Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal
15 de junio de 2014
Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.
El objetivo general del siguiente experimento es hacer pasar eficientemente las neuroesferas para que el contacto de célula a célula se mantenga durante toda la vida útil de las células cultivadas. Esta técnica crea las condiciones de expansión necesarias para las células progenitoras neurales humanas. Esto se logra combinando hasta dos matraces T 1 75 de las mismas celdas y transfiriéndolos a un tubo cónico, lo que permite la transferencia de las esferas a una placa de Petri como un segundo paso condensado en neuroesferas suspendidas en una masa manejable en la placa de Petri, lo que permite que la cuchilla corte los NPC H en pequeños grupos.
A continuación, las neuroesferas pasadas o cortadas se resuspenden para eliminar las células de la placa de Petri y el cuat en los nuevos frascos. Se obtienen resultados que muestran que la técnica de picado proporciona una estrategia de crecimiento a largo plazo basada en las curvas de expansión, demostrando tasas de crecimiento logarítmicas a largo plazo en comparación con las células pasadas a través del enfoque enzimático estándar. La demostración visual de esta técnica es fundamental como esfera.
Los pasos de condensación son difíciles de describir por escrito. También hay varios trucos para ayudar en el proceso. Si el exceso de medio no se elimina por completo de la placa de Petri, las esferas simplemente se empujarán en el medio en lugar de dividirse en grupos más pequeños.
Comience este procedimiento abordando el color del matraz de los NPC H. Escanee a través del matraz bajo un microscopio para observar las células. Si es posible, use un radical para examinar el tamaño de varias esferas.
Si muchas esferas tienen un diámetro de 300 micrómetros o más, continúe con el proceso de picado y corte las células cada siete a 10 días. A continuación, vuelva a colocar el matraz en la incubadora y configure la picadora. Encienda el interruptor de encendido de la picadora.
En el BSC, ajuste el grosor de corte a 200 micrómetros y la fuerza de la cuchilla a 180 grados o la posición de las nueve en punto. A continuación, confirme que la perilla de velocidad automática esté girada lo más posible en sentido contrario a las agujas del reloj. Luego, mueva la perilla de liberación de la mesa lo más a la derecha posible y confirme que el soporte de la placa esté estable.
Gire el manipulador de brazo manual en el sentido de las agujas del reloj para elevar el brazo a su nivel máximo. Después de eso, transfiera asépticamente una cuchilla de corte estéril de doble filo al perno del brazo picador. Con un par de pinzas, coloque el broche sobre la hoja con las pinzas.
La parte curva del broche debe estar sobre el borde superior del brazo. A continuación, sujete el cierre en el brazo y asegure la tuerca en el perno. Con el destornillador de tuercas estéril dejando la tuerca un cuarto de vuelta suelta.
En este procedimiento, transfiera la cantidad sugerida de medios de mantenimiento al nuevo matraz. Después de eso, transfiera asépticamente las células de la incubadora al BSC. Apoye el matraz en una rejilla de tubos y deje que las esferas se asienten en el matraz.
Uno se conformó. Aspirado hasta 12 mililitros de sobrenadante. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, enjuague todas las esferas poco adheridas de la superficie del matraz.
Repita tantas veces como sea necesario y deje que las esferas se asienten entre Rens. A continuación, transfiera el volumen sugerido de medios acondicionados al nuevo matraz. A continuación, transfiera todos los medios y esferas acondicionados restantes a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Deje que las esferas se asienten y deseche el matraz usado. Después de eso, transfiera lentamente las celdas del tubo cónico de 15 mililitros a la placa de Petri de 60 milímetros o al disco de cuña en el volumen más bajo posible. Conserve el medio acondicionado restante, ya que se utilizará para enjuagar las células del plato después de picar.
Trate de minimizar el área de superficie cubierta por los medios y las esferas en el plato. A continuación, comience a condensar la piscina de esferas transfiriendo la súper natina nuevamente al tubo cónico de 15 mililitros. Retire la mayor cantidad de medios posible de la parte superior del grupo de celdas de medios con un micropipeteador con punta de barrera de aerosoles.
