Name: La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a visualizar dímeros de ATP sintasa en mitocondrias mediante criotomografía electrónica. Este método de alta resolución preserva las estructuras proteicas nativas para estudiar la organización molecular de la membrana mitocondrial.

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Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck (KMD, BD, AWM, TB, TBB, DJM, y WK), el Cluster de Excelencia Frankfurt &quot;complejos macromoleculares&quot;, financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (WK) y una postdoctoral EMBO a largo plazo Fellowship (VAMG).

1 Preparación de las mitocondrias de células o tejidos por centrifugación diferencial En esta sección se describe un procedimiento general para el aislamiento de las mitocondrias intactas de diversos organismos eucariotas. Los componentes de amortiguación y velocidades de centrifugación precisa necesita ser optimizado para cada tejido / especie estudiada. <ol><li> Romper las células en tampón isotónico (por ejemplo, sacarosa 250 mM, HEPES 10 mM pH 7,4), utilizando un molino de vidrio talón (micelio fúngico) 28, la digestión enzimática de la pared celular (Saccharomyces cerevisiae) 29, un homogeneizador de rodamiento de bolas (single -Cell eucariotas / cultura células / nematodos) 30, o una licuadora (tejidos animales o vegetales) 31. </li><li> Eliminar los restos celulares por filtración a través de muselina seguido por centrifugación a baja velocidad (2.000 xg, 4 ° C, 10 min). </li><li> Recoger sobrenadante y sedimento mitocondrias por centrifugación de alta velocidad (9.000 xg, 4 ° C, 10 min). </li><li> Cuando sea necesario, utilice un gradiente escalonado de la densidad isotónica para la purificación adicional de la fracción mitocondrial 32. </li></ol> 2 Preparación de mitocondrias para Electron Cryo-tomografía La siguiente sección describe cómo obtener muestras congeladas hidratado para crio-ET. NOTA: El método implica el uso de nitrógeno líquido extremadamente frío y etano, que puede causar quemaduras graves en la piel. Gafas de seguridad y guantes de protección crio deben ser puestas. Etano líquido, que también es inflamable, debe manejarse en una campana de humos. <ol><li> Resuspender las mitocondrias sedimentadas en trehalosa 250 mM, 10 mM de tampón HEPES a pH 7,4 a una concentración de aproximadamente 5 mg / ml de proteína total. </li><li> -Descarga luminiscente redes de EM de carbono, holey secundarios de carbono hacia arriba, en un dispositivo de vacío de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Licuar unos pocos mililitros de etano dirigiendo una corriente de gas de etano en el lado interior de un nitrógeno líquido frescorecipiente de aluminio ed. </li><li> Mezcle proteína A conjugada con suspensión fiducial oro 1: 1 con suspensión mitocondrial y aplicar de inmediato 3 l de una rejilla EM de descarga luminiscente se celebró en pinzas. </li><li> Colocar las pinzas en un dispositivo de vitrificación, por ejemplo, una guillotina casera. Seque el exceso de líquido con un trozo de papel de filtro (~ 5 segundos o hasta que el líquido deje de difusión) y sumergirse de inmediato la red en etano líquido soltando el gatillo. </li><li> Transfiera la red a partir de etano líquido en nitrógeno líquido. Durante la transferencia, eliminar el exceso de etano de la red con papel de filtro. Coloque la punta de una pieza en forma de cuña de papel de filtro en el etano líquido. A medida que el etano líquido sube, arrastre suavemente la red hasta el papel de filtro, pero mantenerlo por debajo de la parte delantera líquido. Etano líquido se retira de la red por acción capilar y una vez que todos etano líquido se ha eliminado, transferir inmediatamente la cuadrícula en nitrógeno líquido. </li><li> Coloque la rejilla vitrificada en una caja de almacenamiento de red, unnd almacenar en nitrógeno líquido para su uso posterior, según corresponda. </li></ol> 3. grabación de tomográfica Inclinación Series La siguiente sección describe cómo configurar y recopilar una serie de inclinación tomográfica de una mitocondria con un microscopio electrónico de Polara equipado con un filtro de energía post-columna y la cámara CCD. Protocolos similares se utilizan con todos los electrones crio-microscopios equipados con cámaras CCD o directos detector de electrones. <ol><li> Alinear el Microscopio <ol><li> Inserte probeta por ejemplo, el grafito y las islas de oro en película de carbón perforado. </li><li> Seleccione el modo de búsqueda en el sistema de dosis baja del microscopio. </li><li> Llevar la muestra a la altura eucéntrica. Este es el punto de mínimo movimiento xy al inclinar el portamuestras. Centrar un punto de interés a 0 ° de inclinación, incline la etapa a 20 ° y volver a centrar el punto de alterar la altura z. Regresar a 0 ° y repita hasta que se minimiza el desplazamiento lateral. </li><li> Seleccionemodo de exposición. Elija de tamaño deseado para recoger una tomografía (por ejemplo, el detector 25,000X ≈ 0,6 nm Tamaño de la pieza de píxeles). </li><li> Elija una pequeña apertura del condensador (50-70 mm) y seleccione un tamaño de punto y la intensidad del haz de manera que el haz es sólo más ancho que el dispositivo de imágenes y da una lectura de píxeles de 60 e - / pixel (CCD) o 14 e - / pixel / seg (detector de electrones directa, modo de conteo). </li><li> Apertura del condensador Center. </li><li> Encuentra Gaussian enfoque por ejemplo, punto de contraste mínimo. Restablecer lectura desenfoque microscopio y los puntos de pivote correctas y el centro de rotación de acuerdo a las instrucciones del fabricante. </li><li> Marque en el desenfoque deseado para la grabación de tomografía. NOTA: Alta desenfoque (8 micras) aumenta el contraste, pero reduce la resolución, mientras que la baja desenfoque (2-4 micras) aumenta la resolución a expensas de contraste. </li><li> Más