos. Se aplica una punta de polipropileno al lado inferior de la pata trasera, y la presión se incrementa gradualmente.
Cuando se observa la respuesta conductual adecuada, se retira el estímulo. Una vez recopilados los valores basales, los animales reciben una intervención experimental antes de realizar más pruebas. Finalmente, se comparan los cambios en los umbrales de retirada de la pata trasera entre los grupos de tratamiento para determinar el efecto de un tratamiento particular sobre los cambios en la sensibilidad táctil a la presión.
El dolor es un componente fundamental de la inflamación. Es importante medir y caracterizar el dolor en diferentes contextos. Este método relativamente sencillo de evaluación del dolor puede aplicarse a muchos modelos diferentes de inflamación.
La demostración del procedimiento estará a cargo de Tiana ov, una técnica de investigación en mi laboratorio, Madison Mack, quien participó en este trabajo como estudiante de pregrado, y Akila Sykes, actualmente estudiante de pregrado en mi laboratorio. Comenzamos configurando el aparato de prueba para facilitar el acceso a las patas traseras.
Coloque cámaras individuales encima de un suelo de malla. El suelo de malla debe estar a una altura cómoda y sobre una superficie estable. A continuación, coloque el aparato electrónico Von Frey sobre la superficie del banco.
Asegúrese de que la sonda y el cable estén conectados adecuadamente a la unidad de visualización y encienda el instrumento en el modo de configuración. Ajuste la lectura a cero y coloque suavemente el peso de prueba proporcionado sobre el cono de la sonda Von Frey. Registre la lectura y repita este procedimiento nuevamente al final de la prueba; si existe una discrepancia entre los dos valores, es posible que sea necesario recalcular el aparato.
Seleccione una punta de polipropileno del tamaño adecuado para el tejido que se va a probar. Las puntas rígidas funcionan bien para el tejido de la pata trasera, que es menos sensible y más resistente. Monte suavemente la punta sobre el cono del sensor.
A continuación, cambie del modo de configuración al modo de operación. Esto mostrará la presión máxima aplicada cuando se retraiga la sonda. Se necesitan dos investigadores para medir los umbrales de retirada de la pata trasera.
Uno para operar el aparato y realizar las mediciones, y otro para registrar dichas mediciones con el fin de reducir el sesgo. El investigador que opere el anestesiómetro debe estar cegado respecto a los tratamientos, así como a los valores registrados del umbral de retirada. Además, para garantizar la consistencia entre las mediciones, la misma persona debe registrar todos los valores basales y del umbral de retirada.
48 horas antes del tratamiento, se registran el primer conjunto de mediciones basales. Coloque material absorbente debajo del soporte para recoger los desechos excretados. Después de colocar la punta y cero el sensor, el experimentador que registra las mediciones debe colocar los ratones en cámaras individuales.
Cubra las cámaras con tapas perforadas y coloque un objeto pesado encima. Para evitar que los ratones escapen, permita que los ratones se aclimaten a la cámara durante 15 minutos antes de continuar. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades con la aplicación gradual de presión incrementada y con el establecimiento de una consistencia interna en sus propias mediciones; la práctica es esencial para obtener resultados reproducibles.
Cuando esté listo, utilice ambas manos para elevar lentamente la sonda y estimular la planta del pie de la pata trasera izquierda o derecha. Aumente gradualmente la presión hasta observar un comportamiento nociceptivo. Estos se identifican por la retracción de la pata trasera, el lamido de la pata trasera o el salto de la pata.
Indique al otro investigador que registre la presión que provocó el comportamiento observado. Durante la medición, es útil animar al ratón a permanecer quieto colocando un alimento justo fuera de la cámara o haciendo un ruido leve, como un golpe suave, antes de tomar la medición. Continúe con el siguiente ratón hasta que cada uno haya sido evaluado una vez y repita este procedimiento otras cuatro veces.
Después de recopilar cinco valores basales, obtenga un promedio para cada ratón. Repita las mediciones basales 24 horas después y utilice estos valores para calcular otro promedio. Para asegurar que todos los ratones tengan respuestas basales consistentes, excluya los animales con un umbral promedio de retirada basal inferior a 3,5 gramos o cuyos umbrales basales difieran en dos gramos o más.
Por último, asigne ratones a grupos de tratamiento separados de manera que el promedio de la línea base de retirada de cada uno sea lo más similar posible. Aquí, los umbrales de retirada se midieron tras la administración en la pata trasera del veneno, ROS raca. Los ratones tratados con solución salina como control mostraron poco cambio en comparación con la línea base en todos los momentos.
Las pruebas de respuestas nociceptivas en ratones tratados se mantuvieron claramente hasta seis horas. Además, el edema tisular, característico de la inflamación, fue evidente en las patas traseras tratadas con veneno, pero no con solución salina. Los cambios inducidos por el veneno en la sensibilidad táctil se acompañaron de una afluencia de neutrófilos casi mil veces mayor.
En comparación con las patas traseras tratadas con solución salina, en las que las células cebadas plantares del tejido de la pata trasera estaban en gran parte intactas o mostraban una desgranulación leve, en las patas traseras apareadas se observó una desgranulación moderada y extensa de las células cebadas del 15 al 20 %. Esta técnica puede adaptarse para evaluar la sensibilidad mecánica o táctil en una amplia variedad de tejidos distintos de la pata trasera.
Por lo tanto, esta técnica puede incorporarse en muchos modelos roedores diferentes de inflamación y dolor.
