Name: Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprende el método de corte mecánico para expandir agregados de células madre y progenitoras neuronales humanas sin disociación enzimática. Esta técnica mantiene el contacto célula-célula y permite un crecimiento estable durante más de 40 pasajes.

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Agradecemos al Dr. Soshana Svendsen para la revisión y edición de este informe crítico. Este trabajo ha sido aportada por el NIH / NINDS 1U24NS078370-01 y el CIRM Dr2a-05320.

Los autores no tienen nada que revelar.

<img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Esquema de cortar. Expandiendo las células madre esferoide / progenitoras en la cultura con el método de cortar mecánica. Pasos críticos Una visión general del paradigma de la expansión de picar se muestra en la Figura 6. HNPC tamaño de la esfera es uno de los criteri...

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Brandon C. Shelley 
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Clive Svendsen

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Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Hay una larga historia de la expansión de las células madre neurales de roedores en la cultura, ya sea como una monocapa 1-3 o 4-7 neuroesferas agregados. Además, las células progenitoras neurales humanas (hNPCs) aisladas a partir de diversas regiones del sistema nervioso central en desarrollo 8-17 han sido expandidas in vitro. Estas células son bi-potentes, capaces de diferenciarse en astrocitos y neuronas y han sido una herramienta muy útil en el estudio del desarrollo neural 18,19 y las enfermedades mecanismo de 20,21. hNPCs también se han trasplantado en muchos modelos animales diferentes de enfermedad del sistema nervioso central con diferentes niveles de integración, la supervivencia y efectos funcionales 22-24. Tradicionalmente, roedor o NPC derivadas de fetos humanos están expuestos a factores de crecimiento - factor de frecuencia de crecimiento epidérmico (EGF) y / o factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) 25-28 - y tanto adherente 29 y tresSistemas de esferoide-dimensionales se pasan típicamente usando disociación enzimática en una suspensión de una sola célula 30-34. El método estándar para expandir las células para la investigación o el uso clínico es como una monocapa adherente debido a la fácil manipulación. Sin embargo, hemos demostrado que los pases en monocapa y de neuroesferas con hNPCs enzimática o soluciones químicas resultaron en la senescencia temprana 35. Además, la disociación enzimática puede dar lugar a mayores niveles de diferenciación y anomalías del cariotipo basados ​​en datos demostrados con células madre embrionarias 36-38. Aunque el método estándar de hNPCs pases ha producido buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) productos de calidad que han pasado a la fase 1 de pruebas clínicas (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), el método permite únicamente un par de rondas de amplificación de células, lo que limita la banca potencial. Está claro que los grandes experimentos de investigación y ensayos clínicos futuros podrían beneficiarse de la capacidad depropagar células en grandes cantidades y con el retraso en la senescencia para permitir el crecimiento a gran escala y de bancos de células. Para satisfacer esta necesidad, hemos desarrollado una forma novedosa y automatizado de neuroesferas intactos mecánicamente pases por &quot;picar&quot; en pequeños grupos para mantener el contacto de célula a célula. Este método aumenta en gran medida su vida útil 39 y suspensión de cultivo permite un uso más eficiente del espacio de la incubadora en comparación con cultivos en monocapa, como se ve con un método de cultivo del biorreactor 3D alternativa 40. El protocolo de cortar proporcionado permite la producción de bancos a gran escala a partir de una muestra fetal mayor que el paso 10, una hazaña poco probable utilizando métodos estándar pases. Si bien este método para hNPCs pases es poco convencional, que está creciendo en popularidad y fue recientemente publicado con otros tipos de células, como las células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes inducidas de embriones humanos y, lo que permite la expansión a gran escala para diversas aplicaciones incluyendo en vitro modelado enfermedad 41-46. Es importante destacar que un cGMP grado banco de células hNPC ya se ha producido con el método de cortar, lo que demuestra que la técnica se puede aplicar a futuras aplicaciones clínicas.