Hasta que no sea posible eliminar el medio sin esferas, extienda el grupo. Usando el lado de la punta de la pipeta para aumentar el área de superficie, incline ligeramente la placa de Petri y use el lado de la punta de la pipeta para deslizar suavemente todas las esferas hacia un lado de la piscina. Después de que todas las células se hayan reubicado, incline lentamente la placa de Petri en la dirección opuesta para permitir que los medios se separen de las esferas.
Luego, transfiera el medio aclarado nuevamente al tubo cónico de 15 mililitros. Utilice el lado de la punta de la pipeta para deslizar suavemente todas las esferas hacia el centro de la placa de Petri. Por lo tanto, la piscina tiene un diámetro de 0,5 a 2,4 centímetros.
Es importante mantener la profundidad de la piscina esférica poco profunda. Si la piscina es demasiado profunda, las esferas se apartarán durante el corte. Ahora, transfiera la placa de Petri al soporte de la placa y asegúrela debajo de los ganchos del soporte de la placa.
Use la perilla de liberación de la mesa para deslizar el soporte de la placa hacia la izquierda para que la cuchilla quede alejada de las esferas y bloqueada en el engranaje. A continuación, baje el brazo picador girando la perilla del manipulador manual en el sentido de las agujas del reloj hasta que la cuchilla caiga plana sobre la placa de Petri. Presione hacia abajo el soporte del brazo mientras aprieta la tuerca.
A continuación, pulse el botón de reinicio. Una vez que estabilice la placa de Petri con una mano mientras gira la perilla del manipulador de brazo automático en el sentido de las agujas del reloj a la posición de 90 grados o 12 en punto, comience a picar cuando se hayan cortado todas las esferas. Gire el soporte de la placa 90 grados.
Luego afloje el perno, baje el brazo y vuelva a apretar la tuerca. Repita el procedimiento de corte. Después de eso, transfiera asépticamente la placa de Petri del soporte de la placa a un espacio de trabajo en el BSC.
Transfiera un mililitro de medio acondicionado a las esferas picadas. A continuación, vuelva a suspender y transfiera suavemente las esferas picadas a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Trate de evitar la formación de burbujas y repita tantas veces como sea necesario para recoger las esferas picadas.
Mida el volumen de los medios acondicionados y las esferas picadas. Agregue la cantidad adecuada de medios de mantenimiento para lograr el volumen sugerido en la columna E. Después de eso, Eloqua coloca la suspensión de la esfera en cada matraz nuevo solo transfiere la suspensión de la esfera a un matraz a la vez y vuelve a suspender las esferas entre transferencias. El volumen final de cada matraz debe ser igual al volumen sugerido en la tabla dos, columna F. Coloque los NPC h picados en la incubadora.
Esta figura muestra el número de células proyectadas de las NPC H congeladas en el pasaje 19, luego descongeladas y expandidas como una monocapa adherente mediante disociación enzimática en comparación con las neuroesferas pasadas mediante el método de corte. Aquí están las imágenes representativas de esferas pre-cortadas y post-cortadas con un aumento de 10x. Esta imagen muestra el paso de deshielo 29 NPCs H que han sido sembrados durante un día y teñidos para el nido y la expresión, mientras que esta imagen muestra el pasaje de deshielo 29 H NPCs que han sido sembrados durante siete días en ausencia de factores de crecimiento y teñidos para GFAP y beta tres tubulina.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la técnica de corte automatizado para pasar los HBC, que mantiene el contacto de célula a célula durante toda la vida útil de las células y el cultivo. Este procedimiento se puede adaptar a multitud de tipos de células, como las neuro células madre derivadas de células pluripotentes o las cardio esferas.
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Resumen
Este protocolo describe un nuevo método mecánico de corte que permite la expansión de agregados esféricos de células madre y progenitoras neurales sin disociarlos a una suspensión de células individuales. Mantener el contacto célula/célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación con células madre
Antecedentes
- El paso eficiente de neuroesferas es crucial para mantener la viabilidad celular.
- Los métodos tradicionales suelen interrumpir el contacto entre célula y célula.
- Este estudio explora una técnica mecánica de corte para mejorar el crecimiento.
- Las estrategias de crecimiento a largo plazo son esenciales para las células progenitoras neurales humanas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método que mantenga el contacto entre células durante el pase.
- Comparar las tasas de crecimiento de neuroesferas troceadas frente a los métodos enzimáticos estándar.
