Screening de alto rendimiento para los de amplio espectro químico Inhibidores de Virus ARN

El objetivo general de este procedimiento es aislar antivirales de amplio espectro a partir de bibliotecas químicas mediante una combinación de ensayos celulares in vitro. Esto se logra primero seleccionando compuestos que inhiban la replicación in vitro de una cepa recombinante del virus del sarampión que codifica luciferasa como reportero. En paralelo, se estima la toxicidad del compuesto utilizando un ensayo de viabilidad basado en luciferasa.

Los datos fenotípicos combinados de ambos ensayos se utilizan para aislar las moléculas HIT. Los pasos finales consisten en repetir la prueba de los compuestos HIT para confirmar la inhibición de la respuesta a la dosis del virus del sarampión y del virus chikunguña, y medir con mayor precisión la toxicidad in vitro. En última instancia, los compuestos antivirales de amplio espectro se identifican y validan mediante el cribado.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los ensayos estándar de replicación viral basados en efectos citopáticos, es que utiliza la luminiscencia como señal de lectura y combina dos virus altamente divergentes que expresan luciferasa como gen reportero. El procedimiento será demostrado por Olivier Helynck, un técnico del equipo de Helene Munier-Lehmann, y Marianne Lucas-Hourani, una ingeniera que trabaja conmigo en la unidad de investigación de Frédéric Tangy.

Comience calentando hasta temperatura ambiente las placas matrices de 96 pocillos que contienen soluciones stock de 10 milimolares de compuestos químicos en DMSO. Transfiera cinco microlitros de cada compuesto a nuevas placas de 96 pocillos que ya contengan 20 microlitros de DMSO en cada pocillo, creando así placas de dilución intermedia. Ahora, aspire con pipeta un microlitro de estas placas de dilución hacia pocillos secos de placas de cultivo celular blancas de 96 pocillos con códigos de barras.

Estas son las placas D uno y se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos a 20 micromolares. Almacénelas a menos 20 grados Celsius. Ahora prepare nuevas placas a partir de las placas de dilución intermedia que se diluyen adicionalmente 10 veces.

Tome cuatro microlitros de cada compuesto diluido y mézclelos en pozos con 36 microlitros de DMSO. De estas placas, transfiera un microlitro por muestra a pozos secos de placas de cultivo celular blancas, de fondo plano, codificadas con barras, de 96 pozos.

Estas son las placas D y se utilizan para evaluar la inhibición de la replicación del MV. Almacénelas también a menos 20 grados Celsius.

Cultive células HEK-293-T en DMEM suplementado con L-glutamina estabilizada. Cada cuatro a cinco días, pase las células mediante tripsina y realice una dilución de un décimo en matraces frescos.

Durante su fase de crecimiento logarítmico, recolecte y cuente las células para el experimento. Reuspenda las células a 300.000 células por mililitro. Se necesitan 12,5 mililitros de células a esta dilución para cada placa que se vaya a analizar.

Ahora, prepare las placas. Añada una microlitro de DMSO a un conjunto de pozos de control, y añada un microlitro de DMSO y 2,5 microlitros de una solución al 0,5 % de IGEPAL a un segundo conjunto de pozos de control para matar las células. Transfiera la suspensión celular a un depósito y distribuya 100 microlitros en cada pozo de las placas D-uno.

Agite regularmente la suspensión para evitar la sedimentación. Luego incube las placas preparadas durante 24 horas.

Prepare las células para las placas como se hizo en la sección anterior. El medio de cultivo puede suplementarse con uridina para filtrar moléculas antivirales que dirijan sus efectos a las primeras etapas de la biosíntesis de pirimidinas, ya que estas son bastante comunes. Reserve una décima parte de la suspensión celular para los pocillos de control con células no infectadas e infecte el volumen restante. Derrita suficiente solución stock de rMV2-luc para infectar el cultivo con 0,1 partículas infecciosas por célula diana, lo que corresponde a una multiplicidad de infección de 0,1. Añada el volumen calculado de virus a la suspensión celular y mezcle suavemente. Transfiera las células infectadas a un depósito y distribuya 100 microlitros de células infectadas en las placas D-dos. Diríjase a las columnas dos a once, que contienen los compuestos químicos añadidos, y a los pocillos de control positivo en las columnas uno y doce. Mezcle regularmente y con suavidad las células en el depósito. En filas alternas de las columnas uno y doce, distribuya 100 microlitros de células no infectadas. Incube ahora las placas durante 24 horas.