<table><tbody><tr><td>Vaso de precipitados, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad, clase II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>modelo de 4 pies o 6 pies.&nbsp; Se recomienda un modelo de 6 pies; varios fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Cuchillas, Preparación de doble filo</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>múltiples fabricantes/proveedores.&nbsp; ATENCIÓN: Medios</td></tr><tr>de<td>congelación de célula</td> afilada <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, centrífuga sin suero</td></tr><tr><td>, cubo giratorio con insertos de 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Tubos cónicos, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>varios fabricantes/ proveedores</td></tr><tr><td>Cepilladora para congeladores de velocidad controlada</td><td></td><td>Kryo 750</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Crioviales, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo, ventilado, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo, ventilado, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Matraz de Cultivo, Ventilado, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Matraz de Cultivo, Ventilado, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0.22 y micro; m, vaso adjunto, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>varios fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0,22 y micro; m, vaso adjunto, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>varios fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0,22 y micro; m, vaso adjunto, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>varios fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Filtro, 0,22 y micro; m, vaso adjunto, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Papel de filtro, círculos de 8,5 cm Pinzas</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>, patrón estándar - Dentado/Curvo/18 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de congelación, alcohol isopropílico</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Incubadora, 37 &deg; C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>serie 370</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Hemacitómetro, Fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD</td><td>&nbsp; Se requiere modificación de la placa de Petri. &nbsp; PRECAUCIÓN:&nbsp; Hoja móvil y afilada.</td></tr><tr><td>Micropipeta, 1-10 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Micropipeta, 100-1,000 &mu; l (kit de inicio)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Micropipeta, 2-20 &mu; l (kit de inicio)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Micropipeta, 20-200 &mu; l (kit de inicio)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Destornillador de tuercas, esterilizable en autoclave, 5/16"</td> <td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur, taponadas de algodón</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td> múltiples <td>fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Placa de Petri, vidrio, esterilizable en autoclave</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>varios fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Disco de cuña</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>varios fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera estéril, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera estéril, 1,000 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera estéril, 20 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de barrera estéril, 200 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Pipetas desechables estériles, envoltura totalmente de plástico, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Pipetas desechables estériles, envoltura de plástico, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Pipetas desechables estériles, envoltura totalmente de plástico, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Estéril Pipetas desechables, envoltura totalmente de plástico, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Bolsas de esterilización, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Colador, 40 y micro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos, 60 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Racks de tubos, entrelazados de cuatro vías</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Progenitor neural Reactivos</td><td></td><td></td><td></td>de procesamiento específicos de células</tr><tr><td>Célula madre neural Medio de expansión (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Importante usar la marca Stemline</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia humana recombinante (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>Azul de tripano (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>múltiples fabricantes/proveedores</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de expansión de gmpc aplicable para agregados de neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Una técnica de expansión de células para acumular grandes cantidades de células a partir de una sola muestra para experimentos de investigación y ensayos clínicos se beneficiaría en gran medida a la comunidad de células madre. Muchos métodos actuales de expansión son laboriosos y costosos, y los que implican la disociación completa pueden causar varios tipos madre y células progenitoras a someterse a la diferenciación o la senescencia temprana. Para superar estos problemas, hemos desarrollado un método de pases mecánica automática que se refiere como &quot;cortar&quot; que es simple y de bajo costo. Esta técnica evita la disociación química o enzimática en células individuales y en su lugar permite la expansión a gran escala de suspensión, cultivos de esferoides que mantienen el contacto célula / célula constante. El método de cortar se ha usado principalmente para células derivadas de cerebro fetal neurales progenitoras o neuroesferas, y recientemente ha sido publicado para su uso con células madre neurales derivadas de células madre pluripotentes embrionarias e inducidos. El procedimiento involvES siembra neuroesferas en un cultivo de tejidos plato de Petri y posteriormente pasa a una, la cuchilla afilada estéril a través de las células de la automatización de manera efectiva el tedioso proceso de manualmente disociar mecánicamente cada esfera. La suspensión de células en cultivo proporciona una relación superficie-área-volumen favorable; como más de 500.000 células pueden ser cultivadas en una sola neuroesfera de menos de 0,5 mm de diámetro. En un matraz T175, más de 50 millones de células pueden crecer en cultivos en suspensión en comparación con sólo 15 millones en cultivos adherentes. Es importante señalar que el procedimiento de cortar ha sido utilizada bajo buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que permite la producción de cantidades masivas de productos celulares de grado clínico.