- Proporcionar una demostración visual de la técnica de troceado.
Métodos Utilizados
- Combinar hasta dos matraces T 1 75 con las mismas células.
- Transferir las células a un tubo cónico para su procesamiento posterior.
- Cortar los agregados en cúmulos pequeños utilizando una hoja.
- Resuspender las neuroesferas troceadas para su transferencia a nuevos matraces.
Resultados Principales
- La técnica de picado favorece tasas de crecimiento logarítmico a largo plazo.
- Los resultados indican un mejor crecimiento en comparación con los métodos tradicionales.
- Las demostraciones visuales resaltan la eficacia de la técnica.
- Los neuroesferas picados mantuvieron una mejor viabilidad celular a lo largo del tiempo.
Conclusiones
- El método mecánico de corte es eficaz para expandir las células progenitoras neurales.
- Mantener el contacto entre células es crucial para un crecimiento óptimo.
- Esta técnica ofrece una alternativa prometedora al pase enzimático.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método mecánico de corte permite la expansión escalable de agregados de células madre y progenitoras neurales humanas al tiempo que conserva el contacto crítico entre células, abordando un cuello de botella clave en la producción de células madre para aplicaciones tanto de investigación como clínicas. Al evitar la disociación enzimática, la técnica reduce la presión de diferenciación y el riesgo de senescencia, favoreciendo la producción constante de productos celulares neurales relevantes clínicamente bajo condiciones de cGMP. Esto sitúa al método como una herramienta valiosa para reducir los riesgos en la validación temprana de dianas neuronales y posibilitar la generación reproducible de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Mantiene interacciones fisiológicas entre células en cultivos de progenitores neurales, favoreciendo estudios de interacción con dianas más biológicamente relevantes.
- Valor operativo: Permite la expansión a largo plazo durante más de 40 pasajes, proporcionando un suministro sostenido de células para campañas iterativas de validación de dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Produce cultivos homogéneos de esferoides adecuados para formatos de ensayo estandarizados que requieren una arquitectura celular tridimensional.
- Valor operativo: Genera altos rendimientos (>50 millones de células por frasco T175) en comparación con los cultivos adherentes, lo que mejora el rendimiento del cribado y la eficiencia de los reactivos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización relacionada con enfermedades mediante la expansión de células derivadas de células madre pluripotentes o tejido fetal sin deriva fenotípica.
- Valor operativo: Compatible con la fabricación según normas cGMP, lo que facilita la transición sin interrupciones desde la fase de descubrimiento hasta la producción a escala clínica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de corte se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la expansión confiable de células progenitoras neurales para la validación de dianas, el desarrollo de ensayos y la reducción de riesgos mecanicistas antes de la identificación del compuesto líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el cultivo sostenido de agregados neuronales fisiológicamente relevantes.
- Selección: Proporciona resultados reproducibles con un alto número de células, esenciales para la normalización de ensayos y campañas de cribado de compuestos.
- Análisis: Permite la cuantificación de la cinética de expansión y métricas de viabilidad para orientar decisiones de avance o interrupción.
- Investigación Traducional: Mantiene la fidelidad celular desde el descubrimiento hasta la validación preclínica, reduciendo la variabilidad biológica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y automatizada de paseo celular aplicable a múltiples fuentes de células madre neurales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante el mantenimiento del contacto celular nativo y la reducción de artefactos inducidos por el cultivo.
- Valor operativo: El pase mecánico estandarizado minimiza la variabilidad del usuario y apoya procesos escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en programas con objetivos neuronales al garantizar una calidad celular constante a través de los pases.
- Impacto en el portafolio: Permite decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante un suministro confiable de células conforme con las buenas prácticas de fabricación (cGMP) para estudios preclínicos y clínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere capacitación en técnica aséptica y manejo del cortador mecánico.
- Depende del acceso a cuchillas estériles, tubos cónicos, placas de Petri e incubadoras.
- Necesita pasos estandarizados de condensación y resuspensión para garantizar una distribución uniforme del tamaño de las esferas.
- La adaptación entre sistemas modelo puede requerir la optimización del grosor del corte y la fuerza de la cuchilla.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de pasos manuales de eliminación del medio durante la condensación, lo que puede afectar el rendimiento si no se optimizan.