de un agujero vacío, generar una nueva referencia de ganancia y alinear filtro de energía de acuerdo con el fabricante delinstrucciones. </li><li> Alinear modos de búsqueda y exposición. En el modo de exposición, centrar un punto de interés y cambiar al modo de búsqueda. Seleccione ampliación de 1,500X (0,033 m / pixel de la muestra en el detector) y desenfoque de 100 micras (para un mayor contraste). Traiga punto de interés volver a centrar usando bobinas de desplazamiento de imagen. </li><li> En el modo de búsqueda, ajustar el tamaño del punto y la intensidad del haz de manera que el haz es sólo más ancho que el dispositivo de imágenes y da una lectura de píxeles de ~ 20 e - / pixel (CCD) o ~ 8 e - / pixel / seg (detector de electrones directa, modo de conteo). </li></ol></li><li> Encontrar una buena zona de la pieza <ol><li> Inserte la rejilla con las mitocondrias-congelados hidratado en el microscopio electrónico de la temperatura del nitrógeno líquido (consulte las instrucciones del fabricante EM). </li><li> En el modo de búsqueda, buscar la red para las zonas de espesor del hielo y la muestra de una calidad adecuada. Tome un 6 seg de búsqueda de imágenes de áreas prometedoras para determinar la idoneidad para la recolección de tomografía. Both de la membrana mitocondrial interna y externa debe ser visible a este aumento. </li></ol></li><li> Grabación de una inclinada Series tomográfica <ol><li> Una vez que se encuentre una buena superficie de la muestra, incline la etapa de ± 60 ° para determinar el rango de inclinación máxima que está disponible sin ningún tipo de obstrucción de la exposición o el enfoque por área de barras de la rejilla o trozos de hielo. </li><li> En un agujero lleno de hielo cerca de apariencia similar, cambiar a modo de exposición y ajustar la intensidad del rayo o la adquisición de imágenes en tiempo por lo que cada imagen grabada tiene una dosis de electrones de 30 a 50 e - / pixel para CCDs o 6-8 e - / pixel / s detectores de electrones directos, el modo de contar. </li><li> Calcular la relación de distribución de la dosis (I 0 / I 60) dividiendo el recuento promedio de electrones de una imagen 1 seg adquirida a 0 ° con la de una imagen 60 ° para. Esta relación se describe el aumento en el tiempo de exposición necesario para mantener un recuento de electrones constante por imagen al aumentar el ángulo de inclinación (tiempo de exposición = 1 / cos (α) n donde (I 0 / I 60) = 2 n). La relación también sirve como una buena indicación de espesor de hielo. Buenas tomografías de mitocondrias suelen registrarse con un I 0 / I 60 = 2,3-2,6. </li><li> Más de un agujero vacío, adquirir una imagen 1 seg en el modo de exposición y anote el número de electrones por Å 2. Teniendo en cuenta la relación de distribución de dosis, calcular el número total de imágenes que se pueden grabar para una dosis total específica de electrones (por ejemplo, &lt;40 e - / Å 2 para la determinación estructural y ~ 160 e - / Å 2 de morfología). </li><li> Determinar el intervalo de inclinación apropiado para la recolección de tomografía dividiendo el rango total de inclinación (por ejemplo, 120 ° para ± 60 °) por el número total de imágenes calculados en 3.3.4. </li></ol></li><li> Configurar y grabar una tomografía con los parámetros determinados anteriormente, utilizando el software de recopilación automática de datos apropiada 33, 34. Serie Tilt se comienzan a ± 20 ° y pasan por 0 ° antes de llegar a altas inclinaciones con el fin de maximizar el contenido de información de imágenes de baja inclinación que se destruyeron por la dosis de electrones en aumento. </li></ol> 4. Creación y segmentación de los volúmenes tomográficos En esta sección se describe cómo se generan volúmenes tomográficas de las mitocondrias de la serie de inclinación y cómo los volúmenes están presentes para la visión general. <ol><li> Guarde la serie inclinación tomográfica a un directorio apropiado. Generar una pila de imágenes y convertirlas a un formato de archivo adecuado con el software de código abierto, como dm2mrc o tif2mrc (paquete IMOD), que convierten .dm3, .dm4 o .tif archivos en pilas de MRC. se requieren pilas MRC para la reconstrucción tomográfica con IMOD 35. Otros paquetes requieren diferentes formatos. </li><li> Alinear las imágenes y generar una tomografía siguiendo los pasos detallados en el tutorial IMOD ( <ahref=&quot;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html&quot;&gt;http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ). </li><li> Mejorar el contraste de la tomografía utilizando el filtro de difusión anisotrópica no lineal distribuido con IMOD. Este filtro funciona bien para las membranas y partículas asociadas a la membrana, como la ATP sintasa. </li><li> Para la visualización, el segmento manualmente la tomografía usando programas disponibles comercialmente, por ejemplo, Amira. Asignar voxels correspondientes a la membrana interna o externa y generar una superficie. Usando la opción clicker en el plugin EM-paquete para AMIRA 36 marcar la ubicación de las partículas ATP sintasa. </li></ol> 5. Subtomogram de promedio de la ATP sintasa dímeros y montaje de estructuras de rayos X La siguiente sección describe cómo se pueden obtener los promedios subtomogram de dímeros ATP sintasa. <ol><li> El uso de las partículas marcadas como entrada y un paquete de software apropiado, tal como el &quot;ParteEstimación ículo para el programa de tomografía electrónica &#39;, calcular un promedio subtomogram. </li><li> Para una estimación resolución, comparación de dos promedios subtomogram determinados independientemente por Fourier correlación shell 37. </li><li> Si, muelle conocido estructuras de rayos X disponibles en el promedio subtomogram de cuerpo rígido ajustado, ya sea manualmente o utilizando rutinas automáticas de conexión secuenciales como las que en el programa de Chimera 38. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El protocolo presentado aquí proporciona una introducción a la crio-ET y subtomogram promedio de las mitocondrias, pero esencialmente el mismo procedimiento se puede aplicar a cualquier otro compartimiento celular o membrana. Para obtener los mejores datos posibles, pasos críticos durante el procedimiento son: la preparación, la estrategia de adquisición proceso de congelación profunda y datos. La calidad de la muestra, lo cual es crítico para el éxito, depende de un protocolo de congelación optimizado para asegurar el espesor del hielo adecuado, el cual es de suma importancia para el buen contraste de la imagen. La estrategia óptima de adquisición de datos depende del instrumento y la muestra. Parámetros para ser optimizadas incluyen dosis de electrones por imagen, esquema de inclinación y desenfoque. La adquisición de una buena tomografía de una buena muestra hace todo el procesamiento de nuevas medidas más fácil y asegura un resultado final satisfactorio. Cryo-ET combinado con un promedio subtomogram y ajuste del modelo atómico proporciona detalles de cómo los complejos de proteínas se disponen en lentorno celular nativo eir. La técnica es igualmente adecuado para la investigación de la estructura de grandes complejos de proteínas de membrana, tales como supercomplexes cadena respiratoria (1,7 MDA), dímeros de la ATP sintasa (2x500 kDa), o el complejo de poro nuclear (~ 120 MDa) 8, 9, 17. La organización de dímeros ATP sintasa en filas no puede ser observado por técnicas de alta resolución como la cristalografía de rayos X, RMN o de una sola partícula crio-EM, porque las filas de dímero se interrumpen por extracción con detergente, que es un paso necesario en el aislamiento y la purificación de complejos de proteínas de membrana. La disposición de la ATP sintasa en filas a lo largo de las crestas de dímeros cristae es un principio de organización universal de las mitocondrias en todas las especies. Los complejos de bombeo de protones de la cadena de transporte de electrones, en particular, el complejo I (NADH deshidrogenasa), se encuentran en las áreas de membrana a cada lado de las filas 8,9. Esta organización de la cadena respiratoria tiene un profundo impacto en la bioenergética mitocondrial. Si las filas de dímero no pueden formar debido a la ausencia de subunidades de proteínas de dímero-específica, las células presentan tiempos de generación más largos y reducción de la aptitud celular, como se observa en el mutante de levadura se muestra en la figura 3 41. Con el creciente interés en las enfermedades mitocondriales, un detallado comprensión de las bases moleculares que regulan ultraestructura y la función mitocondrial es de suma importancia. Electron crio-tomografía proporciona un enlace entre la estructura de la proteína se determina por métodos de alta resolución, y la distribución y disposición de estas proteínas en la membrana en la escala de nanómetros. Esto hace que la crio-ET en una herramienta esencial para la comprensión de la estructura y función mitocondrial en la salud y la enfermedad. Otros desarrollos técnicos y las mejoras en la crio-ET incluyen estrategias de proteína de etiquetado para identificar la posición de protein subunidades de los complejos macromoleculares o la localización de proteínas distintas más pequeños o menos (&lt;0,5 MDA) en las células. Además, los métodos de procesamiento EM híbridos, que combinan subtomogram promediado con el análisis de una sola partícula o reconstrucción helicoidal han determinado recientemente estructuras de proteínas a ~ 8 Å 42, 43. Estos métodos de tratamiento se limitan actualmente a las proteínas purificadas, que están bien separados en hielo o forman asambleas helicoidales y en la actualidad no son aplicables a entornos celulares concurridos como las mitocondrias y crestas membranas. Para la recolección de datos, las nuevas herramientas informáticas y hardware se están desarrollando para permitir la adquisición tomografía automatizada, aumentar el contraste de la imagen y reducir la dosis total de electrones requerida. La única limitación fundamental en crio-ET es el daño por radiación a la muestra por el haz de electrones. Esto significa que sólo dosis muy bajas de electrones se pueden utilizar para grabar cada imagen de una serie de inclinación tomográfica, resultando en una mala señal-tratio que limita en última instancia, la resolución alcanzable o-ruido. Los nuevos detectores de electrones directo, lanzado hace menos de un año, están revolucionando el campo de una sola partícula crio-EM 44, 45. Estos nuevos detectores proporcionan mayor contraste y una mejor resolución en dosis más bajas de electrones. Para la crio-tomografía electrónica, esto significa que la serie de inclinación con tamaños de paso más pequeñas o tomografías ejes duales incluso se puede recoger sin preocupaciones sobre el daño por radiación excesiva (una imagen CCD es equivalente en dosis de electrones 5 imágenes directas del detector de electrones). Las grandes cantidades de datos producidos por estos detectores de crear sus propios desafíos en el manejo de datos, procesamiento y almacenamiento, lo que tendrá que superar. Además, placas de fase, que funcionan sobre principios similares a los usados ​​rutinariamente en la microscopía de luz para mejorar el contraste de fase, se están desarrollando actualmente para microscopía electrónica de transmisión 46, 47. Esto debería permitir que las tomografías que se recojan más cerca de enfocar y por lo tanto en una resolución más alta, mientras que al mismo tiempo que se preserva de baja resolución características necesarias para la alineación y la interpretación de los volúmenes de tomográficas. Tomados en conjunto, estos avances tecnológicos se ampliará considerablemente la gama de cuestiones biológicas que pueden ser abordadas por crio-ET.