Después del tiempo de incubación, determine la viabilidad de las células de la placa D-one. Mezcle 50 microlitros de reactivo de viabilidad basado en luciferasa en cada pocillo y espere 10 minutos. Luego lea las placas con un luminómetro. Establezca el tiempo de integración en 100 milisegundos por pocillo.

A continuación, determine la replicación del VM en las placas D-dos mezclando 50 microlitros de sustrato de luciferasa de luciérnaga en cada pocillo y esperando seis minutos a temperatura ambiente. Luego, consulte un factor Z para cada placa D-uno y D-dos del ensayo de toxicidad.

Continúe calculando la inhibición de la replicación viral. Los compuestos HIT son aquellos que reducen la replicación viral por debajo del valor de corte aplicado y no son tóxicos.

Para cada compuesto HIT, realice diluciones seriadas en DMSO comenzando en 500 micromoles y avanzando en pasos de mitad hasta cuatro micromoles a lo largo de una columna de una placa de 96 pocillos. Añada un microlitro de la placa de dilución del compuesto a la placa blanca de cultivo de tejidos con código de barras. Repita este proceso dos veces para crear un conjunto triplicado de placas de ensayo. A continuación, complete las placas de cultivo de tejidos con 50 microlitros de medio de cultivo. Prepare ahora 37,5 mililitros de células HEK-293T, suspendidas en DMEM suplementado a 600.000 células por mililitro.

Cargue dos tubos de 15 mililitros con 12,5 mililitros de la suspensión celular cada uno. Infecte un tubo de células con rMV2/luc a una multiplicidad de infección de 0,1. Infecte el segundo tubo de células con chikV recombinante que expresa luciferasa renilla. Utilice una multiplicidad de infección de 0,2. Mezcle ambos tubos de células infectadas con virus mediante inversión. Este procedimiento debe realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad tres debido a la patogenicidad del chikV.

Ahora cargue las células no infectadas y los conjuntos de células infectadas en su propio conjunto de placas de compuestos HIT.

Dispensar 50 microlitros de células por pocillo e incubar las placas a 37 grados Celsius durante 24 horas. Al día siguiente, añadir 50 microlitros de luciferasa de luciérnaga a cada pocillo de células infectadas con rMV2/luc. De manera similar, añadir 50 microlitros de sustrato de luciferasa de renilla a las células infectadas con ChikV-Ren. A las células de control no infectadas, añadir 50 microlitros de reactivo de viabilidad basado en luciferasa.

Proceda determinando las concentraciones del compuesto HIT que inhiben la replicación de MV y ChikV en un 50 %. Además, descarte los compuestos que muestren toxicidad celular.

Esta tubería de cribado se basa en la selección de compuestos que no muestran toxicidad celular significativa e inhiben la replicación tanto del MV como del ChikV, según se determina en las pantallas primaria y secundaria, respectivamente. Este método aprovecha virus recombinantes que expresan luciferasa de luciérnaga o luciferasa de renilla como reportero.

La toxicidad del compuesto se evalúa mediante un ensayo comercial basado en luciferasa en el que la luminiscencia se correlaciona con células vivas. En esta placa, 21 compuestos se clasificaron como tóxicos según un umbral establecido por los pocillos de control positivo.

La actividad antiviral se midió inicialmente utilizando rMV2/luc. La luminiscencia se comparó con el límite establecido por los pocillos de control. Aquí, se encontró que cuatro compuestos eran capaces de inhibir la replicación viral en más del 75 %. En el otro ensayo, dos de estos resultaron ser tóxicos. Para todos los compuestos HIT, se determinó la concentración inhibitoria media máxima sobre ambos virus de ARN, MV y ChikV, que expresan luciferasa. Estos dos virus no están relacionados, lo que hace que la prueba sea más robusta. En paralelo, se confirmó la ausencia de toxicidad celular de los compuestos seleccionados mediante un experimento de respuesta a la dosis.

En total, se identificaron 13 compuestos no tóxicos a partir de una biblioteca química de 10 000 moléculas. Estos compuestos fueron novedosos tanto en cuanto a su estructura química como a su actividad biológica. Basándose en similitudes estructurales, los compuestos se agruparon en tres familias químicas. A modo de referencia, se obtuvieron los valores de concentración inhibitoria media con Brequinar, una sustancia con potente actividad antiviral. Al analizar estos valores, menos de un orden de magnitud separaba la molécula de referencia de los HITs más activos identificados mediante el cribado. Esto demuestra la actividad antiviral relativamente fuerte de los compuestos seleccionados. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para cribar grandes bibliotecas químicas en un entorno de alto rendimiento y seleccionar conjuntos de moléculas pequeñas enriquecidos en antivirales de amplio espectro.