La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía

El objetivo general de este procedimiento es determinar la estructura y organización de las proteínas mitocondriales en C dos. Esto se logra generando primero una rejilla de microscopio electrónico hidratado congelado que contiene la muestra. A continuación, se registra una serie de inclinación limitada de la muestra en un criomicroscopio electrónico.

A continuación, se procesa la serie de inclinación para generar un volumen tomográfico. Finalmente, se promedian las densidades de las proteínas para determinar la estructura de las proteínas y se segmentan las membranas para revelar su estructura 3D. Al reposicionar los promedios de las proteínas en el Tom Grahams, se revela la estructura y organización de las proteínas en la membrana.

Así que hacemos tomografía de llanto electrónico de las mitocondrias porque queremos entender cómo funcionan a nivel molecular. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos, como la microscopía electrónica de secciones finas de plástico, es que la resolución es mayor. El material no se fija químicamente de ninguna manera y se conservan los detalles moleculares de las proteínas.

La técnica de la critografía electrónica puede llevar algún tiempo dominarla, pero los usuarios experimentados pueden adquirir de cinco a seis bases TOM de buena calidad por sesión. La parte más difícil del procedimiento es producir rejillas hidratadas congeladas de espesor de hielo óptimo Después de aislar y peletizar las mitocondrias, de acuerdo con el protocolo de texto, use 250 milimolares T triosas en un tampón HEPA de 10 milimolares para volver a suspender el pellet a una concentración de aproximadamente cinco miligramos por mililitro de descarga total de proteína. Las rejillas EM totalmente de carbono con el lado del carbono hacia arriba en un dispositivo de vacío de acuerdo con las instrucciones del fabricante, licúan unos pocos mililitros de etano dirigiendo una corriente de gas etano hacia el lado interior de un contenedor de aluminio enfriado con nitrógeno líquido.

Use un par de pinzas para recoger una rejilla DM de descarga incandescente y colóquela en el banco mezcle proteínas, una suspensión fiducial de oro conjugado, uno a uno con la suspensión mitocondrial, e inmediatamente aplique tres microlitros de la solución a la rejilla. A continuación, coloque las pinzas en un dispositivo de vitrificación, como una guillotina casera con una cuña de papel de filtro, seque el exceso de líquido de la rejilla y suelte el gatillo para sumergir inmediatamente la rejilla en etano líquido. A continuación, transfiera la rejilla de etano líquido a nitrógeno líquido.

Retire el exceso de etano de la rejilla colocando la punta de una cuña de papel de filtro nuevo en el etano líquido. A medida que el líquido sube, arrastre suavemente la rejilla hacia arriba por el papel de filtro, manteniéndola por debajo del frente del líquido, y luego transfiéralo inmediatamente a nitrógeno líquido para almacenarlo para su uso posterior. Coloque la rejilla en una caja de rejilla y guárdela en un hacedor lleno de nitrógeno líquido para registrar una serie de inclinaciones tomográficas.

Comience asegurándose de que los hacedores de nitrógeno líquido estén llenos y verifique que la temperatura de la etapa de muestra y el dispositivo de transferencia de rejilla estén por debajo de 100 kelvin. Confirme que el microscopio electrónico está bien alineado adquiriendo una imagen de una cuadrícula de prueba y verificando la calidad de los anillos de espina, aunque los anillos deben ser redondos y extenderse hasta el borde de la imagen. A continuación, inserte una rejilla con mitocondrias hidratadas congeladas.

Luego, en el modo de búsqueda, busque áreas de espesor de hielo y calidad de muestra adecuados. Tome una imagen de búsqueda de seis segundos de áreas prometedoras para determinar la idoneidad para la recopilación de datos. Después de ubicar una buena área de muestra, incline la platina más o menos 60 grados para determinar el rango de inclinación máximo que está disponible sin obstrucción del área de exposición o enfoque mediante barras de cuadrícula o cristales de hielo en un agujero cercano lleno de hielo de apariencia similar, cambie al modo de exposición y ajuste la intensidad del haz o el tiempo de adquisición de la imagen.

Por lo tanto, cada imagen grabada tiene una dosis de electrones de 30 a 50 electrones por píxel para CCD o de seis a ocho electrones por píxel por segundo. Para detectores directos de electrones, calcule la relación de distribución de dosis o I cero sobre I 60 dividiendo el recuento promedio de electrones para una imagen de un segundo adquirida a cero grados por el de una imagen de 60 grados sobre un agujero vacío. Adquiera una imagen de un segundo en modo de exposición y observe el recuento de electrones por angstrom al cuadrado.