Las mitocondrias son los power-casas de la célula. Mediante la conversión de un gradiente de protones electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna en energía de enlace químico, la ATP sintasa mitocondrial produce la mayor parte del ATP que impulsa procesos celulares. Con el fin de entender los mecanismos detrás de la conversión de energía mitocondrial, tenemos que determinar la estructura de la ATP sintasa in situ, y para averiguar cómo se organiza y se distribuye en la membrana mitocondrial interna. Aunque las estructuras de alta resolución de la mayoría de los componentes mitocondriales ATP sintasa 1-3 y mapas de baja resolución de todo el complejo 4 están disponibles, es importante establecer la estructura y conformación de la enzima de trabajo en la membrana. La distribución de la ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna se ha asumido ampliamente que ser al azar, pero uno de los primeros 5 y la búsqueda de nuestros propios resultados iniciales 6 indicaron que este no es tél caso. Estudios posteriores de nuestro grupo y otros 7 han confirmado que la ATP sintasa está dispuesto en largas filas de dímeros a lo largo de las crestas fuertemente curvadas de la membrana mitocondrial interna crestas 8, mientras que las bombas de protones de la cadena de transporte de electrones parecen estar localizados a cada lado de las filas 9. Esta disposición tiene importantes implicaciones para los mecanismos de conversión de energía mitocondrial. La técnica que hemos utilizado para determinar esta disposición es la crio-tomografía electrónica (crio-ET). Cryo-ET es actualmente el único método que ofrece en tres dimensiones (3D) los volúmenes exactos de las células, los compartimentos celulares u orgánulos con resolución molecular. Cryo-ET es particularmente adecuada para el estudio de grandes complejos en las membranas biológicas, ya que las membranas aparecen con buen contraste y son fáciles de rastrear en los volúmenes de tomográficas 3D. Otros métodos para el estudio de la estructura 3D de las células o organelles no proporcionan detalles moleculares. Super-resolución microscopía de luz 10, 11 es excelente a revelar la posición o las distancias entre las etiquetas emisores de luz unidos a proteínas de interés con una precisión de decenas de nm, pero no revela la estructura de la proteína en sí, incluso a baja resolución . Microscopía electrónica de transmisión de secciones en serie 12 o imagen de bloque de cara por microscopía electrónica de barrido 13 de muestras biológicas de plástico embebido proporcionan vistas de baja resolución de los volúmenes celulares pero igualmente no revelan detalle molecular. Microscopía de fuerza atómica 14 puede entregar, en principio, resolución molecular o incluso atómica, pero sólo en la superficie de los objetos sobre un soporte atómicamente plana, sólida. Por último, la tomografía de rayos X 15 o dispersión de pulsos de rayos X intensos de láseres de electrones libres es poco probable para revelar la estructura de grandes complejos, objetos, aperiódicas tales como células enteras u orgánulos en 16 mresolución olecular en un futuro previsible. Así, en la actualidad, no hay alternativa a la crio-ET para el estudio de la estructura 3D de las células u orgánulos con una resolución nanométrica. Cryo-ET es el método de elección para examinar la estructura y la conformación de los conjuntos de proteínas asociadas a la membrana, incluyendo el complejo del poro nuclear 17, el pico de la gripe complejos 18, y los flagelos proteínas de motor 22, 23 sino también la organización de las células bacterianas enteras 19 y la entrada de los virus patógenos como el VIH en las células a 20-23. Cryo-ET tiene un valor incalculable para la visualización de proteínas filamentosas y sus interacciones en la célula, incluyendo los filamentos de actina 24 o axonemas 25. La resolución puede ser mejorada a 2 nm o mejor por subtomogram promediando 26, mediante el cual subvolúmenes de repetidos, rasgos regulares se cortan de un volumen tomográfica y un promedio por partícula sola imagen protécnicas de procesamiento. Cryo-ET implica la adquisición de una serie de imágenes de proyección de un espécimen delgada (&lt;250 nm) tomadas en diferentes ángulos de inclinación en un microscopio electrónico de transmisión (TEM). La muestra debe ser delgada por lo que los electrones, que interactúan fuertemente con la materia, se dispersan más de una vez. Dispersión múltiple hace que las imágenes resultantes difíciles de interpretar y reduce el contraste. Las imágenes de la superficie de la muestra seleccionada están alineados uno con respecto al otro y se proyectan en un espacio 3D mediante un programa informático adecuado, generando un volumen 3D de la muestra. La alineación de las imágenes es ayudada por marcadores de referencia de oro, que se mezclan con la muestra antes de la congelación. Idealmente marcadores de referencia 10 o más uniformemente distribuidos deben estar presentes en cada imagen para conseguir una buena alineación. Observar el detalle molecular, las muestras son-caída congelado en etano líquido, que conserva su estado hidratado nativo. Congelación en líquidoetano es tan rápido (~ 10 5 ° C / s) 27 de que el agua no cristaliza sino que permanece en un estado vitrificado, similar al vidrio. Cristal de hielo daños formación estructuras biológicas sensibles. Como muestras biológicas sufren de daños por radiación, hay un límite para el número total de eventos de dispersión de la muestra puede tolerar. Las imágenes se adquirieron por lo tanto en el modo de dosis baja: Un área de interés se identifica a bajo aumento (1,500X) con una dosis de electrones por debajo de 1 e - / 2 nm (en modo de búsqueda). Para enfocar la imagen a continuación, con un aumento más