Medición de los cambios en la sensibilidad táctil en la pata trasera de ratones utilizando un aparato electrónico de von Frey
19 de diciembre de 2013
Las mediciones electrónicas de von Frey son una alternativa eficaz y mejorada a los filamentos clásicos de von Frey, ya que permiten una medición rápida y precisa de los cambios en los umbrales de retirada mecánica de los roedores a los estímulos de presión aplicados continuamente antes y después de un evento inflamatorio.
El objetivo general de este procedimiento es no medir las respuestas susceptivas a la presión mecánica en la pata trasera de los ratones. Esto se logra colocando primero a los animales en un piso de malla de alambre y permitiéndoles habituarse cuando estén listos. Se aplica una punta de polipropileno en la parte inferior de la pata trasera y la presión aumenta gradualmente.
Cuando se observa la respuesta conductual adecuada, se retira el estímulo. Una vez que se recopilan los valores de referencia, los animales reciben una intervención experimental antes de realizar más pruebas. En última instancia, los cambios en los umbrales de retirada de las patas traseras se comparan entre los grupos de tratamiento para determinar el efecto de un tratamiento en particular sobre los cambios en la sensibilidad táctil a la presión.
El dolor es un componente cardinal de la inflamación. Es importante medir y caracterizar el dolor en diferentes contextos. Este método relativamente simple de evaluación del dolor se puede aplicar a muchos modelos diferentes de inflamación.
La demostración del procedimiento estará a cargo de Tiana, una técnica de investigación en mi laboratorio, Madison Mack, que participó en este trabajo como estudiante universitario, y Akila Sykes. Actualmente soy estudiante de pregrado en mi laboratorio. Comience por configurar el aparato de prueba para facilitar el acceso a las patas traseras.
Coloque cámaras individuales encima de un piso de malla. El suelo de malla debe estar a una altura cómoda y sobre una superficie resistente. A continuación, coloque el aparato electrónico Von Frey en la mesa de trabajo.
Asegúrese de que la sonda y el cable estén correctamente conectados a la unidad de visualización y encienda el instrumento en el modo de configuración. Ajuste la lectura a cero y coloque suavemente el peso de prueba proporcionado en el cono de la sonda Von Frey. Registre la lectura y repita este procedimiento nuevamente al final de la prueba, si hay una discrepancia entre los dos valores, es posible que sea necesario recalibrar el aparato.
Seleccione una punta de polipropileno del tamaño adecuado para el tejido que se va a analizar. Las puntas rígidas funcionan bien para el tejido menos sensible y más duro de la pata trasera. Monte suavemente la punta en el cono de la sonda.
A continuación, cambie del modo de configuración al modo de operación. Esto mostrará la presión máxima aplicada cuando la sonda esté retraída. Se necesitan dos investigadores para medir los umbrales de retirada de las patas traseras.
Uno, para operar el aparato y realizar las mediciones, y otro para registrar esas mediciones con el fin de reducir el sesgo. El investigador que opera la TER de anestesia debe estar ciego a los tratamientos, así como a los valores umbral de retiro registrados. Además, para garantizar la coherencia entre las mediciones, la misma persona debe registrar todos los valores de referencia y de umbral de retirada.
48 horas antes del tratamiento, se registra el primer conjunto de mediciones basales. Coloque material absorbente debajo del soporte para recoger los desechos excretados. Después de montar la punta y poner a cero la sonda, el experimentador que registra las mediciones debe colocar los ratones en cámaras individuales.
Cubra las cámaras con tapas perforadas y coloque un objeto pesado encima. Para evitar que los ratones se escapen, permita que se aclimaten a la cámara durante 15 minutos antes de continuar. Generalmente, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades con la aplicación gradual de una mayor presión, y con el establecimiento de la consistencia interna con sus propias mediciones, la práctica es esencial para generar resultados reproducibles.
Cuando esté listo, use las dos manos para levantar la sonda lentamente y estimular la almohadilla de la pata trasera izquierda o derecha. Aumentar la presión gradualmente hasta que se observe un comportamiento nociceptivo. Estos se identifican por la retracción de la pata trasera, el lamido de la pata trasera o para saltar la pata.
Indique al otro investigador que registre la presión que provocó el comportamiento observado. Durante la medición, es útil animar al ratón a quedarse quieto colocando un paladar justo fuera de la cámara o haciendo un ligero ruido, como un suave golpecito, antes de realizar la medición. Continúe con el siguiente ratón hasta que cada uno haya sido probado una vez y repita este procedimiento cuatro veces más.
Después de recopilar cinco valores de referencia, obtenga un promedio para cada mouse. Repita las mediciones de referencia 24 horas más tarde y utilice estos valores para calcular otro promedio. Para asegurarse de que todos los ratones tengan respuestas basales consistentes, excluya a los animales con un umbral de retirada basal promedio inferior a 3,5 gramos o con umbrales basales que difieren en dos gramos o más.
Por último, asigne a los ratones a grupos de tratamiento separados para que la línea de base de retirada media de cada uno sea lo más similar posible. Aquí, los umbrales de retirada se midieron después de la pata trasera, administración del veneno, ROS raca. Control tratado con solución salina. Los ratones mostraron pocos cambios en comparación con la línea de base en todo momento.
