La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura y organización de las proteínas mitocondriales en C two. Esto se logra primero generando una rejilla de microscopía electrónica congelada e hidratada que contiene la muestra. A continuación, se registra una serie de inclinación con dosis limitada de la muestra en un microscopio electrónico de crio-microscopía.

Luego, la serie de inclinación se procesa para generar un volumen tomográfico. Finalmente, las densidades proteicas se promedian para determinar la estructura de las proteínas y las membranas se segmentan para revelar su estructura tridimensional. Al reposicionar los promedios de proteínas nuevamente en los Tom Grahams, se revela la estructura y organización de las proteínas en la membrana.

Así que realizamos tomografía crioelectrónica de mitocondrias porque queremos comprender cómo funcionan a nivel molecular. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la microscopía electrónica de secciones finas en plástico, es que la resolución es mayor. El material no se fija químicamente de ninguna manera, y se conserva el detalle molecular de las proteínas.

La técnica de criomicroscopía electrónica puede llevar cierto tiempo dominarla, pero los usuarios experimentados pueden obtener entre cinco y seis buenas tomografías por sesión. La parte más difícil del procedimiento consiste en producir rejillas congeladas hidratadas con un espesor óptimo de hielo. Tras aislar y centrifugar las mitocondrias según el protocolo descrito, utilice 250 milimolar de T triosas en 10 milimolar de tampón HEPA para resuspender el sedimento hasta una concentración de aproximadamente cinco miligramos por mililitro de proteína total. Someta las rejillas EM de carbono recubiertas de carbono (con el lado de carbono hacia arriba) a descarga de plasma en un dispositivo al vacío siguiendo las instrucciones del fabricante, y licúe unos pocos mililitros de etano dirigiendo un chorro de gas etano hacia la cara interna de un recipiente de aluminio enfriado con nitrógeno líquido.

Utilice un par de pinzas para tomar una rejilla DM con descarga de brillo y colóquela sobre la bancada. Mezcle la proteína con una suspensión de marcadores de oro conjugados, uno a uno, con la suspensión mitocondrial, y aplique inmediatamente tres microlitros de la solución sobre la rejilla. A continuación, coloque las pinzas en un dispositivo de vitrificación, como una guillotina casera, con un trozo de papel filtro para eliminar el exceso de líquido de la rejilla y libere el disparador para sumergir inmediatamente la rejilla en etano líquido. Luego, transfiera la rejilla del etano líquido al nitrógeno líquido.

Elimine el exceso de etano de la rejilla colocando la punta de una cuña fresca de papel de filtro en el etano líquido. A medida que el líquido asciende, arrastre suavemente la rejilla hacia arriba por el papel de filtro, manteniéndola por debajo del frente líquido, y luego transfiérala inmediatamente al nitrógeno líquido para almacenarla y usarla posteriormente. Coloque la rejilla en una caja para rejillas y guárdela en un recipiente lleno de nitrógeno líquido para registrar una serie de inclinaciones tomográficas.

Comience asegurándose de que los contenedores de nitrógeno líquido estén llenos y verifique que la temperatura del portaobjetos de la muestra y del dispositivo de transferencia de rejillas esté por debajo de 100 kelvin. Confirme que el microscopio electrónico esté bien alineado adquiriendo una imagen de una rejilla de prueba y comprobando la calidad de los anillos de tamales; los anillos deben ser redondos y extenderse hasta el borde de la imagen. A continuación, inserte una rejilla con mitocondrias congeladas hidratadas.

Luego, en modo de búsqueda, localice áreas con espesor de hielo y calidad de espécimen adecuados. Tome una imagen de búsqueda de seis segundos de las áreas prometedoras para determinar su idoneidad para la recopilación de datos. Tras localizar un área de espécimen adecuada, incline la platina ±60 grados para determinar el rango máximo de inclinación disponible sin que las barras de la rejilla u hielo cristalizado en un orificio cercano lleno de hielo de apariencia similar obstruyan el área de exposición o enfoque; cambie al modo de exposición y ajuste la intensidad del haz o el tiempo de adquisición de la imagen.

Por lo tanto, cada imagen registrada tiene una dosis de electrones de 30 a 50 electrones por píxel para CCD o de seis a ocho electrones por píxel por segundo. Para detectores electrónicos directos, calcule la relación de distribución de dosis o I cero sobre I 60 dividiendo el recuento promedio de electrones de una imagen de un segundo adquirida a cero grados por el de una imagen de 60 grados sobre un orificio vacío. Adquiera una imagen de un segundo en modo de exposición y anote el recuento de electrones por angstrom cuadrado.