alto, fuera del área de interés (modo de enfoque). Sólo cuando se adquiere una imagen, el área de interés se irradia con una dosis de electrones superior (modo de exposición). A continuación, presentamos una visión general de cómo recoger y electrones proceso de crio-tomografías, utilizando dímeros ATP sintasa en la membrana mitocondrial interna como ejemplo. El siguiente protocolo describe cómo preparar la mitocondria para la crio-ET, cómo configurary recoger una serie de inclinación con una dosis total de electrones específica, y cómo procesar la serie de inclinación para obtener un volumen 3D del área de interés. Una visión general del procedimiento se ilustra en la Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Sacarosa</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Zimotasa</td><td>biomol</td><td>Z1000.1</td><td></td></tr><tr><td>Medio de gradiente de densidad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556 o P1644</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A oro</td><td>Aurion</td><td>810.111</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Ethane</td><td>Air Liquide</td><td>P0502S02R0A001</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>Air Liquide</td><td>I4150RG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Consumibles</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 090</td><td>Nr 4</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>T506</td><td>No magnético, patrón #5</td></tr><tr><td>EM rejilla de prueba combinada</td><td>Plano GmbH</td><td>S142</td><td>islas de grapite y oro sobre película de carbono agujereada</td></tr><tr><td>Rejillas de carbono Holey</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH o C-flat</td><td></td><td>R2/2 Malla de 300 Cu</td></tr><tr><td>Cajas de rejilla criogénica Plano</td><td>GmbH</td><td>160-42</td><td>Cajas metálicas caseras alternativas</td></tr><tr><td>Potter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7984</td><td></td></tr><tr><td>Batidora</td><td>Waring</td><td>8011S</td> Molino de bolas de vidrio - batidor de <td></td></tr><tr><td>cuentas</td><td>Productos BioSpec</td><td>1107900-105</td><td>Incluidos los perlas de 0,5 mm</td></tr><tr><td>Homogeneizador de rodamientos de bolas (Balch)</td><td>isobiotec</td><td>H8</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>46915</td><td>Sorvall RC6+</td></tr><tr><td>Aparato de descarga incandescente</td><td>Bal-Tec A.G.</td><td>CTA 010</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de vitrificación de rejilla</td><td>FEI, Gatan o Leica</td><td></td><td>Émbolo casero alternativo</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>FEI o Jeol</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Detector de electrones directos</td><td>Gatan</td><td>K2 summit</td><td>4k x 4k píxeles, modo contado</td></tr><tr><td>Dispositivo de carga acoplada (CCD)</td><td>Gatan</td><td>US4000</td><td>4k x 4k píxeles (alternativa al detector de electrones directos)</td></tr><tr><td>Filtro de energía</td><td>Gatan o Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Image software de adquisición</td> de Tomografía <td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de Tomografía</td><td>Gatan, FEI, USCF o UC-Boulder</td><td></td><td>4 alternativas</td>Software de</tr><tr><td>procesamiento de tomografías</td><td>FEI, UCSF o UC-Boulder</td><td></td><td>3 alternativas</td></tr><tr><td>Software de promediación de subtomografías</td><td>UC-Boulder o Universidad</td><td></td> de Basilea <td>2 alternativas</td></tr> Software <tr>de<td>visualización de tomografías</td><td>UC-Boulder, FEI o Universidad de Utah</td><td></td><td>3 alternativas</td></tr><tr><td>Complemento de software de visualización Universidad de</td><td>Goethe</td><td></td><td>http://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/</td></tr> <tr><td>Software de visualización</td><td>de estructuras UCSF</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Software de cálculo numérico</td><td>MathWorks</td><td></td><td>http://www.mathworks.de/academia/</td></tr></tbody></table>

la visualización de la atp sintasa dímeros en mitocondrias por electron cryo-tomografía

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron crio-tomografía es una poderosa herramienta en biología estructural, capaz de visualizar la estructura tridimensional de muestras biológicas, tales como células, orgánulos, vesículas de membrana, o virus en detalle molecular. Para lograr esto, la muestra acuosa se vitrifica rápidamente en etano líquido, que conserva en un estado congelado-hidratado próxima al nativo. En el microscopio electrónico, la serie de inclinación se registran a la temperatura del nitrógeno líquido, de la que se reconstruyen las tomografías 3D. La relación señal-ruido del volumen tomográfica es inherentemente baja. Características reconocibles y recurrentes son realzados por un promedio subtomogram, por el cual subvolúmenes individuales se cortan, alineados y se promediaron para reducir el ruido. De esta manera, los mapas 3D con una resolución de 2 nm o mejor se puede obtener. Un ajuste de las estructuras de alta resolución disponibles para el volumen 3D a continuación, produce los modelos atómicos de complejos de proteínas en su ambiente nativo. Aquí te mostramos cómo usamos electrones crio-tomography para estudiar la organización in situ de grandes complejos de proteínas de membrana en las mitocondrias. Encontramos que ATP sintasas se organizan en filas a lo largo de dímeros ápices altamente curvadas de las crestas de la membrana interna, mientras que el complejo I se distribuye aleatoriamente en las regiones de membrana a cada lado de las filas. Por subtomogram de promedio se obtuvo una estructura de la ATP sintasa mitocondrial dímero dentro de la membrana crestas.