Descripción general
Este artículo presenta un método para medir las respuestas nociceptivas a la presión mecánica en la pata trasera de ratones mediante mediciones electrónicas con von Frey. Esta técnica permite una evaluación rápida y precisa de los cambios en los umbrales mecánicos de retirada antes y después de intervenciones inflamatorias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Evaluación conductual
- Modelos de inflamación
Antecedentes
- La medición del dolor es fundamental para comprender la inflamación.
- El aparato electrónico de von Frey ofrece ventajas frente a los métodos clásicos.
- La medición precisa de los umbrales de retirada es esencial para la reproducibilidad.
- Este método puede adaptarse a diversos modelos de roedores.
Objetivo del estudio
- Evaluar la sensibilidad mecánica en respuesta a estímulos de presión.
- Evaluar los efectos de los tratamientos sobre el comportamiento nociceptivo.
- Establecer un método confiable para la evaluación del dolor en la investigación.
Métodos Utilizados
- Habituación de ratones sobre un suelo de malla metálica.
- Aplicación gradual de presión mediante una punta de polipropileno.
- Registro de los umbrales de retirada por dos investigadores ciegos.
- Comparación de las mediciones basales y posteriores al tratamiento.
Resultados principales
- Se observaron cambios significativos en los umbrales de retirada tras el tratamiento.
- La inflamación se caracterizó por edema tisular e influxo de neutrófilos.
- La desgranulación de los mastocitos varió entre los grupos de tratamiento.
- El método demostró adaptabilidad para diversos tejidos.
Conclusiones
- El método electrónico de von Frey es eficaz para evaluar el dolor en roedores.
- Esta técnica puede mejorar la comprensión de los mecanismos del dolor inflamatorio.
- Proporciona una base para futuros estudios sobre el dolor y la eficacia de los tratamientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de los cambios en la sensibilidad táctil en modelos de roedores proporciona datos fundamentales en fase temprana para la validación de dianas analgésicas y la reducción de riesgos mecanicistas en el desarrollo de terapias para el dolor. El método electrónico de von Frey permite mediciones rápidas y cuantitativas de los umbrales mecánicos de retirada, facilitando la evaluación preclínica reproducible de modelos de dolor inflamatorio y neuropático. Este enfoque mejora la confianza predictiva sobre la interacción con la diana y la eficacia del tratamiento antes de avanzar con compuestos hacia estudios de fases posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con las vías nociceptivas y los mecanismos de modulación del dolor.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico al proporcionar lecturas cuantificables y controladas internamente de la sensibilidad táctil entre grupos de tratamiento.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras mediante la comparación objetiva de los umbrales de retirada basales y posteriores a la intervención para evaluar la modulación del blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para cribados posteriores mediante el establecimiento de mediciones táctiles basales estandarizadas.
- Reproducibilidad: Permite mediciones consistentes y repetidas en períodos cortos de tiempo, favoreciendo la estandarización del ensayo y la comparabilidad entre grupos.
- Escalabilidad: Permite múltiples mediciones por sujeto, aumentando el rendimiento y la fiabilidad en campañas de cribado de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la alodinia mecánica inducida por inflamación, en concordancia con los fenotipos clínicos del dolor en condiciones inflamatorias y neuropáticas.
- Continuidad traslacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al proporcionar resultados cuantificables de sensibilidad al dolor mecanísticamente relevantes.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar basadas en cambios reproducibles en los umbrales de retirada tras intervenciones experimentales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método electrónico de von Frey se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y las pruebas preclínicas de eficacia, especialmente para compuestos que modulan el dolor.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al medir las respuestas nociceptivas a la presión mecánica como lectura funcional del acoplamiento al blanco.
- Tamizaje: Proporciona salidas cuantitativas reproducibles y listas para ensayos, esenciales para la evaluación confiable de compuestos en modelos del dolor.
- Analítica: Ofrece mediciones precisas del umbral de retirada y comparabilidad estadística entre condiciones basales y de tratamiento.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante resultados de sensibilidad mecánica relevantes para la enfermedad en modelos de inflamación.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad de plataforma reutilizable en múltiples modelos de dolor inflamatorio y neuropático, reduciendo el desarrollo redundante de ensayos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al reducir la ambigüedad mecanicista en la modulación de las vías del dolor.
- Valor operativo: Proporciona mediciones estandarizadas y reproducibles de la sensibilidad táctil con variabilidad técnica mínima.
- Valor estratégico: Mejora la calidad de las decisiones de avance o interrupción del desarrollo, aumentando la eficiencia del capital y reduciendo la deserción en fases avanzadas debido a la falta de eficacia mediada por el blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de compuestos basada en riesgos, según sus efectos cuantificables sobre los umbrales mecánicos de retirada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en observación del comportamiento y en la identificación de respuestas nociceptivas para garantizar la consistencia de las mediciones.
- Depende de un aparato electrónico von Frey calibrado y de la selección adecuada de puntas de polipropileno para el tejido de la pata trasera.
- Exige el enmascaramiento de los operadores y registradores respecto a las condiciones de tratamiento para minimizar el sesgo en el registro del umbral.
- Incluye criterios de exclusión basados en la variabilidad del umbral basal para asegurar la homogeneidad entre grupos y la integridad de los datos.
- Se limita a respuestas conductuales medibles; requiere puntos finales nociceptivos claros, como el retiro de la pata, lamido o salto.