<img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> El número de células Figura 5. Los datos representativos. A) proyectados de hNPCs congelados en p19, luego descongelados y se expandieron como una monocapa adherente mediante disociación enzimática en comparación con neuroesferas con pases a través del método de cortar. Día 0 representa cuando las células se descongelaron a p20. B) Im...

Este protocolo describe un nuevo método de cortar mecánico que permite la expansión de la madre y de células progenitoras neurales agregados esféricos sin disociación a una única suspensión de células. Mantener el contacto célula / célula permite un crecimiento rápido y estable durante más de 40 pasajes.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en realizar de manera eficiente el paso de los neuroesferoides para mantener el contacto célula a célula durante toda la vida útil de las células cultivadas. Esta técnica crea las condiciones de expansión necesarias para las células progenitoras neurales humanas. Esto se logra combinando hasta dos frascos T175 con las mismas células y transfiriéndolas a un tubo cónico, lo que permite transferir los esferoides a una placa de Petri como segundo paso, concentrando los neuroesferoides en suspensión en una masa manejable sobre la placa de Petri, lo que permite que la cuchilla corte las H NPCs en pequeños cúmulos.A continuación, se resuspenden las neuroesferas pasadas o troceadas para retirar las células de la placa de Petri y sembrarlas en los nuevos frascos. Los resultados obtenidos muestran que la técnica de troceado proporciona una estrategia de crecimiento a largo plazo basada en curvas de expansión que demuestran tasas de crecimiento logarítmico sostenidas en comparación con las células pasadas mediante el enfoque enzimático estándar. La demostración visual de esta técnica es fundamental como una esfera.Los pasos de condensació

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La capacidad de manipular humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs) in vitro permite investigar su utilidad como los trasplantes de células con fines terapéuticos y para explorar el desarrollo neuronal humano. Este protocolo presenta un método de cultivo y hNSPCs pases con la esperanza de la reproducibilidad de cada vez mayor de la investigación con células madre humanas.

Pases células madre neurales humanas

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Este video muestra la generación de células progenitoras neurales a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) transgénicas y no transgénicas. Las hPSCs se diferencian en células progenitoras neurales utilizando un medio de diferenciación neuronal. Mientras que en las células no transgénicas se induce la diferenciación utilizando moléculas pequeñas, las hPSC transgénicas se diferencian mediante la adición de un antibiótico que induce el promotor de un factor de transcripción...

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas transgénicas y no transgénicas en células progenitoras neurales

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Organoides cerebrales representan un nuevo sistema modelo para investigar el cerebro humano desarrollo temprano en vitro. Este artículo proporciona la metodología detallada para generar eficientemente organitas prosencéfalo-tipo dorsal homogéneo de células pluripotentes inducidas humanas incluyendo pasos críticos de la caracterización y validación.

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

Aquí presentamos un método para un modelo humano en vitro de estiramiento lesiones en un formato de 96 pozos en una escala de tiempo pertinente al trauma de impacto. Esto incluye métodos para la fabricación de placas estirables, cuantificar el insulto mecánico, cultivo y lesionar las células, la proyección de imagen y alto contenido análisis para cuantificar daños.

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

Este artículo describe un protocolo para la generación de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos en un biorreactor de suspensión 3D de sobremesa.

Producción de neuronas humanas inducibles por neurogenina 2 en un biorreactor de suspensión tridimensional

Aprende el método de corte mecánico para expandir agregados de células madre y progenitoras neuronales humanas sin disociación enzimática. Esta técnica mantiene el contacto célula-célula y permite un crecimiento estable durante más de 40 pasajes.

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal (Video) | JoVE Journal

Un método de expansión de GMPc aplicable para agregados de Neural humano madre y células progenitoras derivadas de células madre pluripotentes o tejido cerebral fetal

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