Electrón crio-tomografías de mitocondrias revelan claramente la morfología 3D del orgánulo (Figura 2). Segmentación manual de las membranas en un volumen tomográfica ilustra la estructura de las crestas en una mitocondria. Mediante formación de imágenes mitocondrias de diferentes cepas de levadura knockout que carecen de ciertos componentes de la proteína, el efecto de estas proteínas en la morfología de crestas puede ser evaluado. Figura 3 muestra una mitocondria de una cepa de levadura que carece de ATP sintasa subunidad e. Se requiere este componente del complejo de la ATP sintasa para la dimerización de la ATP sintasa mitocondrial. Las mitocondrias de esta cepa carecen de las crestas laminar normal de las mitocondrias de tipo salvaje (Figura 2) y en su lugar contiene un número de compartimentos de la membrana interna. Estos compartimentos están desprovistos de crestas o contienen pequeñas invaginaciones de la membrana en forma de globo (Figura 3). En tomicionales con buen contraste, grandes complejos de proteínas mitocondriales, en este caso de la ATP sintasa dímeros, son fácilmente visibles (Figura 4; Movie 1). Las estructuras de los complejos pueden ser determinadas en 2-3 nm de resolución por promediación subtomogram (Figura 5; Película 2). Los volúmenes medios pueden ser colocados de nuevo en la tomografía con el fin de evaluar la organización de los complejos individuales en relación entre sí y de otros complejos de proteínas en la membrana (Figura 6; Movie 3). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Diagrama de flujo que muestra las etapas de la crio-tomografía electrónica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande.</a> Figura 2 Morfología de una mitocondria de tipo salvaje S. Cerevisiae. Rebanada central a través de un volumen tomográfica de un tipo salvaje S. mitocondria cerevisiae (izquierda) y el volumen-rendido superficie correspondiente (a la derecha). El volumen segmentado de la membrana externa se muestra en gris y los volúmenes del límite interior y crestas membranas en azul claro. Adaptado de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Mitochondrion de una S. Cerevisiae cepa que carece de una subunidad necesaria paraATP sintasa dimerización. Cortar a través del volumen tomográfico (izquierda) y el acompañamiento volumen-rendido superficie (derecha) de una mitocondria de una S. Cerevisiae cepa carente requerido para ATP sintasa dimerización el e subunidad proteica. Cuando se compara con la Figura 2, la mitocondria de la cepa mutante carece de las crestas laminar normal de las mitocondrias de tipo salvaje. En cambio, la mitocondria tiene muchos compartimentos de membrana interna, ya sea con ausencia de crestas o crestas en forma de globo. Así electrónica crio-tomografía destaca alteraciones en la morfología de la membrana debido a las supresiones de genes. Adaptado de Davies et al 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. Mitocondrio del hongo P. anserina. Cortar a través del volumen tomográfico (izquierda) y el volumen-rendido superficie adjunta (derecha) de una mitocondria del hongo filamentoso P. anserina. En este tomografía, filas de 10 nm partículas (puntas de flecha amarilla) se encuentran por encima de las crestas de membrana muy curvadas en las crestas de la membrana interna (ver vídeo 1). Estas partículas fueron identificados como dímeros ATP sintasa por subtomogram promedio. Desde Davies et al 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51228/51228fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Estructura y organización de la ATP sintasa mitocondrial. Lateral y vista superior que muestra la densidad electrónica de un dímero ATP sintasa de S. c<html> erevisiae según lo determinado por un promedio subtomogram con modelos atómicos armarios (izquierda). Mitocondrial vesícula de la membrana interior que muestra la organización de dímeros ATP sintasa en filas (derecha). La figura fue generada por el posicionamiento de la media subtomogram de la sintasa dímero ATP en el volumen segmentado de la vesícula de membrana, utilizando las coordenadas calculadas durante un promedio. Adaptado de Davies et al 8. Modelos atómicos: F 1 / rotor de anillo [AP: 2WPD] 39 (azul y púrpura); oligomicina sensible confiriendo proteína-OSCP [AP: 2BO5] 40 (verde); fragmento de tallo periférico [AP: 2CLY] 1 con los residuos N-terminales de [AP: 2WSS] 2 (amarillo y rojo) (véase Movie 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/51228fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <html> _upload / 51228 / 51228fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 6. Aislado crista de vesículas a partir de una P. anserina mitocondria. Rodajas de un volumen tomográfico (izquierda) y el volumen-rendido superficie adjunta (derecha) de una vesícula crista de P. anserina. Densidades de proteínas que sobresalen de la membrana son claramente visibles. Las densidades indicadas por flechas amarillas son dímeros ATP sintasa, identificadas por subtomogram promedio. Puntas de flechas verdes indican las densidades identificados mediante el etiquetado de anticuerpos como NADH deshidrogenasa (complejo 1, para más detalles véase 9). Segmentación de las densidades de proteínas revela su organización en las crestas, con los dímeros de la ATP sintasa (rojo y amarillo) que forman filas a lo largo de las crestas cristae muy curvadas y los complejos NADH deshidrogenasa (verde) en las regiones de membrana a cada lado de las filas (véase Movie 3). Desde Davies et al 9.28 / 51228fig7highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. Movie 1. Electron crio-tomografía de una P. anserina mitocondria. La película muestra rebanadas sucesivas a través de un volumen tomográfica tomada de una mitocondria de la hongo filamentoso P. anserina. Filas de ATP sintasa se indican con flechas amarillas. El, el volumen segmentado-prestados superficie muestra la ubicación de la ATP sintasa (esferas amarillas) en relación a la estructura de crestas 3D. Membrana externa, gris; membrana límite interior, azul transparente; crestas membranas, de color azul opaco. Desde Davies et al 9. Véase también la Figura 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video.