Teniendo en cuenta la relación de distribución de la dosis, calcule el número total de imágenes y el intervalo de inclinación que pueden registrarse para una dosis total específica de electrones utilizando un software adecuado de recopilación automática de datos. Configure y registre un Tom Agram con los parámetros recién determinados, típicos de los tomos. Para estas muestras, comience en más o menos 20 grados y pase por cero grados antes de alcanzar altas inclinaciones.

Para crear y segmentar tomogramas, convierta la serie de inclinación a un formato de archivo adecuado para el software de reconstrucción. Utilizando un programa de reconstrucción Tom Graham como Imod, alinee las imágenes marcando la posición de los marcadores fiduciales de oro. Una vez alineadas, genere un tomograma Tom Graham.

Mejore el contraste del tomografía de Graham mediante el uso de un filtro de imagen, como el filtro de difusión anisotrópica no lineal distribuido con IM o, para visualización. Utilice programas disponibles comercialmente para segmentar manualmente la tomografía. Asigne vóxeles correspondientes a la membrana interna y externa a capas separadas; una vez asignados, cree una superficie para visualizar las membranas.

Utilizando la opción de clic en el complemento del paquete EM para emira, marque la ubicación de partículas de sintasa TP usando las partículas marcadas como entrada y un paquete de software adecuado, como la estimación de partículas. Para el programa de tomografía electrónica, calcule un promedio de agrado para una estimación de resolución. Calcule la correlación del cascarón focal entre dos promedios de subtomos determinados independientemente utilizando el programa gratuito de visualización.

Chimera ajusta manualmente las estructuras de rayos X conocidas dentro del promedio de subtomografía Agram y luego automáticamente con el comando fit, como se observa en esta figura. La segmentación manual de las membranas en una crio-micrografía electrónica mitocondrial revela la estructura de las crestas en una mitocondria. Mediante el análisis de imágenes de mitocondrias provenientes de cepas de levadura con deleciones génicas que carecen de ciertas proteínas, puede evaluarse el efecto de estas proteínas sobre la morfología de las crestas.

Se muestra aquí una mitocondria de una cepa de levadura que carece de la subunidad E de la síntesis de TP, que es necesaria para la formación de dímeros de la sintetasa de TP. A diferencia de las crestas típicas de las mitocondrias de tipo salvaje, estos orgánulos contienen en cambio una serie de estructuras de la membrana interna que carecen de crestas o presentan invaginaciones membranosas pequeñas con forma de globo. En imágenes con buen contraste, los dímeros de la sintetasa de TP son fácilmente visibles, como se indica aquí mediante las puntas de flecha amarillas.

Al segmentar las membranas, puede visualizarse la ubicación de la síntesis de ATP, representada ahora por la esfera amarilla, en relación con la morfología de las crestas mitocondriales. En este caso, la síntesis de ATP forma filas de dímeros a lo largo de los bordes altamente curvados de las crestas mitocondriales. La promediación de subtomogramas permite determinar la estructura de las proteínas con una resolución de cuatro nanómetros o mejor. Al ajustar estructuras conocidas por rayos X dentro del promedio de subtomogramas, pueden ensamblarse modelos atómicos de complejos proteicos en su entorno nativo, tal como se observa.

En este ejemplo, los volúmenes promedio pueden colocarse nuevamente en el Tomo Graham para ayudar a la organización de complejos individuales entre sí y respecto a otros complejos proteicos en la membrana. Nuestro protocolo demuestra cómo puede utilizar la tomografía crioelectrónica para determinar la estructura y organización de complejos proteicos dentro de la membrana mitocondrial interna. Este protocolo también puede utilizarse para determinar la estructura y organización de otras proteínas asociadas a membranas dentro de diferentes compartimentos celulares.

La preparación de la muestra es clave para obtener buenos termogramas. La rejilla hidratada congelada debe contener ojos perfectamente vítreos de un grosor entre 70 y 150 nanómetros. Normalmente se examinan de cinco a seis rejillas hasta encontrar un área con grosor óptimo del hielo y calidad adecuada de la muestra.

Para la recopilación de imágenes, lo mejor es un microscopio electrónico de transmisión de 300 kilovoltios con etapa criogénica dedicada, filtro de energía y cámara con detector directo de electrones, aunque también se podría utilizar un equipo de 200 kilovoltios con etapa criogénica de entrada lateral y una cámara CCD. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar una rejilla criogénica, recopilar una serie de inclinación, reconstruir la tomografía y calcular un promedio subtomográfico.

Estas son las habilidades básicas necesarias para investigar cómo la organización de las proteínas en una célula afecta la capacidad de dicha célula para realizar funciones biológicas, como la síntesis eficiente de ATP. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido y etano líquido puede ser muy peligroso, y que siempre se deben usar gafas de seguridad y guantes.