Las respuestas nociceptivas de los ratones tratados se mantuvieron claramente hasta seis horas. Además, el edema tisular, característico de la inflamación, fue evidente en el veneno, pero no en las patas traseras tratadas con solución salina. Los cambios inducidos por el veneno en la sensibilidad táctil fueron acompañados por una afluencia de neutrófilos de casi 1000 veces.
En comparación con las patas traseras tratadas con solución salina en las patas tratadas con solución salina, los mastocitos plantares en el tejido de la pata trasera estaban en gran parte intactos o mostraban una degranulación leve. Por el contrario, en la parte posterior apareada mostró una degranulación moderada y extensa de los mastocitos de 15 a 20%. Esta técnica se puede adaptar para evaluar la sensibilidad mecánica o táctil en una amplia gama de tejidos distintos de la pata trasera.
Por lo tanto, esta técnica se puede incorporar en muchos modelos diferentes de inflamación y dolor en roedores.
Visión general
Este artículo presenta un método para medir las respuestas nociceptivas a la presión mecánica en la pata trasera de ratones utilizando mediciones electrónicas von Frey. Esta técnica permite una evaluación rápida y precisa de los cambios en los umbrales de retirada mecánica antes y después de intervenciones inflamatorias.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Evaluación conductual
- Modelos de inflamación
Antecedentes
- Medir el dolor es crucial para comprender la inflamación.
- El aparato electrónico von Frey ofrece ventajas sobre los métodos clásicos.
- La medición precisa de los umbrales de retirada es esencial para la reproducibilidad.
- Este método puede adaptarse para varios modelos de roedores.
Propósito del estudio
- Evaluar la sensibilidad mecánica en respuesta a estímulos de presión.
- Evaluar los efectos de los tratamientos sobre el comportamiento nociceptivo.
- Establecer un método confiable para la evaluación del dolor en la investigación.
Métodos utilizados
- Habituación de ratones en un piso de malla metálica.
- Aplicación gradual de presión usando una punta de polipropileno.
- Registro de umbrales de retirada por dos investigadores cegados.
- Comparación de las mediciones de línea base y post-tratamiento.
Principales resultados
- Se observaron cambios significativos en los umbrales de retirada después del tratamiento.
- La inflamación se caracterizó por edema tisular e infiltración de neutrófilos.
- La desgranulación de mastocitos varió entre los grupos de tratamiento.
- El método demostró adaptabilidad para varios tejidos.
Conclusiones
- El método electrónico von Frey es efectivo para evaluar el dolor en roedores.
- Esta técnica puede mejorar la comprensión de los mecanismos del dolor inflamatorio.
- Proporciona una base para futuros estudios sobre el dolor y la eficacia del tratamiento.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Assessing tactile sensitivity changes in rodent models provides critical early-phase data for analgesic target validation and mechanistic de-risking in pain therapeutics development. The electronic von Frey method enables rapid, quantitative measurement of mechanical withdrawal thresholds, supporting reproducible preclinical evaluation of inflammatory and neuropathic pain models. This approach enhances predictive confidence in target engagement and treatment efficacy before advancing compounds into later-stage studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to nociceptive pathways and pain modulation mechanisms.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing quantifiable, internally controlled tactile sensitivity readouts across treatment groups.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage through objective comparison of baseline and post-intervention withdrawal thresholds to assess target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized baseline tactile sensitivity measurements.
- Reproducibility: Enables consistent, repeated measurements within short time periods, supporting assay standardization and cross-group comparability.
- Scalability: Allows multiple measurements per subject, increasing throughput and reliability for compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models inflammation-induced mechanical allodynia, aligning with clinical pain phenotypes in inflammatory and neuropathic conditions.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing mechanistically relevant, quantifiable pain sensitivity outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on reproducible changes in withdrawal thresholds following experimental interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The electronic von Frey method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for pain-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring nociceptive responses to mechanical pressure as a functional readout of target engagement.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs essential for reliable compound evaluation in pain models.
- Analytics: Provides precise withdrawal threshold measurements and statistical comparability across baseline and treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through disease-relevant mechanical sensitivity outcomes in inflammation models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across multiple inflammatory and neuropathic pain models, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pain pathway modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible tactile sensitivity measurements with minimal technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhancing capital efficiency and reducing late-stage attrition due to lack of target-mediated efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on quantifiable effects on mechanical withdrawal thresholds.
Implementation Considerations
- Requires training in behavioral observation and nociceptive response identification to ensure measurement consistency.
- Dependent on calibrated electronic von Frey apparatus and appropriate polypropylene tip selection for hind paw tissue.
- Necessitates blinding of operators and recorders to treatment conditions to minimize bias in threshold recording.
- Involves exclusion criteria based on baseline threshold variability to ensure group homogeneity and data integrity.
- Limited to measurable behavioral responses; requires clear nociceptive endpoints such as paw withdrawal, licking, or jumping.