</a> Movie 2. Subtomogram media de la ATP sintasa mitocondrial dímero de S. Cerevisiae con modelos atómicos armarios. El promedio fue decalculado a partir de 121 subvolúmenes. La densidad se muestra en tres niveles de contorno: 1s - malla, 2s - gris claro y 3s - gris oscuro. Modelos atómicos experimentales se ajustaron a la densidad mediante la rutina de ajuste secuencial en Chimera. Modelos atómicos: F 1 / rotor de anillo [AP: 2WPD] 39 (azul y púrpura); oligomicina sensible confiriendo proteína-OSCP [AP: 2BO5] 40 (verde); fragmento de tallo periférico [AP: 2CLY] 1 con los residuos N-terminales de [AP: 2WSS]. 2 (amarillo y rojo) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie2.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video.</a> Adaptado de Davies et al 8. Véase también la Figura 5. Movie 3. Aislado crestas vesícula de una P. anserina mitocondria. rebanadas sucesivas a través del volumen tomográfica se muestran, seguido por el volumen renderizada superficie segmentada. Densidades de proteínas que sobresalen de la membrane son claramente visibles. Densidades rojas y amarillas son dímeros ATP sintasa. Densidades verdes son NADH deshidrogenasa (complejo I) tal como se determina mediante el etiquetado de anticuerpos. Desde Davies et al 9. Véase también la Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51228/movie3.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video.</a>

Se presenta un protocolo de cómo recoger y electrones proceso de crio-tomografías de toda la mitocondria. La técnica ofrece una detallada comprensión de la estructura, función y organización de grandes complejos de proteínas de membrana en membranas biológicas nativas.

La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura y organización de las proteínas mitocondriales en C two. Esto se logra primero generando una rejilla de microscopía electrónica congelada e hidratada que contiene la muestra. A continuación, se registra una serie de inclinación con dosis limitada de la muestra en un microscopio electrónico de crio-microscopía.Luego, la serie de inclinación se procesa para generar un volumen tomográfico. Finalmente, las densidades proteicas se promedian para determinar la estructura de las proteínas y las membranas se segmentan para revelar su estructura tridimensional. Al reposicionar los promedios de proteínas nuevamente en los Tom Grahams, se revela la estructura y organización de las proteínas en la membrana.Así que realizamos tomografía crioelectrónica de mitocondrias porque queremos comprender cómo funcionan a nivel molecular. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la microscopía electrónica de secciones finas en plástico, es que la resolución es mayor. El material no se fija químicamente de ninguna manera, y se conserva el detalle molecular de las proteínas.La técnica de criomicroscopía electrónica puede llevar cierto tiempo dominarla, pero los usuarios experimentados pueden obtener entre cinco y seis buenas tomografías por sesión. La parte más difícil del procedimiento consiste en producir rejillas congeladas hidratadas con un espesor óptimo de hielo. Tras aislar y centrifugar las mitocondrias según el protocolo descrito, utilice 250 milimolar de T triosas en 10 milimolar de tampón HEPA para resuspender el sedimento hasta una concentración de aproximadamente cinco miligramos por mililitro de proteína total. Someta las rejillas EM de carbono recubiertas de carbono (con el lado de carbono hacia arriba) a descarga de plasma en un dispositivo al vacío siguiendo las instrucciones del fabricante, y licúe unos pocos mililitros de etano dirigiendo un chorro de gas etano hacia la cara interna de un recipiente de aluminio enfriado con nitrógeno líquido.Utilice un par de pinzas para tomar una rejilla DM con descarga de brillo y colóquela sobre la bancada. Mezcle la proteína con una suspensión de marcadores de oro conjugados, uno a uno, con la suspensión mitocondrial, y aplique inmediatamente tres microlitros de la solución sobre la rejilla. A continuación, coloque las pinzas en un dispositivo de vitrificación, como una guillotina casera, con un trozo de papel filtro para eliminar el exceso de líquido de la rejilla y libere el disparador para sumergir inmediatamente la rejilla en etano líquido. Luego, transfiera la rejilla del etano líquido al nitrógeno líquido.Elimine el exceso de etano de la rejilla colocando la punta de una cuña fresca de papel de filtro en el etano líquido. A medida que el líquido asciende, arrastre suavemente la rejilla hacia arriba por el papel de filtro, manteniéndola por debajo del frente líquido, y luego transfiérala inmediatamente al nitrógeno líquido para almacenarla y usarla posteriormente. Coloque la rejilla en una caja para rejillas y guárdela en un recipiente lleno de nitrógeno líquido para registrar una serie de inclinaciones tomográficas.Comience asegurándose de que los contenedores de nitrógeno líquido estén llenos y verifique que la temperatura del portaobjetos de la muestra y del dispositivo de transferencia de rejillas esté por debajo de 100 kelvin. Confirme que el microscopio electrónico esté bien alineado adquiriendo una imagen de una rejilla de prueba y comprobando la calidad de los anillos de tamales; los anillos deben ser redondos y extenderse hasta el borde de la imagen. A continuación, inserte una rejilla con mitocondrias congeladas hidratadas.Luego, en modo de búsqueda, localice áreas con espesor de hielo y calidad de espécimen adecuados. Tome una imagen de búsqueda de seis segundos de las áreas prometedoras para determinar su idoneidad para la recopilación de datos. Tras localizar un área de espécimen adecuada, incline la platina ±60 grados para determinar el rango máximo de inclinación disponible sin que las barras de la rejilla u hielo cristalizado en un orificio cercano lleno de hielo de apariencia similar obstruyan el área de exposición o