Teniendo en cuenta la relación de distribución de la dosis, calcule el número total de imágenes y el intervalo de inclinación que se pueden registrar para una dosis total de electrones específica utilizando un software de recopilación de datos automático adecuado. Configura y graba un Tom Agram con los parámetros que se acaban de determinar como tomos típicos. Para estas muestras, comience a más o menos 20 grados y pase por cero grados antes de alcanzar inclinaciones altas.

Para crear y segmentar tomos, convierta la serie de inclinación a un formato de archivo adecuado para el software de reconstrucción. Usando un programa de reconstrucción de Tom Graham como Im mod, alinee las imágenes marcando la posición de los marcadores fiduciales de oro. Una vez alineado, genera un Tommo Graham.

Mejore el contraste del tommo Graham mediante el uso de un filtro de imagen como el filtro de difusión no lineal e isotrópico distribuido con IM o para la visualización. Utilice los programas disponibles en el mercado para segmentar manualmente el Tom. Asigne vóxeles correspondientes a la membrana interna y externa para separar las capas una vez asignadas, cree una superficie para visualizar las membranas.

Usando la opción clicker en el plugin del paquete EM para emira, marque la ubicación de una partícula de sintasa TP usando las partículas marcadas como entrada y un paquete de software apropiado, como la estimación de partículas. Para el programa de tomografía electrónica, calcule un promedio de agram para una estimación de resolución. Calcule la correlación de la carcasa del vestíbulo entre dos medias sub tommo determinadas de forma independiente utilizando el programa de visualización libre.

Las quimeras ajustan las estructuras de rayos X conocidas en el promedio sub Tom Agram primero manualmente, luego automáticamente con el comando de ajuste Como se ve en esta figura, la segmentación manual de las membranas en un grito de electrones mitocondrial revela la estructura de los Christi en una mitocondria. Mediante la obtención de imágenes de las mitocondrias de las cepas de levadura que carecen de ciertas proteínas. Se puede evaluar el efecto de estas proteínas sobre la morfología Christi.

Aquí se muestra una mitocondria de una cepa de levadura que carece de una subunidad E de síntesis de TP, que es necesaria para la formación de dímeros de síntesis TP. A diferencia del Lala Christi normal de las mitocondrias de tipo salvaje, estos orgánulos contienen una serie de estructuras de membrana interna que están desprovistas de Christi o contienen pequeñas invaginaciones de membrana en forma de globo. En Ingramas con buen contraste, los dímeros de A TP Synthes son fácilmente visibles, como lo indican aquí las puntas de flecha amarillas.

Al segmentar las membranas, se puede visualizar la ubicación de la síntesis de A TP ahora representada por la esfera amarilla en relación con la morfología de Christi. En este caso, la síntesis de A TP forma filas de dímeros a lo largo de los bordes altamente curvados del Lo Meer Christi Sub tommo averaging permite determinar las estructuras de las proteínas a resoluciones de cuatro nanómetros o mejores. Al encajar las estructuras de rayos X conocidas en el subtomo de Graham, se pueden ensamblar modelos atómicos promedio de complejos de proteínas en su entorno nativo, como se ve.

En este ejemplo, los volúmenes promedio se pueden colocar de nuevo en el Tomo Graham para ayudar a la organización de complejos individuales entre sí y con otros complejos de proteínas en la membrana. Nuestro protocolo demuestra cómo se puede utilizar la criotomografía electrónica para determinar la estructura y organización de los complejos de proteínas dentro de la membrana mitocondrial interna. Este protocolo también se puede utilizar para determinar la estructura y organización de otras proteínas unidas a la membrana dentro de diferentes compartimentos celulares.

La preparación de la muestra es la clave para adquirir buenos termogramas. La rejilla hidratada congelada debe contener ojos perfectamente vítreos de 70 a 150 nanómetros de grosor. Normalmente, cribamos de cinco a seis rejillas hasta que encuentre un área de espesor de hielo y calidad de muestra óptimos.

Para la recolección de gramos, lo mejor es un microscopio electrónico de transmisión de 300 kilovoltios con etapa criogénica dedicada y filtro de energía y cámara con detector directo de electrones, pero también se podría usar un instrumento de 200 kilovoltios con etapa criogénica de entrada lateral y una cámara CCD. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo preparar una rejilla de llanto. Recopile una serie de inclinación, reconstruya el termograma y calcule un promedio sub tommo.

Estas son las habilidades básicas necesarias para investigar cómo la organización de las proteínas en una célula afecta la capacidad de esa célula para realizar funciones biológicas, como la síntesis eficiente de A TP. No olvide que trabajar con nitrógeno líquido y Ethan líquido puede ser muy peligroso y se deben usar gafas de seguridad y guantes en todo momento.