enfoque; cambie al modo de exposición y ajuste la intensidad del haz o el tiempo de adquisición de la imagen.Por lo tanto, cada imagen registrada tiene una dosis de electrones de 30 a 50 electrones por píxel para CCD o de seis a ocho electrones por píxel por segundo. Para detectores electrónicos directos, calcule la relación de distribución de dosis o I cero sobre I 60 dividiendo el recuento promedio de electrones de una imagen de un segundo adquirida a cero grados por el de una imagen de 60 grados sobre un orificio vacío. Adquiera una imagen de un segundo en modo de exposición y anote el recuento de electrones por angstrom cuadrado.Teniendo en cuenta la relación de distribución de la dosis, calcule el número total de imágenes y el intervalo de inclinación que pueden registrarse para una dosis total específica de electrones utilizando un software adecuado de recopilación automática de datos. Configure y registre un Tom Agram con los parámetros recién determinados, típicos de los tomos. Para estas muestras, comience en más o menos 20 grados y pase por cero grados antes de alcanzar altas inclinaciones.Para crear y segmentar tomogramas, convierta la serie de inclinación a un formato de archivo adecuado para el software de reconstrucción. Utilizando un programa de reconstrucción Tom Graham como Imod, alinee las imágenes marcando la posición de los marcadores fiduciales de oro. Una vez alineadas, genere un tomograma Tom Graham.Mejore el contraste del tomografía de Graham mediante el uso de un filtro de imagen, como el filtro de difusión anisotrópica no lineal distribuido con IM o, para visualización. Utilice programas disponibles comercialmente para segmentar manualmente la tomografía. Asigne vóxeles correspondientes a la membrana interna y externa a capas separadas; una vez asignados, cree una superficie para visualizar las membranas.Utilizando la opción de clic en el complemento del paquete EM para emira, marque la ubicación de partículas de sintasa TP usando las partículas marcadas como entrada y un paquete de software adecuado, como la estimación de partículas. Para el programa de tomografía electrónica, calcule un promedio de agrado para una estimación de resolución. Calcule la correlación del cascarón focal entre dos promedios de subtomos determinados independientemente utilizando el programa gratuito de visualización.Chimera ajusta manualmente las estructuras de rayos X conocidas dentro del promedio de subtomografía Agram y luego automáticamente con el comando fit, como se observa en esta figura. La segmentación manual de las membranas en una crio-micrografía electrónica mitocondrial revela la estructura de las crestas en una mitocondria. Mediante el análisis de imágenes de mitocondrias provenientes de cepas de levadura con deleciones génicas que carecen de ciertas proteínas, puede evaluarse el efecto de estas proteínas sobre la morfología de las crestas.Se muestra aquí una mitocondria de una cepa de levadura que carece de la subunidad E de la síntesis de TP, que es necesaria para la formación de dímeros de la sintetasa de TP. A diferencia de las crestas típicas de las mitocondrias de tipo salvaje, estos orgánulos contienen en cambio una serie de estructuras de la membrana interna que carecen de crestas o presentan invaginaciones membranosas pequeñas con forma de globo. En imágenes con buen contraste, los dímeros de la sintetasa de TP son fácilmente visibles, como se indica aquí mediante las puntas de flecha amarillas.Al segmentar las membranas, puede visualizarse la ubicación de la síntesis de ATP, representada ahora por la esfera amarilla, en relación con la morfología de las crestas mitocondriales. En este caso, la síntesis de ATP forma filas de dímeros a lo largo de los bordes altamente curvados de las crestas mitocondriales. La promediación de subtomogramas permite determinar la estructura de las proteínas con una resolución de cuatro nanómetros o mejor. Al ajustar estructuras conocidas por rayos X dentro del promedio de subtomogramas, pueden ensamblarse modelos atómicos de complejos proteicos en su entorno nativo, tal como se observa.En este ejemplo, los volúmenes promedio pueden colocarse nuevamente en el Tomo Graham para ayudar a la organización de complejos individuales entre sí y respecto a otros complejos proteicos en la membrana. Nuestro protocolo demuestra cómo puede utilizar la tomografía crioelectrónica para determinar la estructura y organización de complejos proteicos dentro de la membrana mitocondrial interna. Este protocolo también puede utilizarse para determinar la estructura y organización de otras proteínas asociadas a membranas dentro de diferentes compartimentos celulares.La preparación de la muestra es clave para obtener buenos termogramas. La rejilla hidratada congelada debe contener ojos perfectamente vítreos de un grosor entre 70 y 150 nanómetros. Normalmente se examinan de cinco a seis rejillas hasta encontrar un área con grosor óptimo del hielo y calidad adecuada de la muestra.Para la recopilación de imágenes, lo mejor es un microscopio electrónico de transmisión de 300 kilovoltios con etapa criogénica dedicada, filtro de energía y cámara con detector directo de electrones, aunque también se podría utilizar un equipo de 200 kilovoltios con etapa criogénica de entrada lateral y una cámara CCD. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una rejilla criogénica, recopilar una serie de inclinación, reconstruir la tomografía y calcular un promedio subtomográfico.Estas son las habilidades básicas necesarias para investigar cómo la organización de las proteínas en una célula afecta la capacidad de dicha célula para realizar funciones biológicas, como la síntesis eficiente de ATP. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido y etano líquido puede ser muy peligroso, y que siempre se deben usar gafas de seguridad y guantes.

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JoVE Journal

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Biología

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